氮和硫共掺杂碳点及其制备方法和应用与流程

本申请要求于2020年8月25日提交中国专利局的申请号为202010865092.5、名称为“氮和硫共掺杂碳点及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明涉及纳米材料技术领域，具体而言，涉及一种氮和硫共掺杂碳点及其制备方法和应用。

背景技术：

荧光碳点(cds)作为一种新型荧光材料，其具有优秀的光学性质，良好的水溶性、低毒性、环境友好、原料来源广、成本低、生物相容性好等诸多优点。碳点在生物医药领域具有广泛的应用。近年来，碳点使用杂原子掺杂的方法提高性能已经成为研究的热点，其原因在于通过掺杂所引起的结构变化能够有效改变碳点的本质特性。其中，氮、硫共掺杂的碳点是一种常见的掺杂方式。而现有的碳点硫元素的掺杂多数采用含硫分子先溶于水或有机试剂，再经过高温高压或回流反应的方式实现，其工艺较为复杂，且采用有的有机硫化物(巯基乙酸、巯基丙酸等)具有较大的毒性，此外，采用无机类掺硫物时，反应只能在水溶液中进行，而溶剂热法是制备高质量碳点的重要方法。

具有检测和抗菌双功能碳点的制备及性能研究，一直是纳米材料研究的重难点。在检测方面，荧光传感技术以其高灵敏度，简便易行，快速实现等特点成为人们目标。然而未经修饰和特定构建的cds检测金属离子往往检测的灵敏度不高。在疾病治疗方面，关于具有抗菌功能的碳点已经被一步法制备出来，但有效抑菌的微粒的抗菌效果仍然需要提高，并且生物可利用性仍然需要证明。为了实现双功能碳点在传感和临床方面的应用，本发明使用了巯基甘油和本身具有抗菌作用的聚乙烯亚胺作为原料，不仅保留了聚乙烯亚胺的抗菌性，由于硫的掺杂，碳点粒径更小，分布状态更均匀，还具有稳定的荧光特性、极小的细胞毒性和优异的生物相容性，还能有效地促进氮和硫共掺杂碳点与金属离子之间的电子转移和配位相互作用。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种氮和硫共掺杂碳点及其制备方法和应用，以改善上述问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种氮和硫共掺杂碳点的制备方法，其包括：将碳源和氮源在溶剂中加热制备得到碳点，其中，溶剂包括巯基甘油。

第二方面，本发明实施例还提供了一种氮和硫共掺杂碳点，其由上述制备方法制备得到。

第三方面，本发明实施例还提供了上述氮和硫共掺杂碳点在检测铜离子中的应用，可选地，检测铜离子的检测限为10nm。

第四方面，本发明实施例还提供了上述氮和硫共掺杂碳点在检测药物硫普罗宁中的应用，可选地，检测硫普罗宁的检测限为40nm。

第五方面，本发明实施例还提供了一种用于检测硫普罗宁含量的试剂，其包括含有氮和硫共掺杂碳点的溶液，且溶液中还含有铜离子。

第六方面，本发明实施例还提供了一种用于检测铜离子和硫普罗宁含量的双检测传感器，其包括上述氮和硫共掺杂碳点。

第七方面，本发明实施例还提供了上述氮和硫共掺杂碳点制备抗菌剂中的应用，氮源为聚乙烯亚胺，硫源为巯基甘油。

本发明上述实施例具有以下有益效果：通过采用含硫的巯基甘油作为硫源参与反应，巯基甘油本身又能够作为反应体系的溶剂，使得参与反应的各种物质之间的分散相容性较好，并且，亲水性硫醇结合到碳点表面原子上，同时稳定碳点在极性溶剂中的分散。进一步地，采用巯基甘油作为硫源来制备氮和硫共掺杂碳点不仅可以痕量检测铜离子，还能够进一步检测硫普罗宁，因此，可用于构建能够同时检测铜离子和硫普罗宁含量的双检测传感器。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的氮和硫共掺杂碳点的紫外吸收光谱和荧光发射光谱(ex＝360nm)；

