基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法

1.本发明涉及一种水中汞离子的检测方法，尤其是一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法，实现hg
2+
定量检测。


背景技术：

2.重金属污染是当前重要的环境问题，汞是一种毒性较强的重金属离子，其严重损害人体中枢神经系统，导致许多严重的健康问题，如脑损伤、肾衰竭以及各种认知和运动障碍。天然水体中最常见的有毒汞为水溶性二价汞离子(hg
2+
)，许多国家及组织都制定了饮用水中 hg
2+
的最高限量标准。现有的hg
2+
检测技术，如原子吸收法、色谱法、光谱法、电耦合等离子质谱法（icp-ms）和电化学方法等，被广泛应用于环境中hg
2+
检测中，但是这些检测方法对操作人员的专业性要求较高，很大程度上依赖于实验室大型设备，难以实现实时测量，无法对突发污染事件做出快速响应。因此，发展简单、快速、高灵敏度、低成本的重金属检测技术对保护环境和人类健康具有重要的理论和实用价值。
3.近年来，基于有机小分子、dna酶、寡核苷酸、聚合物及纳米粒子的探针技术被应用于hg
2+
检测。在众多研究中，基于t-hg
2+-t配位结构的hg
2+
检测技术以其快捷、高灵敏、低成本、高稳定性等显著优点，为hg
2+
检测技术提供了新的思路。为进一步提高hg
2+
检测的灵敏度，科研工作者们利用hg
2+
可与富t功能核酸序列相互作用这一特性，结合成熟的荧光检测技术，发展了多种hg
2+
检测方法。然而，荧光检测方法的优良特性也取决于新的荧光探针的选择，其实际应用中会面临探针材料的选择、体系易受环境因素干扰、稳定性较差、灵敏度低等问题。如公开号为cn 107436297 a的文献公布了“基于发夹式dna探针的水中汞离子检测方法
”ꢀ
，该文献设计了一条两端双标荧光染料的富t序列发夹式dna探针，加入hg
2+
之后，hg
2+
会与dna探针上的t碱基生成t-hg
2+-t的稳定结构，使探针结构发生变化，通过改变荧光能量共振转移的距离来实现hg
2+
定量检测，但存在以下不足：（1）该法设计的发卡式dna探针其双链部分本身就有很好的稳定性，检测过程中需要hg
2+
竞争结合探针上的t从而改变原有探针的发卡结构，通过形成新的结构实现hg
2+
检测，从专业角度出发，该步骤需要复杂的实验条件，难以达到理想的实验效果，影响因素较多，根据其公开的内容不难发现其检测限及线性范围较低。
4.同时，以sybr green
ꢀⅰꢀ
为代表的核酸染料作为荧光分子探针因具有价格低廉、光稳定性较好、安全等优良的荧光性能，近年来被广泛应用于hg
2+
、pb
2+
、cu
2+
、ag
+
等离子的检测，但存在sybr green
ꢀⅰꢀ
斯托克斯位移小，背景干扰高，影响检测灵敏度。
5.因此，针对上述问题，开发一种基于核酸染料的汞离子高灵敏荧光检测探针，是本领域技术人员亟需解决的一项技术问题，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法，实现水溶液中的hg
2+
高灵敏度和高选择性地检测，有望用于商
业化的推广应用。
7.为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案。
8.一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针，包括hg
2+
特异识别探针tro（thymidine rich oligonucleotide）和荧光指示探针gelred；所述hg
2+
特异识别探针tro由25个碱基组成，其中引入了五个t-t错配碱基对和三个自互补碱基对，其核酸序列为：5
’‑
tttctttccgggggggcgtttgtta
ꢀ‑3’
；当存在hg
2+
时，t-hg
2+-t错配能诱导tro折叠形成具有稳定发卡结构的tro-hg
2+
复合物；所述荧光指示探针为高灵敏核酸荧光染料gelred，其在游离状态下发出微弱的荧光，一旦与tro-hg
2+
复合物结合后，gelred荧光强度显著增强，荧光信号强度与tro-hg
2+
复合物的数量相关；通过建立荧光强度与hg
2+
浓度之间对应的线性关系，实现对汞离子的定量检测。
9.一种使用基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，包括以下步骤：1）将tro与hg
2+
在tris缓冲液中反应，形成tro-hg
2+
复合物；所述tro浓度为0.01~5μmol/l；hg
2+
