荧光检测2019-nCoVmAb的组合物及其制备方法和应用

荧光检测2019-ncov mab的组合物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及2019新型冠状病毒抗体(2019-ncov mab)检测的技术领域，具体而言，涉及荧光检测2019-ncov mab的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒性肺炎是由以肺部疾病为主导的病毒，可能对消化系统和神经系统造成损害，甚至可能导致患者死亡。rt-pcr核酸检测技术具有高灵敏度和高特异性，可以较早发现感染。但是，rt-pcr核酸检测的结果受多种因素和多个环节的影响，例如试剂盒的准确性和可重复性，标本的类型，rna的储存和运输容易降解，患者的感染周期和人员操作等。这种情况增加了假阴性的风险。正常的免疫系统会在新型冠状病毒(2019-ncov)入侵之后的3-7天内产生特有的抗体，而抗体检测的医学诊断已是成熟的临床应用，如人类免疫缺陷病毒(hiv)，测定其抗体仍是诊断艾滋病的重要依据。
3.抗体是采血样进行检测，几乎不会出现阴性结果。因此对2019-ncov抗体(即2019-ncov mab)的检测既能弥补核酸检测假阴性漏检的缺失，同时避免了咽试纸法核算检测时气溶胶传染的风险。该研究也能在未来可能使用2019-ncov疫苗情况下最好的判断依据。
4.石墨烯量子点是一种新型的量子点，由于其独特的性能而引起了广泛的研究兴趣。与石墨烯相比，石墨烯量子点表现出更强的边界效应。此外，石墨烯量子点还具有低细胞毒性，良好的水溶性，化学惰性，稳定的光致发光等特性，这些特性使它们成为用于生物测定的有吸引力的荧光传感材料。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速、高效的荧光检测2019-ncov mab的组合物及其制备方法和应用。
6.为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了荧光检测2019-ncov mab的组合物。技术方案如下：
7.荧光检测2019-ncov mab的组合物，包括：第一组分，所述第一组分包括ag@au nps-ncp抗原，所述ag@au nps-ncp抗原具有金银合金纳米粒子；第二组分，所述第二组分包括石墨烯量子点。
8.进一步地是，金银合金纳米粒子的形貌为球形，粒度为20～30nm；石墨烯量子点的形貌为球形，粒度为15～25nm。
9.进一步地是，当2019-ncov mab的浓度为0～10ng/ml时，组合物的荧光强度降低率与2019-ncov mab的浓度的对数的线性关系为y＝0.0225x+0.1563，r2＝0.9924。
10.为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了荧光检测2019-ncov mab的组合物的制备方法。技术方案如下：
11.第一方面所述的荧光检测2019-ncov mab的组合物的制备方法，包括制备第一组分和制备第二组分，其中，制备第一组分包括步骤：(1)获取金银合金纳米粒子溶液，即ag@
au nps溶液；(2)将ag@au nps溶液与ncp抗原溶液混合，低温搅拌得到混合液；(3)向混合液中加入bsa溶液，继续搅拌后离心分离得到沉淀物；(4)将沉淀物分散于pbs溶液中，即得到ag@au nps-ncp抗原。
12.进一步地是，步骤(2)-(4)在4℃下进行，搅拌3～5h；pbs溶液的ph为7.5；ag@au nps-ncp抗原在4℃下保存。
13.进一步地是，ag@au nps溶液的制备包括步骤：
14.(1)配置haucl4溶液并加热至沸腾；
15.(2)向沸腾液中加入agno3溶液；
16.(3)继续加入柠檬酸钠溶液，反应完成即得到ag@au nps溶液。
17.进一步地是，制备第二组分包括步骤：
18.(1)加热柠檬酸至形成橙色液体；
19.(2)将橙色液体加入到碱液中，调节ph，即得到含有石墨烯量子点的gqds溶液。
20.进一步地是，将gqds溶液在4℃下保存；ph为8。