图2为本发明实施例2的合成的碳点的荧光发射光谱(ex＝360nm)；

图3为本发明实施例3的合成的碳点的荧光发射光谱(ex＝360nm)；

图4为本发明实施例1的氮和硫共掺杂碳点的透射电镜图；

图5为本发明对比例1的无硫掺杂的氮碳点的透射电镜图；

图6为本发明实施例1的氮和硫共掺杂碳点的原始荧光强度与猝灭后的荧光强度比值(f0/f)对不同离子的响应性；

图7为本发明实施例1的氮和硫共掺杂碳点溶液中加入不同浓度cu²⁺(0.025～50μm)后的荧光猝灭光谱图以及(f0/f)与cu²⁺的浓度的关系图(f0为原始荧光强度，f为猝灭后的荧光强度)；

图8为本发明实施例1的氮和硫共掺杂碳点(10μg/ml)和cu²⁺(50μmcu²⁺)混合溶液中加入不同浓度硫普罗宁(0.4～50μm)后的荧光回升光谱图以及(f/f0′)与硫普罗宁浓度的关系图(f为荧光恢复后的荧光强度，f0′为荧光恢复前的原始荧光强度)；

图9为对比例2中向氮和硫共掺杂碳点-cu²⁺溶液加入100μl谷胱甘肽后的荧光强度图；

图10为不同浓度的实施例1的氮和硫共掺杂碳点细胞毒性实验后的lo2细胞活力图；

图11为不同浓度的实施例1的氮和硫共掺杂碳点导致的兔血溶血率。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明提供的一种氮和硫共掺杂碳点及其制备方法和应用进行具体说明。

本发明的一些实施方式提供了一种氮和硫共掺杂碳点的制备方法，其包括：将碳源和氮源在溶剂中加热制备得到碳点，其中，溶剂包括巯基甘油。

具体地，一些实施方式中，溶剂还包括甘油，即溶剂包括巯基甘油和甘油，其中，巯基甘油和甘油的质量比可为1:1。

通过采用含硫的巯基甘油作为硫源参与反应，相对于现有的无机硫盐作为硫源，其安全无毒，同时巯基甘油本身又能够作为反应体系的溶剂，能够和参见反应的碳源和氮源之间具有很好的分散相容性，并且生成碳点的过程中，亲水性硫醇结合到碳点表面原子上，同时稳定碳点在极性溶剂中的分散，进而使得制备得到的共掺杂碳点粒径更小，分布状态更均匀，且结构稳定。

具体地，一些实施方式中，巯基甘油包括1-硫代甘油、1,3-二巯基丙醇和2,3-二巯基丙醇中的至少一种，更优选地，巯基甘油为1-硫代甘油。

进一步地，上述氮和硫共掺杂碳点的制备方法在一些实施方式中可具体包括以下步骤：

s1、将碳源、氮源和溶剂搅拌混合，得到均匀混合溶液，溶剂为巯基甘油和甘油的混合物。

一些实施方式中，碳源包括但不限于葡萄糖、草酸和柠檬酸中的至少一种，较佳的实施方式中，碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、聚乙二醇、尿素、抗坏血酸、和柠檬酸，其中，葡萄糖和柠檬酸的质量比可为(0.5～3):(3～5)。

一些实施方式中，氮源包括氨基酸、乙二胺、各种分子量的聚乙烯亚胺(mw.600,1800,10000,70000)和苯胺中的至少一种，优选地，氮源为聚乙烯亚胺。

其中，当氮源为聚乙烯亚胺时，由于聚乙烯亚胺具有抗菌作用，但是其生物不友好性限制其抗菌应用的进一步发展，而发明人通过大量研究和实践，创造性地提出了通过上述巯基甘油作为硫源和溶剂的方案能够实现氮和硫元素表面修饰，改善了碳点的生物相容性。而且所合成碳点仍具有一定的抗菌性，对多种细菌(包括耐药菌)具有差异性抗菌能力。选择巯基甘油和甘油共同作为溶剂不仅可以溶解各种原料，使得反应原料之间能够充分更好的反应生成碳点；混合溶剂还具有较高的沸点，能够保证高温(≥100℃)高压环境下的反应；最重要的是能够实现硫元素的掺杂，提高碳点的整体性能。

s2、将步骤s1得到的混合溶液在反应容器中进行加热反应，即得到碳点。

一些实施方式中，制备碳点的加热温度为100～150℃，优选120～130℃，更优选120℃，加热时间为30～120min，优选50～90min，更优选80min。