浓度为0.1nmol/l~5μmol/l；tris缓冲液浓度为0.01~0.1mol/l，其中含20~100mmol/l nano3，ph值为6.4~8.6；tro与hg
2+
的反应时间为3~15min；2）将gelred加入上述tro-hg
2+
复合物中，室温下避光孵育，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定，并获得hg
2+
浓度-荧光强度值标准曲线；所述gelred为0.01~2
×
gelred溶液；孵育时间时间为2～15分钟。
10.进一步的：步骤1）中：所述tro浓度为0.05~2μmol/l；hg
2+
浓度为5nmol/l~2μmol/l；tris缓冲液浓度为0.02~0.05mol/l，其中含30~50mmol/l nano3，ph值为7.0~7.6；tro与hg
2+
的反应时间为为5~8min；步骤2）中：所述gelred为0.05~1
×
gelred溶液，孵育时间为5～10min。
11.hg
2+
浓度与荧光强度变化f/f0呈线性关系，且线性方程为y=-0.0004468x+0.8815，r2=0.99103。对水体中hg
2+
检测线性范围为10nmol/l～800nmol/l，检出限为0.14 nmol/l。
12.与现有技术相比，本发明具有以下优势：1、本发明制备的gelred/tro复合荧光探针，生物相容性良好，探针制备方法简单，安全无毒，成本低。基于gelred/tro探针的于hg
2+
检测该方法简单易行，不需要复杂的处理，同时该方法检测耗时短，检测成本低，且能为后续实时在线现场检测提供可能性。
13.2、本发明提供的hg
2+
特异识别探针（tro）包括了五个t-t错配碱基对和三个自互补碱基对，探针分子的特异序列能够与待测样本中的hg
2+
配对形成两端平齐的双链序列，该两端平齐的双链序列能更好的促进 t-hg
2+-t结构的稳定性。实现了hg
2+
快速、高灵敏度检测。
14.3、荧光探针检测方法在hg
2+
高灵敏度和特异性检测中显示出了良好的应用前景。然而，每一种方法表现出一些限制其实际使用的特性，如水溶性差、受其他金属离子干扰大、荧光强度弱、短发射波长、灵敏度差等。本发明选择的gelred是一种核酸荧光染料，在游离状态下其发出微弱的荧光，一旦与tro-hg
2+
复合物结合后，gelgreen荧光强度显著增强，荧光信号强度与tro-hg
2+
复合物的数量相关。并且，gelred的吸收波长为290，发射波长为
620 nm，stokes shift（斯托克斯位移）高达330nm，光化学稳定性好，以gelred作为荧光检测探针具有背景干扰低、样品穿透性强、对生物样品的光损伤小、检测灵敏度高等优点，选择以gelred作为新的荧光探针，为hg
2+
的快速、高灵敏和高选择性检测提供新的思路。
15.4、gelred是一种核酸荧光染料，为eb的替代产品，主要用于凝胶中dna、rna等核酸的染色，gelred在生物学研究中已成功应用于dna的定性和定量技术。本发明将其应用于hg
2+
检测，取得了较好的检测效果，拓宽了核酸荧光染料gelred的应用领域。
16.本发明对水体中hg
2+
检测线性范围为10nmol/l～800nmol/l，检出限为0.14 nmol/l。
17.本发明对标准浓度hg
2+
在自来水样和黄河水样中的平均回收率分别为98.08%和95.1%，说明该方法对检测复杂水样中的hg
2+
具有很大的潜力。
附图说明
18.图1为本发明gelred/tro荧光探针检测hg
2+
浓度的原理图；图2为本发明gelred/tro荧光探针检测hg
2+
浓度的荧光光谱图；图3为本发明gelred/tro荧光探针检测hg
2+
性能对比光谱图；图4为gelred对hg
2+
浓度变化的荧光响应光谱图；图5为本发明gelred/tro荧光探针对hg
2+
检测的灵敏度荧光光谱图；图6为本发明gelred/tro探针检测hg
2+
的线性图；图7为本发明gelred/tro探针对hg
2+
检测的特异性测试结果图。
具体实施方式
19.本发明将通过以下实施例作进一步说明。
20.一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针，包括hg
2+
特异识别探针tro和荧光指示探针gelred；所述hg
2+
特异识别探针tro由25个碱基组成，其中引入了五个t-t错配碱基对和三个自互补碱基对，其核酸序列为：5
’‑
tttctttccgggggggcgtttgtta
ꢀ‑3’
；当存在hg
2+
时，t-hg
2+-t结构的形成能诱导hg
2+
特异识别探针折叠成具有发卡结构的tro-hg
2+
复合物；所述荧光指示探针为高灵敏核酸荧光染料gelred，其在游离状态下发出微弱的荧光，一旦与tro-hg
