碳量子点及基于碳量子点的成像剂和荧光探针的制备方法与流程

本发明涉及材料领域，具体是碳量子点及基于碳量子点的成像剂和荧光探针的制备方法。

背景技术

荧光碳量子点，尺寸在10纳米以下，由于其低光漂白性、良好生物相容性、良好的水溶性和极好的细胞膜通透性得到了极大的关注。这些性能使得碳量子点在生物体系中优于有机染料及无机重金属半导体量子点。

通常，碳量子点可由富含碳组分的物质中通过脱水碳化得到。而前驱体的初级结构包含原子组成、连接的化学键都决定了碳量子点的性能。在生物体系中，生物大分子通常倾向于组装成复杂的三维结构来达到不同的生物功能。然而，这种高级结构是否对于碳量子点的合成及性能产生影响还未明确。胶原，作为一种生物体中常见的具有自组装性能的蛋白质，是研究这一体系的最佳模型。五个游离的原胶原分子首先自组装为三螺旋的微纤维。然后，进一步组装为海绵状的三维多孔支架，并通过分子间氢键、静电作用及疏水作用形成多层次等级结构。这些结构在水热法制备碳量子点的过程中将通过超分子间相互作用固定官能团、并紧密堆积基团促进交联反应，进而达到碳量子点交联增强的发射性能。同时由于杂原子的掺杂提高了光稳定性，使得荧光碳量子点可用于生物成像。并且，由于组装达到的官能团的堆叠，达到了对铁离子高度的亲和性。

因此，需要利用生物常见的三维胶原支架为碳源，以符合工业化“自下而上”的大规模生产需求、满足工艺简单且绿色环保的要求制备荧光碳量子点材料，用于考察组装超结构对于碳量子点的性能影响。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供碳量子点及基于碳量子点的成像剂和荧光探针的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明人在研究过程中发现，胶原蛋白的基本结构单位是原胶原分子，原胶原肽链的一级结构具有(gly-x-y)n重复序列，其中x常为脯氨酸，y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸。原胶原是由三条α-肽链组成的纤维状蛋白质，相互拧成三股螺旋状构型，长300nm，直径1.5nm。这种特有的结构使得胶原具有独特的生物活性。组装超结构可以通过堆叠官能团促进量子点的胶联增强发射性能。胶原蛋白中的氮原子、磷原子的杂原子掺杂还可以提升碳量子点的光稳定性。

发明人深入研究发现，用具备组装超结构的三维胶原支架为碳源制备的碳量子点可作为良好的生物成像显色剂，由于组装产生的堆叠官能团对于铁离子的亲和力提高，可作为灵敏性选择性的检测环境中铁离子。与不具备组装结构的原胶原分子碳源做对比，胶原支架产生的碳量子点光稳定性更佳，对铁离子的检测灵敏度更高。

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种具有多层次等级结构的三维胶原组装支架为碳源，以分子组装的机理来探讨碳源对于碳量子点结构和性能的影响。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

1)将碳源与水混合；

2)将步骤1)中所得到的混合物进行碳化处理并收集上清液；

3)将步骤2)中所得到的上清液离心去除沉淀并透析纯化；

4)将步骤3)中所得到的溶液冷冻干燥，获得碳量子点材料。

作为本发明进一步的方案：在步骤1)中，碳源为具有多层级等级结构的三维胶原支架材料或原胶原分子；制得的混合物中，碳源在水中的质量浓度为0.001～25mg/ml。

作为本发明进一步的方案：在步骤2)中，所述碳化处理为水热法、微波法和回流法；其中，水热法使用特氟龙内衬的反应釜控制温度在100～200℃保持0～5小时；微波法使用家用微波炉在低火至高火中保持0～30分钟；回流法使用氢氧化钠溶液在50～120℃下回流1～72小时。

作为本发明进一步的方案：在步骤3)中，采用超纯水透析1～72小时。

发明人发现，三维胶原支架所具备的多层级等级结构可堆叠羧基、氨基等官能团从而促进结构交联，进而产生了碳量子点的交联增强性荧光发射。利用其增强的荧光性能及光稳定性，绿色安全的碳量子点可作为体内、体外成像剂使用。由于小尺寸导致的高细胞膜通透性能够便于碳量子点进出细胞。完全生物来源的前驱体——无论是三维胶原支架还是原胶原分子都保障了材料的安全性和低毒副性。进一步，组装造成官能团堆叠，而羧基、胺基交错区域对于铁离子具有特异性的亲和力。铁离子与碳量子点结合并产生荧光共振能量转移，使得碳量子点的荧光强度随加入铁离子的浓度增加而降低。利用该原理，碳量子点可作为检测铁离子浓度的荧光探针。由于分子组装超结构的引入，由三维胶原支架得到的碳量子点较原胶原分子得到的量子点在检测铁离子方面显现出更高的灵敏度。这种制备方法具有来源广泛、原料易得、简便易行的特点，以水为溶剂，还具有绿色无污染的优点。

