专利名称：通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学工程和组织工程支架材料加工领域，是一种将固态发泡技术和脉冲功率超声空化技术相结合进行组织工程支架材料通透性调控的加工新技术。
背景技术：
组织工程支架是细胞生长的框架结构，能够植入生物体内，有效控制和引导细胞朝特定的方向生长，并能被生物体所吸收。它需要具有适度的生物降解速率，一定的可塑性，良好的结构和表面相容性。合适的泡孔密度和泡孔孔径所形成的具有一定连通性的孔洞结构能为细胞的附着和生长以及组织的新陈代谢提供空间结构，促进组织的修复和器官功能的恢复。组织工程支架材料的通透性是指泡孔的连通性，可以使细胞获得足够的营养物质，其代谢产物亦能通过支架材料的通孔结构排出，使组织细胞和支架材料之间能够有效进行营养交换，影响组织细胞的粘附和生长速度以及材料在生物体中的吸收速度。目前常用纤维粘接技术、溶剂浇铸技术、粒子浙滤技术和相分离技术等方法来制作具有高孔隙率和一定孔径分布的组织工程支架材料，但所使用的有机溶剂或发泡剂会产生残留而降低细胞的生物活性，阻碍组织的生长。近年来发展的固态发泡技术利用高压气体(C02，N2)在材料中的渗透和高温膨胀物理发泡来生产微孔泡沫，是物理变化过程不改变材料的分子量和分子结构，而且不需要任何有机溶剂或发泡剂，因此降低了毒性残留对细胞生长的影响，提高了材料的生物兼容性。虽然固态发泡技术不使用有机溶剂，可获得具有一定机械特性的支架材料，但组织工程支架原材料(如聚乳酸PLA)在固态起泡过程中，形成包含(X)2的密闭气泡，通透性不好，这会降低组织细胞的生长速度和延长支架材料的降解吸收时间。目前提高组织工程支架材料通透性的方法主要是通过改变不同聚合物的聚合比例、改变支架材料的泡孔大小以及支架材料的孔隙率来改善支架材料的通透性。一旦制作完成后，支架材料通透性将无法改变，同时材料的力学特性和通透性之间的平衡关系也难以控制，因此支架材料的制作过程难以精确控制。
发明内容
本发明针对组织工程支架材料制作中有机溶剂毒性残留和通透性不可控问题，提供了一种纯物理过程的通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，可以通过制作过程的参数控制来有效调节组织工程支架材料的机械强度、泡孔大小、通透性以及降解时间， 满足不同器官组织支架的需要，改进组织工程支架材料的制作技术，促进组织工程支架材料在组织工程中的实际应用。为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案为
通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，包括以下步骤 (1)建立CO2固态发泡饱和加压装置，将需要加工的可降解组织支架原材料放入压力容器内，将(X)2钢瓶内的高压气体进入到压力容器内，通过(X)2的自身压力对原材料进行加压， 让高压(X)2气体渗透到原材料内而形成过饱和均相发泡核；
3(2)通过气阀来调整压力容器内的CO2饱和压力，加压足够长的时间保证原材料内部形成均勻分布的(X)2发泡核；
(3)取出过饱和原材料，在常温常压下进行解吸附，让过多的气体溢出，使材料内外的均相发泡核达到平衡；
(4)将解吸附后的原材料放入到恒温水浴中，在大于原材料的玻璃化转换温度下进行高温发泡，让(X)2气体膨胀而形成组织支架闭孔泡沫材料；
(5)将固态发泡所制备的支架闭孔泡沫材料放入功率超声装置中，超声信号通过超声探头输出，经过水的耦合和传播，作用在支架闭孔泡沫材料表面，利用脉冲功率超声的机械振动和空化效应以及微射流能量，来打破支架材料的泡孔壁，增强泡孔的连通性，提高组织工程支架材料的通透性；
(6)通过控制超声的信号占空比来控制输出超声功率，来控制泡孔壁的破裂程度，从而调节组织工程支架材料加工的通透性，而达到控制降解速度的目标；