2+
复合物结合后，gelred荧光强度显著增强，荧光信号强度与tro-hg
2+
复合物的数量相关；通过建立荧光强度变化与hg
2+
浓度之间对应的线性关系，实现对汞离子的定量检测。
21.上述技术方案的基本原理为：hg
2+
特异识别探针tro由25个碱基组成，其中引入了五个t-t错配碱基对和三个自互补碱基对。在没有hg
2+
时，tro通过静电作用与gelred作用发出较弱荧光。然而，存在hg
2+
时，t-hg
2+-t结构的形成能诱导tro折叠成发卡结构，形成稳定的tro-hg
2+
复合物，gelred与tro-hg
2+
复合物中的双链相互作用，发出强荧光，其荧光增强量与hg
2+
的浓度呈正相关，通过加入不同浓度hg
2+
所引起的荧光强度的改变，从而实现对hg
2+
的定量检测。
22.下面是通过利用上述gelred/tro荧光探针进行的具体检测方法，以进一步说明本发明，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
23.实施例1，一种使用基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，包括以下步骤：1）在0.01mol/l tris-hcl（ph8.6，含20mmol/l nano3）缓冲液体系中，分别加入终浓度为5μmol/l的tro及终浓度为5μmol/l 的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应3min，形成tro-hg
2+
复合物。2）将2
×
gelred溶液加入上述tro-hg
2+
复合物中，混匀，室温下孵育2min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。
24.实施例2，一种使用基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，包括以下步骤：1）在0.1mol/l tris-hcl（ph6.4，含100mmol/l nano3）缓冲液体系中，分别加入终浓度为0.01μmol/l的tro及终浓度为0.1nmol/l 的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应15min，形成tro-hg
2+
复合物。2）将0.01
×
gelred溶液加入上述tro-hg
2+
复合物中，混匀，室温下孵育15min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。
25.实施例3、一种使用基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，包括以下步骤：1）在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含40mmol/l nano3）缓冲液体系中，分别加入终浓度为0.1μmol/l的tro及终浓度为5nmol/l 的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应5min，形成tro-hg
2+
复合物。
26.2）将0.05
×
gelred加入上述tro-hg
2+
复合物中，混匀，室温下孵育5min，使用荧光分光光度计以290nm 的激发波长进行荧光光谱测定。
27.实施例4、一种使用基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，包括以下步骤：1）在0.03mol/l tris-hcl（ph7.0，含30mmol/l nano3）缓冲液体系中，分别加入终浓度为2μmol/l的tro及终浓度为2μmol/l的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应6min，形成tro-hg
2+
复合物。
28.2）将1
×
gelred加入上述tro-hg
2+
复合物中，混匀，室温下孵育8min，使用荧光分光光度计以290nm 的激发波长进行荧光光谱测定。
29.实施例5、一种使用基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，包括以下步骤：1）在0.02mol/l tris-hcl（ph7.6，含50mmol/l nano3）缓冲液体系中，分别加入终浓度为0.05μmol/l的tro及终浓度为800nmol/l 的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应8min，形成tro-hg