碳量子点的制备方法可以分为：自上而下式如弧放电、激光烧蚀、电化学氧化、燃烧/加热等；自下而上式，即对前驱体进行脱水、聚合、碳化、钝化等。通常认为，水热法或微波法是直接有效的一步法碳化各种碳源得到碳量子点的方法。发明人创造性的使用具有多层级等级结构的三维胶原支架作为碳源，以水热法或微波法制备出荧光碳量子点。发明人意外地发现，三维胶原支架的组装结构可有效聚集官能团，并在水热反应或微波加热中促进交联反应的发生，从而导致所产生的碳量子点具备交联增强的性能。与不具备组装结构的原胶原分子为碳源制备出的碳点相比，三维胶原支架制备的碳点具有更高的量子产率，更稳定的荧光发射，和对铁离子检测更高的灵敏度。

一种碳量子点材料，所述碳量子点是通过所述的碳量子点的制备方法获得的。

作为本发明进一步的方案：所述碳量子点具有高度荧光稳定性及生物相容性。

作为本发明进一步的方案：所述碳量子点具有铁离子敏感性和特异性。

一种荧光成像剂的制备方法，包括以下步骤：

a)将碳量子点冻干粉末溶于适量水中，其中，所述碳量子点如上所述；

b)将所述碳量子点溶液加入到细胞环境中，在37℃下培养两小时，以获得荧光成像图。

一种铁离子检测荧光平台的制备方法，包括以下步骤：

a)将碳量子点冻干粉末溶于适量水中，其中，所述碳量子点如上所述；

b)将所述碳量子点溶液加入到含铁离子的溶液中，并孵育二十分钟，以获得荧光变化图谱。

所述的碳量子点材料在成像、传感、医药和电子学中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所提出的制备方法，可通过碳化三维胶原支架材料直接获得发荧光的碳量子点，可通过对原胶原分子的组装实现官能团的堆叠，进而在碳化处理中使得官能团实现碳点的交联增强荧光发射。

该制备过程简便易行，绿色环保，原材料广泛，有利于实现工业化大规模生产，还可通过改变碳源的自组装方式来调控碳量子点的结构和性能。

附图说明

图1为碳量子点i的tem图像以及紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图。

图2为碳量子点ii的tem图像以及紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱图。

图3为碳量子点的红外光谱、表面光电子能谱以及瞬态荧光光谱。

图4为碳量子点的稳定性研究图。

图5为碳量子点的毒性试验研究cck-8模式图。

图6为碳量子点用于细胞成像的荧光图。

图7为碳量子点用于铁离子检测的荧光图谱及荧光强度与铁离子浓度的线性关系图，以及针对铁离子的选择性检测试验。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料及其购买来源：鼠尾i型原胶原溶液(bdbio-sciences)

一般方法

除非明确说明，在下列实施例中采用下述制备方法和检测方法：

碳量子点的制备：首先，先将15mg的三维胶原支架材料加入到10ml去离子水中，待支架材料完全被浸润后将混合物放入到特氟龙内衬的反应釜中加热到180℃保持2小时。或将混合物放置在锥形瓶中并置于微波炉中高火3分钟。或将混合物与5ml氢氧化钠溶液1m共混，在100℃回流2小时。之后将上清液取出，并在12000rpm转速下离心10分钟，去除沉淀后将上清液置于截留分子量为1000da的透析袋中透析48小时。随后冷冻干燥，能够得到碳量子点的粉末；

tem测试条件：型号为日立jem-2100f，加速电压为200kv，取0.1mg/ml的碳量子点水溶液10ul滴加在碳支持膜的铜网上，并与室温下干燥可得透射电镜样品。