(7)建立超声插入取代测量系统在计算机的控制下，函数信号发生器输出脉冲超声信号，经过宽带功率放大器放大后激发发射换能器，产生的超声信号经过水浴锅中水的传播被接收换能器接收，经过前置放大器放大后被数字示波器采集并记录到计算机中；在超声测量中通过插入组织工程支架材料前后接收超声信号的采集和声压计算，可以获得不同传播时间上的声强，通过计算可以得到被测材料中的超声衰减系数；利用超声衰减系数和超声强度以及组织支架材料的通透性之间的对应关系，可以估计加工中需要的超声强度，并对材料的通透性进行评估，从而指导加工技术中脉冲占空比和超声功率的选择，实现组织工程支架材料通透性的精确加工。上述步骤(1)中，组织工程支架材料常用生物可降解高分子复合材料来进行制作， 包括PLA、PGA、PLLA、PGLA、PDLLA等，其中PLA是从粮食中提取，具有良好的生物可降解性和生物可吸收性，是一种较为常用的组织工程支架材料。所述固态发泡饱和加压装置中，压力容器可以使用恒温压力反应釜，钢瓶可以采用医用CO2钢瓶，其压力从大气压(0. 1 MPa) 至70大气压(7 MPa)可调，在压力较低时可以通过提高温度来增加(X)2的压力。在步骤(2) CO2饱和加压中，饱和压力影响发泡核的数量，决定发泡材料的泡孔密度。饱和加压时间随着压力的增加而减小，加压时间要大于[100/饱和压力(MPa)]小时， 但是过长的时间会因为材料内的气体趋向饱和而对发泡的影响甚微。步骤(3)的解吸附过程在制作中有重要作用，解吸附时间过长会使饱和加压的(X)2 气体弥散而不能发泡，时间过短则会使材料外侧的膨胀系数大于内部，产生泡孔孔径的差距过大，形成材料特性的不均勻，影响实际的应用。常温空气中解吸附20-30分钟比较合适。步骤(4)中，发泡温度影响每一个发泡核的膨胀系数，决定泡孔的大小。温度越高，产生的泡孔越大。一般使用超过原材料玻璃化转换温度的水温就可以发泡，实验中使用 90-100°C的水来发泡。也可以使用高温油或者气体来获得更大的泡孔孔径。功率超声使用40 kHz的脉冲信号，输出最大功率800 W，占空比1 1，超声强度在0%至100%调节，作用时间3分钟。在不同功率的作用下，组织支架材料的通透性不同 (0-10-V),(超声强度*作用时间)的数值越大，组织支架材料的通透性越大。但是在连续超声的作用下，组织支架材料的泡孔壁的破损程度较小，通透性较差。
在组织支架材料的通透性超声测量和评估中，由于超声衰减随着泡孔孔径的增加而增加，在大孔材料中(直径大于100 μ m)信号的衰减很大，因此需要选择较低频率的超声信号进行测量，经实验测量后500 kHz的超声信号比较合适。本发明的加工技术将固态发泡技术和超声空化相结合，具有以下优点
1.固态发泡过程是一个物理过程，使用无毒的(X)2气体，不使用任何的有机溶剂，不存在化学残留影响材料的生物兼容特性和生物吸收性。2.通过固态发泡过程中的(X)2饱和压力和温度的控制，可以获得具有不同孔径分布和不同机械强度的支架材料，形成三维的组织细胞的生长和附着支架，满足不同器官组织支架的需求。3.超声加工是物理过程，不使用任何有机溶剂，安全无毒。瞬时小范围的超声空化产生的高温高压可以从微观上打破泡孔壁，其大小从nm到μ m，可以基本保持支架材料的机械特性，同时满足不同细胞生长所需要的通透空间。4.通过功率控制能加工制备具有不同通透性的组织工程支架材料，可以在保证支架材料机械强度的前提下有效调节组织细胞生长速度和支架材料的降解吸收速度，满足不同器官组织的应用要求。5.超声插入取代检测法进行组织支架材料通透性的测量，不使用高压气体和任何有机溶剂，对被测材料没有任何的损伤，测量速度快，是一种安全高效的测量方法。