21.为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了荧光检测2019-ncov mab的组合物的使用方法。技术方案如下：
22.第一方面所述的荧光检测2019-ncov mab的组合物的使用方法，包括步骤：(1)将第一组分与2019-ncov mab溶液混合后进行孵育；(2)孵育完成后向孵育物中加入第二组分，然后进行荧光检测。
23.进一步地是，孵育时间≥2.5h。
24.可见，本发明的荧光检测2019-ncov mab的组合物的制备方法的工艺简单，原料易获取，成本低，制备得到的组合物使用方便，在检测2019-ncov mab时具有高选择性和良好的准确性。
25.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
26.构成本发明的一部分的附图用来辅助对本发明的理解，附图中所提供的内容及其在本发明中有关的说明可用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。在附图中：
27.图1为pbs溶液的ph不同时所得组合物使用时gqds的
△
f/f0的分布图。
28.图2为孵育时间不同时所得组合物使用时gqds的
△
f/f0的分布图。
29.图3为gqds溶液(a)、ag@au nps溶液(b)、gqds溶液和ag@au nps溶液构成的混合液(c)的紫外吸收光谱，线(d)由线(a)和线(b)叠加得到。
30.图4为gqds溶液的荧光发射光谱(a)和ag@au nps溶液的紫外吸收光谱(b)。
31.图5为gqds粉末的tem照片。
32.图6为ag@au nps粉末的tem照片。
33.图7为金银合金纳米粒子粉末的xps的ag3d的光谱图。
34.图8为金银合金纳米粒子粉末的xps的au4f的光谱图。
35.图9为gqds溶液(a)、gqds溶液和ag@au nps溶液构成的第一混合液(b)、gqds溶液
与ag@au nps-ncp溶液构成的第二混合液(c)以及第二混合液与2019-ncov mab溶液构成的第三混合液(d)的gqds的连续荧光谱图。
36.图10为在孵育条件下不同浓度的2019-ncov mab溶液与组合物反应后的gqds的连续荧光谱图。
37.图11为由图10得到的线性校准图。
38.图12为组合物与不同检测物溶液反应后的gqds的
△
f/f0的分布图。
具体实施方式
39.下面结合附图对本发明进行清楚、完整的说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。在结合附图对本发明进行说明前，需要特别指出的是：
40.本发明中在包括下述说明在内的各部分中所提供的技术方案和技术特征，在不冲突的情况下，这些技术方案和技术特征可以相互组合。
41.此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
42.关于本发明中术语和单位。本发明的说明书和权利要求书及有关的部分中的术语“包括”、“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
43.本发明的荧光检测2019-ncov mab的组合物的制备方法的具体实施方式包括制备第一组分和制备第二组分；
44.制备第一组分包括步骤：
45.(1)获取金银合金纳米粒子溶液，即ag@au nps溶液；优选但是不限于包括以下步骤：
46.(1.1)将0.309ml、30mmol/l的haucl4(氯金酸)水溶液添加到50ml水中，然后加热至沸腾；
47.(1.2)向沸腾液中加入0.198ml、20mmol/l的agno3(硝酸银)水溶液；
48.(1.3)加入2.5ml、质量分数为1％的柠檬酸钠溶液并回流反应30分钟，反应完成即得到含有金银合金纳米粒子(以下用ag@au nps表示)的ag@au nps溶液；ag@au nps直接以溶液的状态参与后续反应，可以显著提升反应的均匀性；对ag@au nps溶液进行固液分离即可以得到ag@au nps粉末。
49.(2)将3ml的ag@au nps溶液与300μl、5μg/ml的ncp抗原溶液混合，低温搅拌得到混合液；