紫外-可见光谱测试条件：型号为岛津uv-1800紫外可见分光光度计。

荧光光谱测试条件：型号为岛津rf-5301pc荧光分度计。

红外光谱测试条件：型号为布鲁克ifs66v/s红外光谱仪，在400-4000cm^-1波数范围内采集数据。

表面能谱测试条件：型号为escalabmkiix-射线光电子能谱，以mg为激发源。

实施例1多层级等级结构三维胶原支架为碳源的碳量子点i

在该实施例中，按照与一般方法基本相同的制备方法，制备碳量子点材料i。先将15mg的三维胶原支架材料加入到10ml去离子水中，待支架材料完全被浸润后将混合物放入到特氟龙内衬的反应釜中加热到180℃保持2小时，之后将上清液取出，并在12000rpm转速下离心10分钟，去除沉淀后将上清液置于截留分子量为1000da的透析袋中透析48小时。随后冷冻干燥，能够得到碳量子点i的粉末。

在该实施例中，再按照与一般方法基本相同的测试条件，对碳点i进行测试。

该实施例的tem图和光谱分析图，如图1所示。由图1可看出，在电子显微镜下碳量子点i的粒径大小为1.42±0.3nm，紫外-可见吸收光谱显示碳量子点i在265nm处有一个较强的吸收峰，可以归因于碳核的芳基sp2域的π-π^*转移，吸收峰的尾部从300nm延伸至800nm，可以归因于c＝o的n-π^*转移或碳量子点上的胺基。在紫外光的照射下碳量子点的水溶液可以发出明亮的蓝色荧光。荧光光谱显示碳量子点i具有激发波长依赖的荧光特性，在330nm到420nm的紫外光激发下，碳量子点i的荧光发射峰位置从426nm移动到了490nm处。这是由于碳量子点粒径不均或不同的表面化学导致的发射诱捕态造成的。经测量，由三维胶原支架碳化制得的碳量子点i的量子产率为15％，足以作为高灵敏的荧光传感平台。

实施例2原胶原分子为碳源制备碳量子点ii

在该实施例中，按照与实施例1的制备方法和测试条件，制备原胶原分子为碳源的碳量子点材料，并对其进行测试。区别在于，在该实施例中，将10ml的1.5mg/ml的原胶原溶液放原支架材料加入到特氟龙内衬的反应釜中加热到180℃保持2小时，之后将上清液取出，并在12000rpm转速下离心10分钟，去除沉淀后将上清液置于截留分子量为1000da的透析袋中透析48小时。随后冷冻干燥，能够得到碳量子点ii的粉末。

该实施例的tem图和光谱图，如图2所示。由图2可看出，在电子显微镜下该碳量子点ii的粒径大小为1.36±0.7nm，紫外-可见吸收光谱与三维胶原支架所得的碳量子点i相比，具有相近的吸收峰，但碳量子点i有较为明显的红移，代表碳点i表面钝化和电子的富集。碳量子点ii也具有激发波长依赖的荧光特性，在310nm到400nm的紫外光激发下，碳量子点i的荧光发射峰位置从390nm移动到了460nm处。与碳点i相比，在相同激发波长下荧光发射峰的位置有较为明显的蓝移。在同等质量浓度下，荧光发射峰的强度也比碳点i有了明显的下降。进一步的光谱测量发现，由原胶原溶液碳化制得的碳量子点ii的量子产率为9％。

实施例3碳量子点的光谱研究

组装的结构便于形成功能团的堆叠，促进水热过程中碳量子点内部共价键的形成并达到交联增强发射的效果。图3a显示碳量子点具备多种官能团，图b，c，d的表面光电子能谱分析显示碳量子点具有n元素及p元素掺杂，且具备较高含量的官能团。图3e，f的荧光衰减曲线显示，无论是碳量子点i还是ii都适用于三指数模型，包含一个约1ns的快组分和两个分别在4ns和11ns的慢组分。快组分为固有态发射，慢组分为缺陷态发射。碳量子点i显示比ii具有更高的快组分百分比，即碳量子点i更多的固有态发射，这也造就了碳量子点i更高的荧光稳定性和量子产率。

实施例4碳量子点的稳定性研究

经测试，碳量子点i及碳量子点ii的zeta电势分别为-21.1±4.9mv和-21.3±6.1mv，这些小碳点之间的静电斥力使得碳量子点可以稳定数月的时间且没有任何的沉淀粒子。碳量子点的稳定性还体现在其光致发光光谱中。图4a显示，这两种碳量子点随着时间的推移荧光强度逐渐下降。但明显地，碳量子点i比ii体现出更强的荧光强度保存度，碳量子点i经过三个月的储存器荧光强度只下降了5％，而碳量子点ii则下降37％。此外，两种碳量子点均展现出极好的抗光致漂白性。图4b显示在连续三个小时的紫外光照射下，碳量子点i的荧光强度保留度可达到89％，而碳量子点ii则达到83％。在高离子强度下，两种碳量子点均展示出良好的光致发光性，体现了生理条件下荧光标记的潜力。