一些加热的方式包括但不限于油浴、水浴、水热、微波等。优选油浴加热的方式，这种方法加热均匀，避免了水热法的高温高压。

s3、将步骤s2反应得到的碳点溶于水中，置于超滤管中或者与有机试剂混合，接着离心后干燥，即可得纯化后的氮和硫共掺杂碳点。

具体地，一些实施方式中，超滤管包括但不限于3kd超滤管。将通过超滤管收集的上清液可通过尼龙膜进行过滤，然后用500da的分子量截留量的透析袋透析约48h，以除去微小杂质，最后冷冻干燥，获得纯化的氮和硫共掺杂碳点。

进一步地，本发明的一些实施方式还提供了一种氮和硫共掺杂碳点，其由前述任一实施方式的制备方法制备得到。

进一步地，发明人通过研究发现，在上述实施方式获得的氮和硫共掺杂碳点的溶液中加入一定量的二价铜离子能够使得碳点溶液的荧光发生明显猝灭。并且，相对于其他金属离子，二价铜离子的猝灭效果非常显著，该碳点对于铜离子的猝灭具有较高的选择性。进而可以通过该氮和硫共掺杂碳点的溶液来达到检测铜离子含量的目的。

因此，本发明的一些实施方式还提供了上述氮和硫共掺杂碳点在检测铜离子中的应用，可选地，检测铜离子的检测限为10nm。

进一步地，发明人创造性地发现，在上述加入有铜离子的氮和硫共掺杂碳点的溶液体系中加入硫普罗宁，其荧光有良好的恢复响应，进而可将上述溶液体系用于硫普罗宁含量检测。

因此，本发明的一些实施方式还提供了上述氮和硫共掺杂碳点在检测硫普罗宁中的应用，可选地，检测硫普罗宁的检测限为40nm。

并且，本发明的一些实施方式还提供了一种用于检测硫普罗宁含量的试剂，其包括含有氮和硫共掺杂碳点的溶液，且溶液中还含有铜离子。

同时，基于以上发现，本发明的一些实施方式还提供了一种用于检测铜离子和硫普罗宁含量的双检测传感器，其包括上述氮和硫共掺杂碳点。其可以用于药物硫普罗宁肠溶片实际样品的含量检测。

进一步地，当氮源选择聚乙烯亚胺，硫源为巯基甘油时，本发明上述实施方式制备的氮和硫共掺杂碳点还可用于制备抗菌剂。其能够对多种细菌(包括耐药菌)具有差异性的抗菌能力。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

(1)在10ml圆底烧瓶中将0.2g葡萄糖、0.2g聚乙烯亚胺、0.5g柠檬酸分散于1.5ml甘油和1.5ml1-硫代甘油中，然后搅拌均匀，得到混合溶液a。将混合溶液放于油浴锅120℃加热80min，反应后即得氮和硫共掺杂碳点。

(2)将步骤(1)所得碳点溶解并定容于10ml超纯水中，直接透过3kd超滤管离心，收集得到的上清液并用0.2μm尼龙膜过滤，然后在室温下用500da的分子量截留量的透析袋透析48h，以除去微小杂质。之后冷冻干燥，即得纯化后的氮和硫共掺杂碳点。

实施例2

(1)在10ml圆底烧瓶中将0.1g葡萄糖、0.2g聚乙烯亚胺、0.3g柠檬酸分散于1.5ml甘油和1.5ml1-硫代甘油中，然后搅拌均匀，得到混合溶液a。将混合溶液放于油浴锅120℃加热80min，反应后即得氮和硫共掺杂碳点。