图1是本发明采用的组织工程支架材料的固态发泡装置图(a)饱和加压装置， (b)高温发泡装置。其中，1-1 压力容器；1-2 :0)2气体钢瓶；1-3 恒温水浴；1-4 组织支架闭孔泡沫材料。图2是本发明采用的组织工程支架材料通透性的功率超声装置。其中，2-1 超声电源；2-2 装置支架；2-3 超声探头；2-4 水浴锅；2-5 组织工程支架材料。图3是本发明采用的组织工程支架材料通透性的超声插入取代测量系统。其中， 3-1 计算机；3-2 信号发生器；3-3 宽带功率放大器；3-4 数字示波器；3_5 前置放大器； 3-6 水浴锅；3-7 发射换能器；3-8 接收换能器；3-9 滑轨支架；3_10 组织工程支架材料。图4是本发明实施例中PLA固态发泡后的电镜图像。图5是本发明实施例中PLA固态发泡制备泡沫材料的截面电镜图像。图6是实施例中不同饱和压力下PLA固态发泡孔径分布的曲线图。图7是采用不同功率脉冲超声加工后的支架材料的通透性电镜图。图8是闭孔PLA泡沫材料的衰减系数和泡孔孔径的关系测量结果图。图9是支架材料的衰减系数和超声功率之间的关系结果图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。本发明解决超声加工技术问题的思路是(1)根据组织工程支架材料的基本要求，针对化学法发泡制作存在的溶剂残留的毒性问题，利用(X)2固态发泡技术对可降解支架原材料进行物理发泡，获得具有一定机械强度和泡孔孔径分布的闭孔泡沫材料；(2)针对闭孔组织工程支架材料存在的通透性差，细胞生长代谢缓慢，降解时间长且不可控等问题， 通过脉冲功率超声的超声空化和微射流来打破组织工程支架材料的泡孔壁，增强泡孔的连通性，在保证支架材料机械强度的前提下提高组织工程支架材料的通透性，促进细胞的生长和支架材料的吸收；(3)通过加工过程中的脉冲超声的占空比控制可以调整超声功率的强度，能够有效调节组织支架材料的通透性，促进组织细胞的再生，控制组织支架的降解速度，以满足不同器官组织支架的应用需求；(4)利用超声插入取代测量技术进行支架材料衰减系数的测量，并进行组织支架材料通透性的评估，得到超声衰减系数和材料的通透性 (超声强度)之间的关系，可以通过衰减系数的测量来估计材料的通透性，从而指导加工技术中脉冲占空比和超声功率的选择，实现组织工程支架材料通透性的精确加工。本实施例中制备通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术具体如下 1.在技术的实施过程中选用PLA材料进行加工。PLA是由乳酸在适当条件下脱水缩合而成，常温下为无色或淡黄色透明物质，可溶于氯仿、二氯甲烷等极性溶剂中，而不溶于脂肪烃、乙醇、甲醇等非极性溶液中，易水解，具有良好的生物降解性，相容性及可吸收性。乳酸具有旋光性，存在聚右旋乳酸(PDLA)、聚左旋乳酸(PLLA)和聚消旋乳酸(PDLLA)等几种。PLA的强度和热稳定性随分子量的增大而提高，当分子量低于2500时，在生理食盐水中浸泡几周即可分解，强度很小，实用价值不大； 当分子量在10万以上时，不易分解，可作为强度材料；当分子量在100万以上时，即使放置在空气中1年以上，也不会发生变化，材料强度大大提高。PLA的生物相容性与可降解性良好，它在人体内代谢的最终产物是CO2和H2O,乳酸也是体内正常糖代谢的中间产物，显示出优异的可生物降解吸收性。例如，用PLA制成的可吸收缝合线在伤口愈合后无需拆线，在国内外已广泛使用。PLA是继PGA(聚乙醇酸)后获得美国食物药品管理局(FDA)批准的可用于人体的聚合物材料，被称为“公认安全的产品”，可用作医用手术防粘连膜，注射用微胶囊、微球，埋植剂、缓释制剂的辅料，人体内固定装置例如骨板、骨钉、手术缝合线等。本发明实施中使用的左旋PLA原料从深圳市易生新材料有限公司购得，密度 1. 25g/cm3,玻璃化转变温度60-65°C，熔化温度175_185°C。片材原料厚度0. 4 mm,颗粒状原料呈圆柱形，直径2. 5 mm,高度3. 0 mm。医用(X)2钢瓶购置于南京特种气体厂，在室温下的压力最大约为7 MPa02.制作过程中把片状PLA透明材料裁剪成2(^20mm的正方形、PLA颗粒保持不变， 将它们分组放入到压力容器中1-1进行加压。3.分别调节CO2气体钢瓶1-2的饱和压力为2,2. 5、3、3· 5、4、4· 5和5 MPa，在足够时间的饱和加压后，取出PLA材料分别放入到90，95和100°C的恒温水浴锅1_3中进行高温发泡，完成闭孔组织工程支架微孔材料的制作。4.原来无色透明的PLA原材料经过发泡后变为白色不透明的微孔泡沫。饱和气压越高，微孔泡孔越致密。5.将制作的闭孔材料放置到扫描电子显微镜中进行拍照，图4显示了材料的表面微结构。图5 (a)和(b)分别是饱和压力为2和4 MPa、发泡温度95°C条件下制备的PLA 支架材料的截面电镜图，可以看出饱和气压越高，其泡孔密度越大，泡孔孔径越小。
