本发明涉及生物传感器技术领域，尤其是涉及一种用于冷冻条件下标记癌细胞的点亮型荧光化合物及其制备方法和应用。
背景技术
在癌症治疗中，手术切除是其中最常用的方法，此方法主要依赖于医生的从业经验，医生常常需要通过触摸的手感或者肉眼观察肿块来判断是否进行切除，但当面对多灶的具有有限切除可能性及血管浸润的一些患者，手术切除其实并不是一个最好的方法，而且不能完全保证切除掉全部病变部位。所以，科学家开始探索其他的办法使癌症或肿块自我坏死。
冷冻术的开始可追溯到19世纪前，arnottj首次描述局部冷冻治疗的优点，并认为这是一种可以治愈疾病早期阶段的癌细胞、延长生命的手段。冷冻手术最早可用于治疗皮肤相关病变，妇科病变或其他神经类的疾病。冷冻治疗主要依赖细胞内外空间冰晶的形成。当温度冷却至冰点的时候，冰晶首先形成在细胞外空间。细胞外的冰晶形成会从细胞外提取水分，从而创造了一个高渗环境，细胞脱水。随着这个持续的过程，冰晶生长同时细胞脱水，会导致膜和酶进一步受到损坏。随着长时间的冷却，细胞内会形成冰晶。在温度约-7℃到-10℃时，细胞膜就会形成冰晶屏障。在-15℃时候细胞内就会产生冰晶体，在-40℃的时候这些冰晶都转化为冰。从机制上来看，细胞内的冰晶会破坏细胞膜并且损伤到重要的细胞结构。这种胞内冰晶的产生会伴随着快速的冻结率而形成。但直接细胞损伤则发生在冻融过程，当冰冻组织的温度超过-40℃，尤其是在-20℃和-25℃之间，冰晶体将会融合为一个大晶体，从而产生对细胞结构的损害。此外，伴随冰晶的融化，细胞外空间成为低渗状态，水分就会进入到受损细胞，细胞膜因此破裂。
要达到完全的癌症肿块破坏，就必须在肿块边界处适当的安全边界以外进行冻融。以肝癌为例，在一般情况下，对于肝癌5-10mm的距离是可以接受的。为获得理想的安全边界，冷冻探针的精确放置是必不可少的。
常用于细胞领域的荧光探针(如hochest33258，dapi，pi等)，都存在细胞毒性大，需多次洗涤才能达到良好成像效果，同时光稳定性差、低温易聚集导致荧光猝灭、不能靶向癌细胞等缺点的存在，为保持在-40℃的有效温度下，并不适合于长时间的照射及冷冻的条件。所以，研发一种可以在低温冷冻条件下对癌细胞精准标记的荧光探针成为了迫切需要。
2001年，唐本忠课题组报道了“聚集诱导发光(aie)”现象，由于其独特的发光原理及效果，aie分子常常可以达到比传统染料更好的光稳定性，更低的细胞毒性的效果，常常被应用于细胞及细胞器的标记，或利用荧光变化检测细胞的新陈代谢等，但都针对常温的层面，截止到目前，并没有一例aie分子可适用于冷冻条件下的癌细胞标记。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种用于冷冻条件下标记癌细胞的点亮型荧光化合物，以解决现有技术中对癌细胞标记的荧光探针无法针在低温冷冻条件下对癌细胞精准标记的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种用于冷冻条件下标记癌细胞的点亮型荧光化合物的制备方法，所述制备方法操作简便。
本发明的第三目的在于提供一种所述用于标记癌细胞的荧光化合物的应用，所述荧光试剂在冷冻条件下可瞬间“点亮”癌细胞，使其区分于正常细胞。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
用于标记癌细胞的点亮型荧光化合物，其结构式如下：
其中r选自(ch2)n，所述n选自1-10之间的整数。
优选的，所述n选自1-5之间的整数。更优选的，所述n选自1、2或者3。
本发明提供了新型化合物tabd-py-n，所述化合物tabd-py-n对癌细胞具有选择性靶向作用，与癌细胞和正常细胞共培养，能够有效区分癌细胞和正常细胞，两种细胞混合培养后也可靶向“点亮”癌细胞；并且在冷冻的条件下，能够瞬间“点亮”癌细胞，使其区分于正常细胞，快捷方便。
本发明还提供了一种所述用于标记癌细胞的点亮型荧光化合物的制备方法，包括如下步骤：
化合物a溶解于二甲基醇胺类化合物中，加入碱性化合物，于50-90℃条件下反应6-24h，收集沉淀；