(2)将步骤(1)所得碳点溶解并定容于10ml超纯水中，直接透过3kd超滤管离心，收集得到的上清液并用0.2μm尼龙膜过滤，然后在室温下用500da的分子量截留量的透析袋透析48h，以除去微小杂质。之后冷冻干燥，即得纯化后的氮和硫共掺杂碳点。

实施例3

(1)在10ml圆底烧瓶中将0.2g葡萄糖、0.2g聚乙烯亚胺、0.5g柠檬酸分散于1.5ml甘油和1.5ml1，2二硫代甘油中，然后搅拌均匀，得到混合溶液a。将混合溶液放于油浴锅110℃加热60min，反应后即得氮和硫共掺杂碳点溶液。

(2)将步骤(1)所得碳点溶解并定容于10ml超纯水中，直接透过3kd超滤管离心，收集得到的上清液并用0.2μm尼龙膜过滤，然后在室温下用500da的分子量截留量的透析袋透析48h，以除去微小杂质。之后冷冻干燥，即得纯化后的氮和硫共掺杂碳点。

对比例1

本对比例与实施例1不同之处仅在于，用1.5ml甘油替换1-硫代甘油。

试验例1

将实施例1获得的纯化后的氮和硫共掺杂碳点的水溶液在360nm的紫外光下照射，得到其紫外吸收光谱和荧光发射光谱，如图1所示。在360nm波长激发下，碳点的发射波长约为470nm，荧光强度达到850以上。碳点的紫外吸收图中，360nm处出现吸收峰，这可能是来源于-nh2、-sh以及c＝o的n-π*跃迁。

实施例2所得碳点的荧光光谱图如图2所示，在360nm波长激发下，碳点的发射波长467nm。相同测量环境下，荧光强度相较于实施例1中所得碳点的荧光强度有所降低。

实施例3所得碳点的荧光光谱图如图3所示，在360nm波长激发下，碳点的发射波长468nm。相同测量环境下，荧光强度相较于实施例1中所得碳点的荧光强度有所降低。

将实施例1获得纯化后的氮和硫共掺杂碳点通过透射电镜成像，获得氮和硫共掺杂碳点的透射电镜图，如图4所示。图像表明所制备的碳点分散良好，呈球状，大小均一。粒径呈正态分布，较窄，100个粒子的平均粒径为1.89nm。

对比例1获得的无硫元素掺杂的碳点的透射电镜成像图如图5所示，碳点有聚集，且大小不同，粒径明显较大，分布不均匀。

试验例2

配置浓度为10μg/ml的氮和硫共掺杂碳点的水溶液，并且在水溶液中分别添加1nm的不同金属离子(co²⁺，zn²⁺，ag⁺，mn²⁺，fe³⁺，hg²⁺，mg²⁺，ca²⁺，pb²⁺，cd²⁺，cu²⁺)，然后在5分钟后进行荧光测量，氮和硫共掺杂碳点原始荧光强度与猝灭后的荧光强度比值(f0/f)对不同离子的响应性如图6所示，从图中可看出，相较于其他离子，cu²⁺的猝灭效果非常显著，可见该碳点对铜离子的猝灭选择性相当高。

将将氮和硫共掺杂碳点溶液(在水中10μg/ml)添加到1ml石英池中，然后将不同浓度的cu²⁺溶液添加到系统中。3分钟后在470nm(在360nm激发)记录荧光强度。如图7，在0.025-50μm的cu²⁺浓度范围内，氮和硫共掺杂碳点的荧光荧光强度随着cu²⁺的浓度增加而降低。f0代表原始荧光强度，f代表猝灭后的荧光强度，f0/f与cu²⁺的浓度c1呈现良好的线性关系(f0/f＝0.0759c1+1.0326)，得到r²为0.995。在相同检测条件下检测限(lod)为10nm。