6.利用计算机图像处理技术和ImageJ软件对电镜图像进行测量和平均计算，获得组织支架材料的孔径大小和饱和压力的关系(图6)，可见泡孔孔径和饱和压力成像指数衰减关系，压力越小，泡孔孔径越小，泡孔密度越大。7.为了提高闭孔PLA泡沫材料的通透性，将发泡得到的材料放置到图2的装置中， 调节超声电源2-1输出40 kHz的脉冲超声信号，信号占空比3:3，PLA支架泡沫材料的每一面作用时间3分钟。8.调节超声电源2-1从0%至100%调整输出超声强度，将超声信号通过超声探头 2-3输出，经过水的耦合和传播，在PLA支架泡沫材料表面，由于水中气泡的空化作用所产生的高温高压和微射流能量的作用，PLA支架泡沫材料的泡孔壁由外向内被打破，增强了泡孔的连通性，提高了组织支架材料的通透性。9.将超声加工后具有通透性的PLA泡沫材料放置到扫描电子显微镜中拍照，可以看到在不同超声强度的作用下，泡孔壁破损程度不同，其通透性有相应的不同。图7 (a)到 (f)依次给出了分别经过0%，30%, 50%, 70%, 90%和100%超声强度辐射的PLA发泡材料的表面显微结构电镜图。从材料表面的破损程度可以看出在超声功率小于30%只会在少量泡孔上形成小裂纹，随着超声辐射的增强，泡孔裂纹增大变多；当超声功率达到70%时几乎所有泡孔都有较长的裂纹和破损；当超声功率达到90%时出现泡孔泡壁撕裂现象，甚至出现空洞；在100%超声功率作用下，几乎所有泡孔的泡壁都被撕裂，出现大量的空洞。可以说明随着超声辐射强度的增加，PLA发泡材料的破裂泡孔数量增加，而且破裂程度也随之增大，因此通透性也随之增强。10.将组织支架PLA泡沫材料放置到图3所示的超声测量系统中进行测量，在计算机3-1的控制下，函数信号发生器3-2输出500 kHz的脉冲超声信号(1周期，1 kHz的重复率)，经过宽带功率放大器3-3放大后激发发射换能器3-7，产生的超声信号经过水浴锅3-6 中水的传播被接收换能器3-8接收，经过前置放大器3-5放大后被数字示波器3-8采集并记录到计算机3-1中。11.实验测量中，先通过声波在水中传播后被采集的波形，计算出水中的传播时间和传播声压；然后将组织工程支架材料插入到换能器中间，采集声传播波形，分析PLA支架材料不同表面上的声透射和声反射信号，计算出声传播的时间和衰减特性。12.图8给出了不同泡孔孔径的闭孔PLA支架材料的衰减系数，可见泡孔孔径越大，组织支架PLA材料的衰减系数越大。13.将相同泡孔孔径的闭孔组织支架材料经不同强度的脉冲超声作用后，其衰减系数和超声强度的关系如图9所示。可见相同泡孔孔径的PLA支架材料的衰减系数和超声辐射强度基本呈现线性增大的关系。14.当泡孔较小时，超声作用下的泡孔裂纹较小，水很难进入到泡孔内部，其衰减系数随着超声辐射强度的增强而提高。本发明利用脉冲功率超声空化效应所产生的高温高压和微射流能量来打破组织支架材料的泡孔壁，提高泡沫泡孔的连通性，从而实现具有不同通透性组织工程支架材料的精确加工，是一种安全的组织工程支架材料的超声加工新技术。通过加工条件的控制可以实现不同孔径分布、不同机械强度、不同通透性乃至不同降解特性组织工程材料的制作， 具有良好的机械特性和生物兼容性，满足不同器官组织支架的应用要求，可以广泛应用到生物医学工程和组织工程等领域，对人体器官的修复具有重要的意义，具有广阔的应用前景和良好的市场前景。
权利要求