其中，所述化合物a的结构式如下：
优选的，所述反应的温度为70±5℃，所述反应的时间为12±2h。
优选的，所述二甲基醇胺类化合物包括二甲基乙醇胺。更优选的，所述化合物a与二甲基乙醇胺的摩尔比为1﹕(20-40)，优选1﹕(25-35)，更优选为1﹕30。
优选的，所述碱性化合物包括氢氧化钠固体。
优选的，所述碱性化合物的加入量占化合物a的质量的2-5％，优选为3.3％。
优选的，所述化合物a的合成路线如下：
优选的，所述化合物a的合成路线中，反应温度为70-80℃，反应时间为18-30h。
优选的，所述化合物a1、4-吡啶苯硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钾的质量比为1﹕(0.6-0.7)﹕(0.1-0.2)﹕(1.5-2)。
优选的，所述甲苯和甲醇的体积比为(2-4)﹕1。
本发明还提供了一种所述荧光化合物在标记癌细胞中的应用。
优选的，所述荧光化合物在冷冻条件下标记癌细胞。
优选的，所述冷冻条件包括：冷冻温度为0～-80℃，优选为0～-40℃，优选为-20～-40℃。
优选的，所述荧光化合物在冷冻条件下标记癌细胞的方法包括如下步骤：
将所述荧光化合物溶解于良溶剂中，与癌细胞共培养，于0～-80℃条件下标记癌细胞。
优选的，所述癌细胞包括hela细胞、hepg2细胞、a549细胞和mcf-7细胞中的任一种。
优选的，与癌细胞共培养的荧光化合物的浓度为10-6-10-4mol/l，优选为10-5mol/l。
优选的，所述培养的方法包括：于37℃，体积分数为5％的co2培养箱中培养10-30min。
优选的，与癌细胞共培养后，梯度降温至0～-80℃。更优选的，所述梯度降温的速率为2-10℃/min。
优选的，所述良溶剂包括二甲基亚砜。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明合成了一种新化合物，其在良溶剂中处于分散状态，作为荧光探针进入细胞后，受细胞微环境的影响，产生较弱的荧光信号；在冷冻条件下，细胞内结冰，分子内旋转受限，非辐射能量转移收到抑制，荧光信号显著增强，从而对细胞进行标记；
(2)本发明所述的荧光化合物可用于标记癌细胞，并且对癌细胞具有选择性靶向作用，当癌细胞和正常细胞在相同条件下培养及共混培养后，能够有效区分癌细胞和正常细胞；
(3)本发明所述的荧光试剂的制备方法简单，使用时操作方便，无需多次清洗，可直接用于在冷冻条件下的癌细胞的标记；
(4)本发明所述的荧光化合物，在冷冻的条件下，能够瞬间“点亮”癌细胞，使其区分于正常细胞，快捷方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为将本发明实施例1提供的同浓度的荧光试剂分别加入到hela细胞和nih3t3细胞中分别于相同条件下共培养后的荧光共聚焦显微镜成像图，其中左侧为荧光场-蓝色，右侧为明场；
图2为将本发明实施例1提供的同浓度的荧光试剂分别加入到hela细胞和nih3t3细胞中分别于相同条件下共培养后，以2℃/min梯度降温至-40℃保留使细胞结冰后的荧光共聚焦显微镜成像图，其中左侧为荧光场-蓝色，右侧为明场；
图3为将本发明实施例1的荧光试剂分别与hela细胞和nih3t3细胞于相同条件下共培养后，hela细胞和nih3t3细胞分别对荧光试剂的吞噬率；
图4为将本发明实施例1的荧光试剂与hela细胞共培养24h、48h和72h的细胞毒性数据；
图5为将本发明实施例1的荧光试剂和商用中性红细胞核染料共同与细胞共培养后，以2℃/min梯度降温至-40℃保留使细胞结冰前和结冰后的荧光共聚焦显微镜成像图，其中左侧为荧光场-蓝色，中间为荧光场-红色，右侧为明场；
图6为将hoechst33258染料与hela细胞共培养后，以2℃/min梯度降温至-40℃保留使细胞结冰前和结冰后的荧光共聚焦显微镜成像图，其中左侧为荧光场-红色，右侧为明场；
图7为将lysotrackerred染料与hela细胞共培养后，以2℃/min梯度降温至-40℃保留使细胞结冰前和结冰后的荧光共聚焦显微镜成像图，其中左侧为荧光场-红色，右侧为明场；