试验例3

向氮和硫共掺杂碳点-cu²⁺溶液(10μg/ml的氮和硫共掺杂碳点和50μmcu²⁺)加入不同浓度的硫普罗宁。如图8，随着硫普罗宁的浓度增加，氮和硫共掺杂碳点-cu²⁺系统的荧光强度在470nm附近得到有效回升。f为荧光恢复后的荧光强度，f0′为碳点-cu²⁺猝灭系统的原始荧光强度，在0.4-50μm的浓度范围内，f/f0′与硫普罗宁的浓度c2呈线性相关(f/f0′＝0.0256c2+1)，相关系数平方(r²)达到了0.998，计算出的检出限(lod)为40nm。

将硫普罗宁片剂进行去包衣预处理程序，配成适当浓度。如表1所示，通过加标试验，得到实际样品的加标回收率为97.65％。这与药品标识的含量基本吻合，表示所构建的氮和硫共掺杂碳点的猝灭恢复模式检测硫普罗宁肠溶片具有一定的实用价值。即通过以上硫普罗宁片剂的加样回收实验验证目前基于氮和硫共掺杂碳点的传感器在实际中的可行性。

表1加标回收率法检测硫普罗宁肠溶片

对比例2

本对比例与试验例3不同之处在于，向氮和硫共掺杂碳点-cu²⁺溶液(10μg/ml的氮和硫共掺杂碳点和50μmcu²⁺)加入100μl谷胱甘肽溶液(0.5mm)测量荧光。

谷胱甘肽是含有巯基的三肽，具有抗氧化和整合解毒作用，与硫普罗宁类似，在临床中可用于慢性肝脏疾病的辅助治疗。当氮和硫共掺杂碳点-cu²⁺溶液存在50μm谷胱甘肽时，混合溶液的荧光强度相较于缺少谷胱甘肽的略有上升(如图9)，但明显低于硫普罗宁使混合溶液的荧光上升的程度。说明了碳点-cu²⁺体系对硫普罗宁检测的特异性。

试验例4

选择人正常肝细胞lo2细胞进行细胞毒性试验。首先将细胞接种在96孔细胞培养皿上在37℃，5.0％co2的空气中培养24小时，将细胞粘附在细胞上表面。然后用200ml改变培养基新鲜dmem培养基补充含氮和硫共掺杂碳点，使细胞分别再生长24小时。每组至少进行六次平行样品。未用cds处理的细胞作为对照。后每孔加入20ml5.0mg/mlmtt试剂，细胞进一步培养4小时。mtt的培养基是取出并加入150mldmso。得到的混合物在室温下摇动约10分钟。在538nm处测量混合物的(od)酶标仪。细胞活力计算为：细胞活力(％)＝(od处理/od对照)×100％，获得分别不含cds的和存在cds处理的细胞活力。

孵育后用氮和硫共掺杂碳点处理24h，200μg/ml的浓度下，细胞活力仍高达80％，当浓度高达500μg/ml的氮和硫共掺杂碳点处理后的细胞活力甚至仍大于70％(如图10所示)。由此可知，制备的氮和硫共掺杂碳点具有较低毒性和优异的生物相容性。由于它体积小，光稳定性好和优异生物相容性，制备的氮和硫共掺杂碳点具有很大的生物利用潜力。

试验例5

用杜氏磷酸缓冲液(d-pbs)配制不同浓度的氮和硫共掺杂碳点(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml和500μg/ml)的溶液，并在37℃下保持30min。9000rpm离心新鲜的兔全血3min，除去上清液后用d-pbs洗涤下层亚代红细胞(rbc)。将不同浓度的碳点溶液分别添加到稀释的rbc(0.2ml)至1ml。将混合样在37℃下孵育3h。然后离心样品，将上清液转移至96孔板中，并在577nm下测吸收度，计算三个测量值的平均值。用去离子水和d-pbs分别采用相同方法处理血样作为阳性对照和阴性对照。溶血率计算为：