50.(3)向混合液中加入20μl、质量分数为1％的bsa(牛血清白蛋白)溶液，继续搅拌后离心分离得到沉淀物；
51.(4)将沉淀物分散于1.5ml、0.01mol/l的pbs溶液(磷酸盐缓冲溶液)中，即得到含有ag@au nps-ncp抗原(以下直接称之为ag@au nps-ncp)的ag@au nps-ncp溶液。
52.其中，步骤(2)-(4)在4℃下进行，以保证2019-ncov mab的活性；同样地，制备得到的ag@au nps-ncp溶液在4℃下保存，随取随用。
53.步骤(2)和步骤(3)的搅拌时间优选为3～5h以使反应充分。
54.制备第二组分包括步骤：
55.(1)将2g柠檬酸在200℃加热30分钟，使无色柠檬酸固体逐渐变成橙色液体；
56.(2)将橙色液体加入到100ml、10mg/ml的naoh溶液中，ph调节到8，即得到含有石墨烯量子点(以下用gqds表示)的gqds溶液。gqds直接以溶液的状态参与后续反应，可以显著提升反应的均匀性；对gqds溶液进行固液分离即可以得到gqds粉末。
57.所得gqds溶液在4℃下保存以免使用时破坏2019-ncov mab的活性。
58.由此，即得到本发明的荧光检测2019-ncov mab的组合物，该组合物包括第一组分和第二组分；所述第一组分为ag@au nps-ncp溶液；所述第二组分为gqds溶液。
59.该荧光检测2019-ncov mab的组合物的使用方法，包括步骤：
60.(1)将100μl的ag@au nps-ncp溶液与20μl的2019-ncov mab溶液混合后进行孵育；
61.(2)孵育完成后向孵育物中加入20μl的gqds溶液，然后进行荧光检测。
62.以下通过实例来说明本发明的有益效果。
63.首先，在pbs溶液的ph分别为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5的条件下制备得到了七种ag@au nps-ncp溶液，首先，测试了纯的gqds溶液的荧光强度(f0)，然后测试了组合物与浓度为10ng/ml的2019-ncov mab反应后的gqds的荧光强度(f1)。
64.图1为pbs溶液的ph不同时所得组合物使用时gqds的
△
f/f0的分布图。其中，
△
f＝f
0-f1。
65.从图1可以看出，当pbs溶液的ph为7.5时，所得组合物可以获得最佳的检测效果。
66.其次，在孵育时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h和3.5h的条件下制备得到了七种ag@au nps-ncp溶液并测试了相应的f1。
67.图2为孵育时间不同时所得组合物使用时gqds的
△
f/f0的分布图。
68.从图2可以看出，当孵育时间为≥2.5h时，所得组合物可以取得较好的检测效果，从效率上考虑，孵育时间最佳为2.5h。
69.以下对gqds溶液、ag@au nps溶液以及最佳工艺参数制备得到的ag@au nps-ncp溶液的表征结果和性能测试结果进行进一步说明。
70.图3为gqds溶液(a)、ag@au nps溶液(b)、gqds溶液和ag@au nps溶液构成的混合液(c)的紫外吸收光谱，线(d)由线(a)和线(b)叠加得到。图4为gqds溶液的荧光发射光谱(a)和ag@au nps溶液的紫外吸收光谱(b)。
71.图3(a)在365nm处有一个明显的π-π*吸收峰，这与gqds的c＝c跃迁有关。从图4(a)可以看出，当激发光波长为390nm时，gqds溶液在465nm处具有最大发射光谱；图3(a)和图4(a)表明gqds已成功合成。
72.从图3(b)和4(b)可以看出，ag@au nps溶液在490nm附近有一个明显的uv吸收峰,表明ag@au nps已成功合成。
73.从图4还可以看出，相同波长处的线(d)的吸光度明显大于线(c)的吸光度，说明gqds和ag@au nps存在相互作用；线(a)和线(b)部分重叠，说明gqds和ag@au nps存在荧光共振能量转移。
74.图5为gqds粉末的tem照片。图6为ag@au nps粉末的tem照片。
