专利名称：从诺卡氏菌制备的一种生物絮凝剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及诺卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11制备的一种新型生物絮凝剂REA-11，属于微生物制剂技术领域。
生物絮凝剂是微生物在发酵过程中产生的一种新型、高效水处理药剂。与传统的化学合成絮凝剂相比，生物絮凝剂具有应用安全性高、无二次污染、来源广等独特的优越性，因而近年来，随着人们环保意识和健康意识的逐渐增强，生物絮凝剂的研究受到国内外环境工程学者的重视，大有取代化学合成絮凝剂之势。目前已发现的絮凝剂产生菌来源广泛，涉及细菌，放线菌，酵母菌和霉菌。不同的微生物在不同的发酵条件下能够合成不同种类的生物絮凝剂，目前已鉴定的生物絮凝剂大多为机能性多糖和机能性蛋白类物质，或者几种有机组分的复合体如糖蛋白，蛋白聚糖，脂蛋白等，另外还有极少数生物絮凝剂属于DNA类物质。Nakamura从Aspergillus sojae AJ7002的发酵液中提取到一种絮凝剂，该絮凝剂是一种以半乳糖胺为主的氨基糖和蛋白质的复合体(Nakamura J.,Miyashiro S.,Hirose Y.,Agri.Biol.Chem.,1976,40(3):619-624)；Levy发明了从Cyanobacterium phrmidium sp.J1合成的一种硫酸酯化的杂多糖生物絮凝剂F-J1，其主要成分为糖醛酸，鼠李糖，甘露糖及半乳糖(Levy N.,Baror Y.,Magdassi S.,Colloids andSurfaces,1990,48:337-349)；Alcaligenes cupidus KT201代谢产生的Al-201是一种以42.5％葡萄糖、36.38％半乳糖、8.52％葡萄糖醛酸和10.3％乙酸为主要组成的生物絮凝剂(Toeda K.,Kurane R.,Agric.Biol.Chem.1991,55(11):2793-2799)；Paecilomyces sp.I-1产生的PF-101.絮凝剂是由氨基半乳糖以α-1,4糖苷键相连而成的粘多糖(Levy N.,Baror Y.,Magdassi S.,Colloids and Surfaces,1990,48:337-349)；M.Watanabe则报道了一种能产生DNA类絮凝剂的菌株Rhodovulum sp.PS88(M.Watanabe,K.Sasaki,Y.Nakashimada,T.Kakizono,N.Noparatnaraporn,N.Nishio,Appl.Microbiol.Biotechnol.1998,50(6):682-691)；日本的Kurane等人对Rhodococcus erythropolis S-1(原Nocardia菌属)产生的絮凝剂NOC-1进行了较为深入的研究，囊括菌种筛选，培养条件优化，絮凝物质的分离纯化及其应用，Takeda et al.曾利用正丁醇-硫酸铵法将Rhodococcus erythropolis S-1产生的活性物质从发酵液中分离出来，鉴定为蛋白质性质的絮凝剂NOC-1(M.Takeda,R.Kurane,J.Kiozumi,I.Nakamura,Agric.Biol.Chem.1991,55(10):2663-2664)；其后，Kurane却从同一株菌的同样条件的培养液中利用丙酮萃取法得到脂类絮凝剂，并对其脂质结构进行了详细鉴定(R.Kurane.K.Hatamochi,T.Kakuno,K.Klyohara,K.Kawaguchi,Y.Mizuno,M.Hirano,Y.Taniguchi,Biosci.Biotech.Biochem.1994,58(11):1977-1982)。目前发现的生物絮凝剂大都由于产量低，絮凝活性弱，生产成本高而限制了其在实际中的推广应用。
本发明的目的是选育一种从诺卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11制备的生物絮凝剂REA-11，本发明产品是具有较强絮凝活性的新型生物絮凝剂，通过对其分子结构分析，为设计育种和代谢调控奠定理论基础，同时为生物絮凝剂的实际推广应用提供条件，加快生物絮凝剂的工业化进程。