2+
复合物。
30.2）将0.5
×
gelred加入上述tro-hg
2+
复合物中，混匀，室温下孵育10min，使用荧光分光光度计以290nm 的激发波长进行荧光光谱测定。
31.gelred/tro荧光探针对800nmol/l hg
2+
的荧光光谱测定结果见图2，由图可见，在622nm处有较强的荧光信号。
32.下面通过对比实验及具体实验进一步证明本发明。
33.一、对比实验如下：以证明本发明采用的hg
2+
特异识别探针tro具有优异性能
1、gelred/tro荧光探针检测hg
2+
性能。
34.gelred/tro探针组：在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含50mmol/l nano3）缓冲液体系中，分别加入终浓度为0.1μmol/l的tro（5
’‑
tttctttccgggggggcgtttgtta
ꢀ‑3’
）及终浓度为200nmol/l 的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应5min，形成tro-hg
2+
复合物。然后在上述tro-hg
2+
复合物中加入0.05
×
gelred溶液，混匀，室温下孵育5min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。
35.gelred/t
25
荧光探针组：在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含50mmol/l nano3）缓冲液体系中，分别加入终浓度为0.1μmol/l的t
25
（tro对比链）（5
’‑
ttttttttttttttttttttttttt
ꢀ‑3’
）及终浓度为200nmol/l的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应5min，形成t
25-hg
2+
复合物。然后在上述t
25-hg
2+
复合物中加入0.05
×
gelred溶液，混匀，室温下孵育5min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。
36.gelred荧光探针组（无hg
2+
识别序列）：在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含50mmol/l nano3）缓冲液体系中，加入终浓度为200nmol/l的hg
2+
，然后加入0.05
×
gelred溶液，轻轻混匀，室温下孵育5min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。
37.图3显示了不同探针体系中加入200nmol/lhg
2+
后的荧光信号变化情况，由图可见，gelred探针测试体系只有非常弱的荧光信号（曲线a），gelred/t
25
探针测试体系荧光强度较gelred探针测试体系略有增强（曲线b），但gelred/tro测试体系荧光信号显著增强（曲线c），其荧光强度约为gelred/t
25
体系的2.5倍。表明tro与t
25
序列中的t都能与hg
2+
反应形成t-hg
2+-t结构，但本发明采用的tro序列由于其中引入了五个t-t错配碱基对和三个自互补碱基对，其与hg
2+
反应后能诱导tro折叠成稳定、有序的发卡结构，使gelred能与发卡结构中的双链相互作用发出强荧光，其效果优于普通的富t序列。
38.2、gelred对hg
2+
浓度变化的荧光响应。
39.在0.02mol/l tris-hcl（ph7.6，含30 mmol/lnano3）缓冲液体系中，加入1
×
gelred溶液，然后加入终浓度分别为0、200nmol/l和400nmol/l 的hg
2+
，轻轻混匀，室温反应10min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。
40.荧光检测结果见图4，在gelred溶液中加入不同浓度hg
2+
后，荧光强度几乎没有发生变化，证明gelred本身对hg
2+
的浓度变化是没有响应的。
41.二、实验例（gelred/tro复合探针的性能测试）实验例1 ，gelred/tro复合探针对hg
2+
检测的灵敏度。
42.在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含40mmol/l nano3）缓冲液体系中，加入终浓度为0.1μmol/l的tro，然后加入不同浓度的hg
2+