图8为mitotrackerred染料与hela细胞共培养后，以2℃/min梯度降温至-40℃保留使细胞结冰前和结冰后的荧光共聚焦显微镜成像图，其中左侧为荧光场-红色，右侧为明场；
图9为将本发明实施例1的荧光试剂和几种商用染料与细胞共培养后，以2℃/min梯度降温至-40℃保留使细胞结冰后，结冰前后的荧光强度；
图10为将hela细胞以不同冷却速率降温至-40℃后，室温融化后mts测试细胞存活率数据；
图11为将hela细胞和nih3t3细胞混合培养后，以5℃/min梯度降温至-40℃保留，三次冷冻后使细胞结冰后的荧光共聚焦显微镜成像图；其中(a)、(b)、(c)和(d)分别为共培养后成像图、一次冷冻后的成像图；二次冷冻后的成像图和三次冷冻后的成像图；
图12为将hela细胞和nih3t3细胞混合培养后，以5℃/min梯度降温至-40℃保留，三次冷冻融化后的细胞存活率。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明涉及的部分试剂和仪器信息如下：
试剂：
甲醇：纯度，分析纯；试剂公司，北京化学试剂公司；
甲苯：纯度，分析纯；试剂公司，北京化学试剂公司；
二氯甲烷：纯度，分析纯；试剂公司，北京化学试剂公司；
二甲基乙醇胺：纯度，99％；试剂公司，百灵威试剂有限公司；
氢氧化钠：纯度，99％；试剂公司，北京化学试剂公司；
高糖培养液：试剂公司，cellgro；
磷酸盐缓冲液：试剂公司，cellgro；
二甲基亚砜：纯度，生物级；试剂公司，cellgro；
annexinv-fitckit：试剂公司，miltenyibiotechnology；
0.25％trypsin：试剂公司，corning；
honchest33258：试剂公司，碧云天生物技术公司；
mitotrackerred：试剂公司，thermofisherscientific；
lysotrackerred：试剂公司，thermofisherscientific；
中性红核染料：试剂公司，碧云天生物技术公司；
hela细胞，nih3t3细胞均购自国家实验细胞资源共享平台。
仪器：
核磁共振波谱仪：型号，mercury-plus400；厂商：美国varian公司；
紫外光谱：型号，tu-1901；厂商：北京普析通用仪器公司；
荧光共聚焦显微镜：型号，airone；厂商：尼康仪器有限公司；
流式细胞仪：型号，fc500mcl，厂商：贝克曼(beckman)库尔特商贸公司；
酶联免疫测试仪：型号，model680；厂商：bio-rad。
本发明提供了一种用于标记癌细胞的点亮型荧光化合物，其结构式如下：
其中r选自(ch2)n，所述n选自1-10之间的整数。
在本发明一优选实施方式中，所述n选自1-5之间的整数。更优选的，所述n选自1、2或者3。
本发明提供了新型化合物，所述化合物对癌细胞具有选择性靶向作用，当癌细胞和正常细胞在相同条件下培养及混合培养后，能够有效区分癌细胞和正常细胞；并且在冷冻的条件下，能够瞬间“点亮”癌细胞，使其区分于正常细胞，快捷方便。
本发明还提供了一种所述用于标记癌细胞的点亮型荧光化合物的制备方法，包括如下步骤：
化合物a溶解于二甲基醇胺类化合物中，加入碱性化合物，于50-90℃条件下反应6-24h，收集沉淀；
其中，所述化合物a的结构式如下：
在本发明一优选实施方式中，所述反应的温度为70±5℃，所述反应的时间为12±2h。
在本发明一优选实施方式中，所述二甲基醇胺类化合物包括二甲基乙醇胺。优选的，所述化合物a与二甲基乙醇胺的摩尔比为1﹕(20-40)，优选1﹕(25-35)，更优选为1﹕30。
在本发明一优选实施方式中，所述碱性化合物包括氢氧化钠固体。
在本发明一优选实施方式中，所述碱性化合物的加入量占化合物a的质量的2-5％。
在本发明一优选实施方式中，所述化合物a的合成路线如下：
在本发明一优选实施方式中，所述化合物a的合成路线中，反应温度为70-80℃，反应时间为18-30h。