本发明的具体操作步骤如下1．菌种诺卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11，自土壤中筛选得到(已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO.M201005)(1)菌种筛选方法筛选培养基(gL-1)蔗糖10，酵母膏0.5，尿素0.5,KH2PO40.1,K2HPO40.1,NaCl0.1,MgSO4·7H2O0.2，琼脂20,pH8.0发酵培养基(gL-1)蔗糖10，酵母膏0.5，尿素0.5,KH2PO42,K2HPO45,NaCl0.1,MgSO4·7H2O0.2,pH8.0培养条件为150转/分，28℃振荡培养2～3天后，检测发酵液的絮凝活性。
初筛方法取1mL发酵液加至装有40mL高岭土溶液和2.5mL1％CaCl2的50mL刻度试管中，用蒸馏水定容至刻度，混匀后，静置片刻，目测高岭土溶液的絮凝情况，挑选高絮凝活性产生菌株作为复筛菌株。
复筛方法从斜面上各取一环菌，接于发酵培养基中，每株3瓶，28℃,150转/分振荡培养2～3天，检测发酵液的絮凝活性，挑选高絮凝剂合成菌株。
(2)菌种特征菌落无气生菌丝，质地柔软、白色、粘稠；液体培养基中呈短杆状，八字型或平行排列，培养后期，产生少量淡黄色素，同时菌体成为类球状或极短小的杆状；能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乙酸钠和琥珀酸盐生长良好；能利用硝酸盐、柠檬酸盐、乳糖和淀粉生长；基本不能利用亚硝酸盐和甲酸盐生长。
能液化明胶，部分抗酸，不水解淀粉。
2、发酵工艺液体发酵培养基组成(gL-1)蔗糖10，玉米浆0.5，尿素0.5,KH2PO40.1,NaCl0.1,MgSO4.7H2O0.2(3)以1％蔗糖为碳源时能制备具有较高活性的生物絮凝剂REA-11；(4)玉米浆和尿素以1∶1(质量比)复配作为培养基氮源时能制备具有较高活性的生物絮凝剂REA-11；(5)液体发酵条件为25～30℃(最佳28℃)，培养基初始pH4.0～10.0(最佳6.0)，摇床转速120～150转/分(最适120转/分)振荡培养48小时。
3、生物絮凝剂REA-11的提取(6)发酵液离心，条件为6000～10000转/分，离心20分钟除去发酵液中的菌体细胞和固形物得到上清液；(7)向(6)得到的离心上清液中加入3倍体积的乙醇，4℃静置6小时后，7000转/分离心10分钟，得到沉淀物；(8)蒸馏水溶解(7)得到的沉淀，以聚乙二醇(PEG-20000)浓缩至原发酵液体积的1/10，利用DEAE离子交换柱进行纯化，得到活性洗脱液；(9)收集(8)得到的活性洗脱液，浓缩后，利用凝胶柱SephadexG-100作进一步处理，得到凝胶柱处理活性洗脱液；(10)收集(9)得到的凝胶柱处理活性洗脱液，以乙醇沉淀并洗涤；(11)蒸馏水溶解(10)得到的沉淀，利用制备高压液相色谱柱Superdex200 HR10/30进行活性物质的精制处理，即得产品REA-11。
4、生物絮凝剂的组分鉴定(12)利用高压液相、气相色谱、质谱等分析测试手段，结合特征化学反应，对精制得到的REA-11进行组成鉴定，结果表明，由Nocardia sp.WSH-A11制备的生物絮凝剂REA-11是一种以半乳糖醛酸为主体的酸性多糖，其分子中还含有极微量的蛋白组分，协助维持该生物大分子的絮凝活性。REA-11的GC-MS鉴定图谱如附
图1、附图2-1和附图2-2所示。
从土壤中筛选获得的絮凝剂产生菌——Nocardia sp.WSH-A11，能以蔗糖、玉米浆、尿素等廉价原料为发酵基质制备具有较高絮凝活性的生物絮凝剂REA-11，降低了生产成本。通过对REA-11的提取精制，并进而进行结构鉴定，发现REA-11为一种以半乳糖醛酸为主体的蛋白聚糖类新型生物絮凝剂，目前国内外尚未见到此类生物絮凝剂的报道。以上发现为指导设计育种和通过代谢调控优化发酵条件提高产量奠定了基础，亦为降低生物絮凝剂的生产成本提供了可能，促进了生物絮凝剂在工业生产中的实际应用进程。
以下实例更为详细地解释了本发明中的某些关键点，为更好地理解本发明提供了依据。
实施例1分别选取几种不同的碳源，在其他发酵工艺(如说明书所述)相同的情况下进行生物絮凝剂的发酵制备，结果如表1表1碳源对菌体生长及生物絮凝剂制备的影响碳源 絮凝率/％菌体干重/gL-1葡萄糖851.62果糖 85.3 1.58蔗糖 90.5 1.62乳糖 23.3 0.34淀粉 00.31乙酸钠43.3 1.63乙醇 9.5 1.19结果显示以蔗糖为碳源时，菌体生长良好(菌体干重)，絮凝活性(絮凝率)较高，而产品成本较低。