（终浓度分别为0、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、400nmol/l、600nmol/l、800nmol/l、1000nmol/l），轻轻混匀，室温反应5min，形成tro-hg
2+
复合物。最后在上述tro-hg
2+
复合物中加入0.05
×
gelred溶液，混匀，室温下孵育5min。用荧光分光光度计检测不同金属离子的荧光强度（f），并与对照f0（hg
2+
=0nmol/l）进行比较。
43.不同浓度hg
2+
对gelred/tro探针的荧光强度影响见图5，随着hg
2+
的浓度的增加，gelred的荧光信号增强。在10nmol/l～800nmol/l 范围内，hg
2+
浓度与荧光强度变化(f/f0)呈线性关系（图6），其线性方程为y=-0.0004468x+0.8815，r2=0.99103，有较宽的检测范围。根据3σ规则，本方法对hg
2+
的检测限为0.14 nmol/l 。
实验例2，gelred/tro探针对hg
2+
检测的特异性。
44.选择水体中常见的7种阳离子（fe
2+
、co
2+
、cu
2+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、ag
+
）和3种阴离子（cl-、so
42-、no
3-）作为干扰因素，进行响应实验和共存干扰实验，考察gelred/tro复合探针对hg
2+
检测的特异性。
45.在0.02mol/l tris-hcl（ph7.6，含50mmol/l nano3）缓冲液体系中，加入终浓度为0.05μmol/l的tro，然后各加入终浓度为200nmol/l的不同离子（hg
2+
、fe
2+
、co
2+
、cu
2+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、ag
+
、cl-、so
42-、no
3-）及十种干扰离子与hg
2+
的共存混合液（mix），轻轻混匀，室温反应8min。最后加入0.5
×
gelred溶液，混匀，室温下孵育10min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。用荧光分光光度计检测不同离子的荧光强度（f），并与对照f0（hg
2+
=200nmol/l）进行比较，通过f/f0比值考察gelred/tro探针对hg
2+
检测的特异性。
46.结果如图7所示，与对照f0相比，其他干扰离子的荧光响应（f/f0）都低于12%，阴离子对体系荧光检测干扰低于阳离子。混合离子共存检测体系荧光响应（f/f0）大于95%，表明该探针检测hg
2+
具有较好的选择性和抗干扰能力，适用于大多数环境监测应用场景。
47.实验例3，gelred/tro探针对实际水样中hg
2+
加标回收检测。
48.实际水样采用自来水以及黄河水，在样品检测前，对水样静置1h进行简单前处理，去除水样中微小固体颗粒。然后加入已知浓度的hg
2+
标准样（终浓度为600nmol/l、700nmol/l、800nmol/l）及终浓度为2μmol/l的tro，室温下避光反应6min。最后加入1
×
gelred溶液，混匀，室温下孵育8min，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定。结果见表1，hg
2+
在自来水样和黄河水样中的平均回收率分别为98.08%和95.1%，证明了该方法的可靠性，其在现场检测中具有较大的潜力。
49.表1 自来水中不同浓度hg
2+
的检测结果三、本发明和对比文件cn 107436297 a的效果比较对比文件cn 107436297 a记载其检测hg
2+
的检测限为1.5nm，且从图3可看出该方法对hg
2+
的线性范围约为2.5μmol/l
‑ꢀ
5μmol/l，本发明对水体中hg
2+
检测线性范围为10nmol/l～800nmol/l，检出限为0.14 nmol/l。显然对比文件的检测限及线性范围均低于本发明所获得的结果且不在一个数量级上。该差异的存在源于：本发明设计的hg
2+
特异识别探针tro由25个碱基组成，其中引入了五个t-t错配碱基对和三个自互补碱基对，在无hg
2+
时，tro呈无规则卷曲状态；存在hg
2+
时，t-hg
2+-t结构的形成能快速诱导tro折叠成具有发卡结构的tro-hg
2+
复合物，同时三个自互补碱基对能进一步增加tro-hg
2+
复合物的稳定性，使gelred能与tro-hg
2+
复合物中的双链相互作用发出强荧光，tro、hg
2+
、gelred相互间的识别与结合非常容易实现，且不需要复杂的实验条件、操作简单易行、检测灵敏度高，整个检测过程约10-15min，因此，在检测灵敏度、检测限、抗干扰、检测成本、稳定性等方面本发明
都具有明显优势。