75.从图5可以看出，gqds的形貌为球形，粒度为15～25nm，分散性良好；从图6可以看出，ag@au nps的形貌为球形，粒度为20～30nm。
76.图7为金银合金纳米粒子粉末的xps的ag3d的光谱图。图8为金银合金纳米粒子粉
末的xps的au4f的光谱图。
77.从图7中看到，结合能分别为367.7ev和373.7ev处的特征峰分别对应于ag3d
3/2
和ag3d
5/2
，归因于ag@au nps中的金属银。从图8中看到，结合能分别为83.6ev和87.3ev处的特征峰分别对应于au4f
7/2
和au4f
5/2
，归因于ag@au nps中的金属金。
78.图9为gqds溶液(a)、gqds溶液和ag@au nps溶液构成的第一混合液(b)、gqds溶液与ag@au nps-ncp溶液构成的第二混合液(c)以及第二混合液与2019-ncov mab溶液构成的第三混合液(d)的gqds的连续荧光谱图。
79.从图9可以看出，在相同波长处，单纯的gqds的荧光强度最高；在线(c)中，当加入ag@au nps-ncp溶液后，gqds的荧光强度显著降低；但是对比线(c)和线(d)可知，当加入2019-ncov mab后，gqds的荧光强度有明显恢复。
80.gqds的荧光强度恢复的原因是：单纯的gqds的荧光强度较高，但是当gqds与ag@au nps反应时，由于荧光共振能量转移效应，会导致gqds的荧光强度降低；当ag@au nps与ncp抗原结合后，gqds与ag@au nps-ncp之间的距离增大，直到达到荧光共振能量转移的最佳距离，此时fret效率达到最大值，gqds的荧光强度进一步降低；但是当加入2019-ncov mab后，由于2019-ncov mab的空间位阻效应，导致gqds的荧光有了一定的恢复。由此可见，可以通过2019-ncov mab加入前后的gqds的荧光强度的恢复程度来判断2019-ncov mab的加入量。
81.鉴于上文中孵育条件对gqds的荧光强度的显著影响，因此采用孵育的方式来测试组合物使用时与检测物浓度的线性关系。很明显，当gqds溶液与孵育后的ag@au nps-ncp溶液和检测物的混合液反应时，混合液中的检测物也能使得gqds与ag@au nps-ncp之间的距离增大而产生空间位阻效应，从而导致gqds的荧光产生不同程度地降低；若检测物的浓度高，则空间位阻效应高，gqds的荧光强度降低率低；反之则gqds的荧光强度降低率高；因此，在孵育条件下使用组合物时可以通过gqds的荧光强度降低率来判断检测物的浓度。
82.图10为在孵育条件下不同浓度的2019-ncov mab溶液与组合物反应后的gqds的连续荧光谱图。图11为由图10得到的线性校准图。其中，2019-ncov mab溶液的浓度的取值为0、1
×
10-4
ng/ml、1
×
10-3
ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml。
83.如图10所示，随着2019-ncov mab浓度的增加，反应后的gqds的荧光强度逐渐增加，这表明随着2019-ncov mab浓度的增加，ag@au nps-ncp溶液对gqds的影响变弱，从而使得gqds的荧光强度降低率降低。
84.对图10进行处理后可以得出，当2019-ncov mab溶液的浓度为0～10ng/ml时，组合物使用时的gqds的荧光强度降低率(在y轴，用
△
f/f0表示)与2019-ncov mab的浓度的对数(在x轴，用logc
(2019-ncovmab)
表示)的线性关系为y＝0.0225x+0.1563，r2＝0.9924，检出限为50fg ml-1
。
85.图12为组合物与不同检测物溶液反应后的gqds的
△
f/f0的分布图。
86.从图12可以看出，与牛血清白蛋白、谷胱甘肽、l-半胱氨酸、葡萄糖、l-组氨酸和叶酸相比，本发明的组合物对2019-ncov mab具有极佳的选择性。
87.以上对本发明的有关内容进行了说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。基于本发明的上述内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。