在本发明一优选实施方式中，所述化合物a1、4-吡啶苯硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钾的质量比为1﹕(0.6-0.7)﹕(0.1-0.2)﹕(1.5-2)。
在本发明一优选实施方式中，所述甲苯和甲醇的体积比为(2-4)﹕1。
本发明还提供了一种所述荧光化合物在标记癌细胞中的应用。
在本发明一优选实施方式中，所述荧光化合物在冷冻条件下标记癌细胞。
在本发明一优选实施方式中，所述冷冻条件包括：冷冻温度为0～-80℃，优选为0～-40℃，优选为-20～-40℃。
在本发明一优选实施方式中，所述荧光化合物在冷冻条件下标记癌细胞的方法包括如下步骤：
将所述荧光化合物溶解于良溶剂中，与癌细胞共培养，于0～-80℃条件下标记癌细胞。
在本发明一优选实施方式中，所述癌细胞包括hela细胞、hepg2细胞、a549细胞和mcf-7细胞中的任一种。本发明实施例中以hela细胞为例进行说明，所述化合物对其具有选择性靶向作用，对于其它的癌细胞，由于所述化合物对癌细胞的微环境具有选择性靶向作用，同样适用。
在本发明一优选实施方式中，与癌细胞共培养的荧光化合物的浓度为10-6-10-4mol/l，优选为10-5mol/l。
在本发明一优选实施方式中，所述培养的方法包括：于37℃，体积分数为5％的co2培养箱中培养10-30min。
在本发明一优选实施方式中，与癌细胞共培养后，梯度降温至0～-80℃。更优选的，所述梯度降温的速率为2-10℃/min。
在本发明一优选实施方式中，所述良溶剂包括二甲基亚砜。
实施例1
本实施例所述的用于标记癌细胞的点亮型荧光化合物tabd-py-n的制备方法如下：
(1)将(1z，3z)-1，4-二(4-甲氧羰基)苯基-1，4-二溴-1，3-丁二烯(化合物a1)100mg、4-吡啶苯硼酸63.7mg、四(三苯基膦)钯11.9mg和碳酸钾168.9mg溶解于120ml的体积比为3﹕1的甲苯和甲醇的混合溶剂中，在氮气保护条件下，加热至70-80℃反应24h，以体积比为20﹕1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液为洗脱剂，采用柱层析分离得到黄色固体粉末，即为化合物a；
(2)将100mg的化合物a溶解于0.9ml的二甲基乙醇胺中，加入5mg的氢氧化钠粉末，于氮气保护条件下在70℃反应12h，过滤得到的白色沉淀即为所述荧光化合物tabd-py-n，产率为85％。
所述荧光化合物tabd-py-n的核磁数据如下：
1h-nmr(400mhz，d2o)δ(ppm)：2.16(s，6h)，2.45(s，2h)，3.61(s，2h)，6.52(s，2h)，6.79-6.92(m，8h)，7.54(d，4h)，8.31(s，4h)。
13c-nmr(400mhz，d2o)δ(ppm)：174.51，148.81，147.67，142.15，142.07，135.96，129.09，127.08，126.26，125.72，59.54，58.46，44.02。
实施例2
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于，所述步骤(2)中，反应温度为50℃，反应时间为24h。
实施例3
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于，所述步骤(2)中，反应温度为90℃，反应时间为6h。
实施例4
本实施例提供了一种所述用于标记癌细胞的点亮型荧光化合物用于标记癌细胞的方法，步骤如下：
(1)以实施例1制备得到的荧光化合物tabd-py-n为例，取荧光化合物tabd-py-n5.41mg溶解于10ml的生物级二甲基亚砜中，配制成浓度为1×10-3mol/l的tabd-py-n母液1；取2ml母液1加入样品瓶中，再加入18ml的生物级二甲基亚砜，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/l，作为荧光试剂备用。