1.通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，其特征在于包括以下步骤(1)建立CO2固态发泡饱和加压装置，将需要加工的可降解组织支架原材料放入压力容器内，将(X)2钢瓶内的高压气体进入到压力容器内，通过(X)2的自身压力对原材料进行加压， 让高压(X)2气体渗透到原材料内而形成过饱和均相发泡核；(2)通过气阀来调整压力容器内的CO2饱和压力，加压足够长的时间保证原材料内部形成均勻分布的(X)2发泡核；(3)取出过饱和原材料，在常温常压下进行解吸附，让过多的气体溢出，使材料内外的均相发泡核达到平衡；(4)将解吸附后的原材料放入到恒温水浴中，在高于原材料的玻璃化转换温度下进行高温发泡，让(X)2气体膨胀而形成组织支架闭孔泡沫材料；(5)将固态发泡所制备的支架闭孔泡沫材料放入功率超声装置中，超声信号通过超声探头输出，经过水的耦合和传播，作用在支架闭孔泡沫材料表面，利用脉冲功率超声的机械振动和空化效应以及微射流能量，来打破支架材料的泡孔壁，增强泡孔的连通性，提高组织工程支架材料的通透性；(6)通过控制超声的信号占空比来控制输出超声功率，从而控制泡孔壁的破裂程度；(7)建立超声插入取代测量系统在计算机的控制下，函数信号发生器输出脉冲超声信号，经过宽带功率放大器放大后激发发射换能器，产生的超声信号经过水浴锅中水的传播被接收换能器接收，经过前置放大器放大后被数字示波器采集并记录到计算机中；在超声测量中通过插入组织工程支架材料前后接收超声信号的采集和声压计算，可以获得不同传播时间上的声强，通过计算可以得到被测材料中的超声衰减系数；利用超声衰减系数和超声强度以及组织支架材料的通透性之间的对应关系，可以估计加工中需要的超声强度，并对材料的通透性进行评估。
2.根据权利要求1所述的通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，其特征在于所述步骤(1)中的压力容器采用恒温压力反应釜；(X)2钢瓶采用医用(X)2钢瓶，其压力从0. 1 MI^a至7 MI^a可调；组织支架原材料采用生物可降解高分子复合材料，包括PLA、PGA、 PLLA、PGLA、PDLLA 等。
3.根据权利要求1所述的通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，其特征在于所述步骤(2)中(X)2饱和加压时间大于[100/饱和压力(MPa)]小时。
4.根据权利要求1所述的通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，其特征在于所述步骤(3)中解吸附过程的时间为20-30分钟。
5.根据权利要求1所述的通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，其特征在于所述步骤(4)中采用温度为90-100°C的水来发泡，也可以使用高温油或者气体。
6.根据权利要求1所述的通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，其特征在于所述步骤(5)中功率超声使用40 kHz的脉冲信号，输出最大功率800 W，占空比1:1， 超声强度在0%至100%调节。
7.根据权利要求1所述的通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术，其特征在于所述步骤(7)中，对于孔径大于100 μ m的大孔材料，采用较低频率500 kHz的超声信号进行测量。
全文摘要
本发明公开了一种通透性可控的组织工程支架材料的超声加工技术。基于组织工程支架材料的要求，针对化学发泡制作技术存在的溶剂残留的毒性问题，利用CO2固态发泡技术对生物可降解材料进行物理发泡，获得具有不同孔径分布和机械强度的闭孔支架材料；针对闭孔支架材料存在的通透性差等问题，通过脉冲功率超声的超声空化和微射流能量来打破组织工程支架材料的泡孔壁，增强泡孔的连通性；同时通过调节加工过程中脉冲超声的占空比可以调节支架材料的通透性来实现降解速度的控制；利用超声插入取代测量技术进行支架材料衰减系数的测量，通过衰减系数的测量来估计材料的通透性，并指导加工技术中脉冲占空比和超声功率的选择与控制。
文档编号B29K67/00GK102441994SQ201110286968
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者郭各朴, 马青玉 申请人:南京师范大学