hemolysisrate％＝[(odt-odn)/(odp-odn)]×100％

其中，odt、odn和odp分别是测试样品、阴性对照组和阳性对照组的吸光度值。

通常利用血液的溶血作用对生物医学材料的安全性进行评估。5％以下的溶血率被认为生物医学材料具有生物相容性。如图11所示，通过溶血实验评估了原料pei(mw.1800)与氮和硫共掺杂碳点的溶血作用。实验发现相同条件下，氮和硫共掺杂碳点的溶血率明显低于原料pei，且在500μg/ml浓度时的溶血率仍远低于5％。因此确定氮和硫共掺杂碳点具有良好的生物相容性，在生物领域具有良好的应用前景。

试验例6

将细菌在相应的养基中培养，通过紫外可见光谱法测量在600nm(od600)处的光密度，确定37℃摇动(180rpm)下细菌的浓度。最小抑菌浓度(mic)测试碳点的mic通过使用96孔细胞培养板的微量稀释来确定。在96孔细胞培养板依次加入浓度从大到小的药液(50μl)作为药物组，每种浓度4个孔，每个浓度选取一个孔加50μl培养基做对照，其它药物组加50μl菌液。选取4个孔只加培养基(100μl)作“阴性对照”，另外选取4个孔加培养基(50μl)与菌液(50μl)作“阳性对照”。将细菌细胞的浓度调节为每孔10⁷cfu/ml。于37℃下过夜培养12h。每孔加5μlmtt(5mg/ml)继续于37℃培养20min，最后每个有溶液的孔加入二甲亚砜(150μl)观察染色情况并记录结果。重复实验三遍。

使用一系列浓度的氮和硫共掺杂碳点溶液在96孔细胞培养板中孵育12h后，通过mtt对培养基中存活的细菌进行显色定量。结果如表2，可以看出氮和硫共掺杂碳点对于多种细菌具有不同的抑制作用。其中，氮和硫共掺杂碳点对革兰氏阳性菌具有特异性的杀菌能力。另外，对于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌都具200μg/ml以下的mic，可见，氮和硫共掺杂碳点对细菌的杀灭作用机制基本不受细菌耐药性的影响。而对革兰氏阴性菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌的mic为1000μg/ml，明显偏高。

表2氮和硫共掺杂碳点对不同菌种的mic(μg/ml)

综上所述，本发明实施方式中，当所用原料选用葡萄糖、聚乙烯亚胺、柠檬酸、1-硫代甘油和甘油时，所有原料毒性低，材料易得。不添加含硫无机盐类，并且采用安全无毒的1-硫代甘油(tg)这一溶剂作为硫源实现碳点中s的掺杂，避免了原料在甘油中溶解性的问题，使得亲水性硫醇结合到碳点表面原子上，同时稳定碳点在极性溶剂中的分散，进而使得制备得到的氮和硫共掺杂碳点，粒径更小，分布状态更均匀，还具有稳定的荧光特性、极小的细胞毒性和优异的生物相容性，还能有效地促进碳点与金属离子之间的电子转移和配位相互作用。此外，采用甘油(沸点290℃)和tg(118℃)的高熔点溶剂既保证了高于100℃反应，又在反应后能与水互溶。

通过对该氮和硫共掺杂碳点的荧光特性研究，可将其应用于铜离子和硫普罗宁的检测，开发出可检测铜离子和硫普罗宁含量的双检测传感器，不仅可痕量检测铜离子，还能检测药物硫普罗宁的含量。对铜离子和硫普罗宁的检测限分别低至10nm和40nm，该传感器响应速度快、检测浓度范围广、灵敏度高且特异性强。

进一步地，水溶性高分子聚合物聚乙烯亚胺(pei)的加入使得碳点表面富含氨基基团，碳点还获得了pei的抗菌性能，通过其他绿色原料柠檬酸、葡萄糖、1-硫代甘油等的加入，实现氮和硫元素表面修饰，改善了碳点的生物相容性。使得所合成碳点仍具有一定的抗菌性，对多种细菌具有差异性抗菌能力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。