(2)提前24h将hela细胞种在专用细胞培养的细胞碟上，然后取步骤(1)中制得的0.1ml的浓度为10-4mol/l的荧光试剂，加入盛有1ml培养液的细胞碟中，与细胞共培养15min后，用pbs缓冲溶液清洗1遍，再重新加入高糖培养液，置于荧光共聚焦显微镜下观察。
对照组：参考上述培养方法，区别在于，将hela细胞替换为nih3t3，其余条件不变。
荧光共聚焦显微镜下观察结果如图1所示，其为将本发明实施例1提供的同浓度的荧光试剂分别加入到hela细胞和nih3t3细胞中分别于相同条件下共培养后的荧光共聚焦显微镜成像图。从图中可知，在相同的培养条件和浓度下，hela细胞可以看到明显的蓝色荧光，而在nih3t3细胞中不能，说明了本发明所述的荧光化合物tabd-py-n对hela细胞具有特异性识别作用。
将按照上述条件，将荧光化合物tabd-py-n共培养的hela细胞和nih3t3细胞，吸净表面液体，分别置于荧光共聚焦显微镜下，利用液氮及冷台控制降温速度为2℃/min，使hela细胞和nih3t3细胞分别降温至-40℃，并进行原位实时拍摄。从图2中可知，当hela细胞冷冻至-40℃，细胞内结冰时，荧光化合物tabd-py-n在细胞内的发光强度急剧增加；而当nih3t3细胞冷冻至-40℃，细胞内结冰时，细胞内的荧光强度也有所增加，但因其在室温下的荧光强度较低，因而，增加倍数不多。说明了本发明所述的荧光化合物tabd-py-n可在冷冻条件下标记癌细胞。
实验例1
为了对比说明本发明制备得到的荧光化合物tabd-py-n对细胞特异性识别的原因，进行以下实验测试：
提前24h将hela细胞和nih3t3细胞分别种在专用细胞培养的细胞瓶上，细胞数量相当，然后取1ml的浓度为10-4mol/l的tabd-py-n荧光试剂，分别加入每瓶盛有9ml培养液的细胞瓶中，与细胞共培养15min后，取出培养液并测定紫外吸光度，测试结果如图3所示。
从图3中可知，相同共培养浓度和相同培养条件下，tabd-py-n荧光试剂进入hela细胞的百分比为31.2％，而进入nih3t3细胞的百分比为8.9％，由此可以看出，tabd-py-n荧光试剂可以选择性的更多进入到hela细胞中，即所述tabd-py-n荧光试剂在癌细胞和正常细胞中对癌细胞具有特异性识别作用。其中，图3中的控制组，是指没有加入细胞作为对照的组别。
实验例2
为了说明本发明制备得到的荧光化合物具有优异的性能，对其细胞毒性进行测试，测试方法如下：
提前96h将hela细胞种在专用细胞培养的细胞瓶上，细胞数量相当，然后分别在实验前的72h/48h和24h取1ml的浓度为10-4mol/l的tabd-py-n荧光化合物，分别加入每瓶盛有9ml培养液的细胞瓶中，与细胞共培养。用胰酶使细胞消化后，用pbs缓冲液离心洗涤两遍，然后加入商用流式细胞试剂盒进行双染，测试结果如图4所示。
从图4中可知，在经过72h的细胞共培养之后，细胞的存活率仍在95％以上，没有明显凋亡，说明了本发明制备得到的荧光化合物tabd-py-n在细胞中无细胞毒性。其中，图4中的控制组，是指没有加入荧光化合物，将细胞培养72h的细胞存活率。
实验例3
为了进一步对比说明本发明制备得到的荧光化合物tabd-py-n和现有技术中的商业染料的区别，以中性红商业染料与本发明的荧光化合物tabd-py-n进行对比实验，具体操作如下：
提前24h将hela细胞种在专用细胞培养的细胞碟上，然后取1ml中性红商业染料于细胞碟上与细胞共培养15min，然后用pbs缓冲溶液冲洗几次直至背景干净，然后取0.1ml的浓度为10-4mol/l的tabd-py-n的荧光试剂，加入盛有前述培养有中性红商业染料的0.9ml培养液的细胞碟中，与细胞共培养15min后，用pbs缓冲溶液清洗1遍，吸净表面液体，置于荧光共聚焦显微镜下观察。利用液氮及冷台控制降温速度为2℃/min，使hela细胞降温至-40℃，并进行原位实时拍摄。
从图5中可知，左侧的荧光场为蓝色，归属于tabd-py-n，中间的荧光场为红色，归属于中性红商业染料，在0℃条件下，可明显观察到两部分的荧光，当降温至-40℃时，细胞内结冰，中性红商业染料发生荧光猝灭现象，而tabd-py-n荧光化合物的荧光强度急剧增加，这是由于本发明制备得到的tabd-py-n荧光化合物的聚集诱导发光特性所致。说明了本发明制备得到的tabd-py-n荧光化合物可用于在冷冻条件下标记癌细胞。