实施例5碳量子点的细胞毒性研究

用cck-8试验检验碳量子点对细胞的毒性，hela细胞以每孔5×10³个的密度培养24小时。接下来用不同浓度的碳量子点与hela细胞共同于添加5％二氧化碳的37℃的湿润孵化器中孵育24小时。碳点的浓度依次增加，分别为0，0.001，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0mg/ml。在每孔中加入10μl的cck-8溶液，并再次孵育1小时。之后用孔板光度计读出490nm处的吸收值。碳量子点的毒性可以通过与空白样品的吸收值对比得到。空白样品为在不添加碳量子点下，同等情况下培养hela细胞。如图5显示在不同浓度碳量子点存在下，细胞成活率均在80％以上。

实施例6基于碳量子点的细胞成像显色剂

在细胞培养液中加入碳量子点，使其浓度为0.1mg/ml，与hela细胞在37℃下共同孵育2小时。添加2mg/ml的alexafluor546-鬼笔环肽孵育45分钟，对细胞骨架进行着色。之后用培养液冲洗细胞三次以洗掉多余的碳量子点和染料。之后，用3.7％甲醛pbs溶液固色10分钟。用pbs溶液冲洗细胞三次，之后再用reddot1对细胞核进行着色。用蔡司lsm-710共聚焦显微镜进行观察和计数。图6显示，细胞质的网状结构可以很清晰的借由碳量子点的蓝色荧光进行观察。碳量子点可以通过内吞作用被细胞摄取于细胞质，这也充分展示了碳量子点的低毒性和高效率。与传统的有机染料和半导体量子点相比，碳量子点明显具有更高的水溶性和生物适应性，更能应用于细胞内成像追踪、细胞免疫等方面的应用。

实施例7基于碳量子点的铁离子荧光检测平台

用胶原为原料制备的碳点具有氮元素和磷元素的掺杂，且具备胺基、羟基、羧基基团，有助于接下来的离子传感应用。铁离子在诸如酶的催化、氧的输送、电子转移、血红蛋白的合成等一系列生理活动中都扮演了相当重要的角色。铁离子能与带有负电荷的碳量子点表面的羧基、羟基官能团通过静电作用结合在一起。铁离子与结合位点之间的相互作用能够促使从碳量子点的激发态到过渡金属离子d轨道的非辐射电子转移。在该实施例中，配置碳量子点的1mg/ml的水溶液，取10μl与铁离子的不同浓度溶液在室温下混合，并于黑暗中静置20分钟。铁离子储存溶液的浓度依次为1，3，6，10，15，20，30，40，50，70，90，100μm。依次测量该混合溶液的荧光光谱，可得铁离子浓度和荧光强度的标准曲线。该实施例的荧光强度变化图谱如图7a，b所示，随着铁离子浓度的增大，荧光强度也逐渐降低。铁离子浓度在0到100μm的范围内与碳量子点的荧光强度呈线性关系，反映出碳点的荧光淬灭应该是静态过程而非动态。图7c的stern–volmer曲线显示了这一线性关系。静态淬灭过程来源于基态荧光分子与淬灭分子间产生的非荧光复合物。除了羟基与羧基，碳量子点中掺杂的磷元素还能与铁离子间形成fe-o-p键实现荧光的静态淬灭。荧光碳量子点呈现了良好的线性关系，在对于铁离子的检出限为0.06μm(信噪比为3)。氨基酸组装堆叠起来的官能团使得碳量子点具有较高的量子产率和荧光强度，进而具备对于铁离子的高灵敏度。图7d显示在高浓度的干扰离子存在下，碳量子点对于铁离子的特异性检测。

总结

综合实施例1-7可得出，本发明所提出的以三维胶原支架为碳源制备碳量子点的方法，可通过水热、微波、回流等方式碳化得到发荧光的碳量子点材料，该制备方法简便、绿色环保。本发明所提出的碳量子点材料，具有多种官能团还较强荧光量子产率，有望成为荧光成像剂和荧光探针平台，应用在医学、传感方面。

以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。