为了进一步对比本发明制备得到的tabd-py-n荧光化合物和其它多种商业染料在冷冻条件下的标记效果，进行如下测试：
提前24h将hela细胞种在专用细胞培养的细胞碟上，然后将honchest33258，lysotrackerred，mitotrackerred三种染料按照说明书的方法对细胞进行染色，用pbs溶液清洗降低背景荧光后，洗净表面液体，置于荧光共聚焦显微镜下观察，利用液氮及冷台控制降温速度为2℃/min，使hela细胞降温至-40℃，并进行原位实时拍摄，如图6-8所示，三种商业染料在-40℃条件下，细胞结冰时，发生荧光猝灭现象，即在冷冻条件下不可以实时标记癌细胞；并且，各商业染料无细胞选择性，不可能实现在冷冻条件下对癌细胞的选择性靶向，不适合作为冷冻条件下用于癌细胞的荧光探针，这可能是因为商业染料的光漂白性差，且当冷冻条件下，细胞内结冰后，商业染料分子聚集导致猝灭造成的。
本发明进一步取图5-8的荧光共聚焦显微镜照片中细胞内的荧光强度值，对结冰前后的荧光强度进行对比，如图9所示，从图中可明显看出，除了tabd-py-n探针呈现结冰后荧光增强的效果外，其它商业染料分子均呈现结冰导致猝灭的现象。由此可知，商业染料因为其光漂白性差及聚集诱导猝灭等分子特性，并不适用与低温或冷冻条件下的细胞成；但tabd-py-n荧光试剂却可以在冷冻条件下，因为分子旋转受限产生更强的荧光，可在冷冻条件下用于癌细胞的荧光标记探针。
实验例4
为了进一步说明本发明所述荧光化合物可用于冷冻条件下对癌细胞的标记识别作用的应用前景，对冷冻处理后的细胞的存活率进行测定，测试方法如下：
提前24h将hela细胞种在专用细胞培养的96孔板上，分别按照2℃/min、5℃/min和10℃/min的降温速率，冷冻细胞至-40℃，并保留5min，然后将mts专用试剂0.5ml加入到培养细胞的96孔板中，进行测试，测试结果如图10所示。
从图中可知，用不同冷却温度处理细胞后，经过一个冷冻和融化的过程中，细胞的死亡率在90％以上，证明这种冷冻条件处理细胞的方法可以有效使癌细胞死亡。
实验例5
为了进一步说明本发明所述荧光化合物可用于实际中冷冻条件下对癌细胞的标记识别作用的应用前景，将hela细胞和nih3t3细胞进行混合培养，多次冻融，具体步骤如下：
提前24h将hela细胞及nih3t3细胞种在专用细胞培养的细胞碟上，然后取0.1ml的浓度为10-4mol/l的tabd-py-n的荧光试剂，加入盛有1ml培养液的细胞碟中，与细胞共培养15min后，用pbs缓冲溶液清洗1遍，再重新加入高糖培养液，置于荧光共聚焦显微镜下观察。
从图11(a)中可知，在两种细胞共培养下，hela细胞可以看到明显的蓝色荧光，而在nih3t3细胞中则有微弱荧光，说明了本发明所述的荧光化合物tabd-py-n对hela细胞具有特异性识别作用。
将按照上述条件，将与荧光化合物tabd-py-n培养的hela细胞和nih3t3细胞，吸净表面液体，置于荧光共聚焦显微镜下，利用液氮及冷台控制降温速度为5℃/min，使hela细胞和nih3t3细胞分别降温至-40℃，并进行原位实时拍摄。从图11(b)中可知，当两种细胞混合培养下，冷冻至-40℃，细胞内结冰时，荧光化合物tabd-py-n仍然保持在hela细胞内的发光强度急剧增加的特性。
两种细胞共培养后，一次冷冻后的细胞存活率仍在50％左右，对细胞进行三次冻融。如图11(c)和11(d)，在二次冷冻和三次冷冻后，癌细胞亮度仍然远远高于正常细胞。并且，如图12所示，其为上述将hela细胞和nih3t3细胞混合培养后，以5℃/min梯度降温至-40℃保留，三次冷冻融化后通过流式细胞仪测定的细胞存活率，从图中可知，在三次冻融后，癌细胞凋亡率达到80％左右。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。