实施例2以1％的蔗糖为发酵培养基的碳源，分别选择不同的有机氮源与尿素按1∶1(质量比)复配，在其他发酵工艺(如说明书所述)相同的情况下，进行生物絮凝剂的发酵制备，结果如表2表2复合氮源对菌体生长及生物絮凝剂制备的影响氮源 絮凝率/％ 菌体干重/gL-1尿素53.31.08酵母膏+尿素 88.23 1.63牛肉膏+尿素 65 1.01胰蛋白胨+尿素87.82 1.45蛋白胨+尿素 89.93 1.40豆饼粉+尿素 69.27 1.66玉米浆+尿素 91.89 1.70结果显示，玉米浆和尿素以1∶1(质量比)复配作为发酵培养基的氮源时，菌体生长良好(菌体干重)，絮凝活性(絮凝率)亦较高，而产品成本较低。
权利要求
1.从诺卡氏菌制备的一种生物絮凝剂，本发明特征为以诺卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11为絮凝剂产生菌，以蔗糖为碳源，玉米浆和尿素复配为氮源时能制备一种新型生物絮凝剂REA-11，(1)菌种诺卡氏菌(Nocardia sp.)WSH-A11(已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO.M201005)(2)发酵工艺液体发酵培养基组成(gL-1)蔗糖10，玉米浆0.5，尿素0.5,KH2PO40.1,NaCl 0.1,MgSO4·7H2O 0.2a．以蔗糖为碳源时能制备具有较高活性的生物絮凝剂REA-11；b．玉米浆和尿素复配为氮源时能制备具有较高活性的生物絮凝剂REA-11；c．液体发酵条件为25～30℃(最佳28℃)，培养基初始pH4.0～10.0(最佳6.0)，摇床转速120～150转/分(最适120转/分)振荡培养48小时；(3)生物絮凝剂REA-11的提取d．发酵液离心，得到离心上清液；e．向(d)得到的离心上清液中加入三倍体积的乙醇，离心，得到沉淀物；f．蒸馏水溶解(e)得到的沉淀，利用离子交换柱处理，得到活性洗脱液；g．收集(f)得到的活性洗脱液，浓缩后，利用凝胶柱处理，得到凝胶柱处理活性洗脱液；h．收集(g)得到的凝胶柱处理活性洗脱液，以乙醇沉淀并洗涤；i．蒸馏水溶解(h)得到的沉淀，利用制备高压液相色谱柱作进一步精制处理，即得产品REA-11；(4)生物絮凝剂的组分鉴定j．利用高压液相、气相色谱、质谱等分析测试手段，结合特征化学反应，对产品REA-11进行组成鉴定。
2.按权利要求1所述制备的生物絮凝剂，其特征为Nocardia sp.WSH-A11，在以1％蔗糖为碳源的培养基中能制备具有较高絮凝活性的生物絮凝剂。
3.按权利要求1所述制备的生物絮凝剂，其特征为Nocardia sp.WSH-A11，在玉米浆和尿素以1∶1(质量比)复配作为发酵培养基的氮源时能制备具有较高絮凝活性的生物絮凝剂。
4.按权利要求1所述制备的生物絮凝剂，为纯化生物絮凝剂REA-11，其特征为所述离心条件为6000～10000转/分，离心20分钟得到上清液。
5.按权利要求1和4所述制备的生物絮凝剂，为纯化生物絮凝剂REA-11，其特征为向离心上清液中加入3倍体积的乙醇，4℃静置6h后，7000转/分离心10分钟，得到沉淀物。
6.按权利要求1和5所述制备的生物絮凝剂，为纯化生物絮凝剂REA-11，其特征为蒸馏水溶解乙醇沉淀物后，以聚乙二醇(PEG-20000)浓缩至原发酵液体积的1/10，利用DEAE离子交换柱进行纯化，得到活性洗脱液。
7.按权利要求1和6所述制备的生物絮凝剂，为纯化生物絮凝剂REA-11，其特征为从DEAE柱中得到的活性洗脱液，通过的凝胶柱为Sephadex G-100。
8.按权利要求1和7所述制备的生物絮凝剂，为纯化生物絮凝剂REA-11，其特征为从Sephadex G-100得到的活性洗脱液，经乙醇沉淀并洗涤后，通过的制备高压液相色谱柱为Superdex 200 HR10/30。
9.按权利要求1所述制备的生物絮凝剂，为鉴定REA-11的分子组成，其特征为Nocardia sp.WSH-A11制备的生物絮凝剂REA-11是一种以半乳糖醛酸为主体的酸性多糖，其分子中还含有微量蛋白组分，协助维持生物大分子的絮凝活性。
全文摘要
本发明公开了从诺卡氏菌制备的一种生物絮凝剂,属于微生物制剂技术领域。诺卡氏菌(Nocardia sp.)WSH－A11在以蔗糖为碳源,玉米浆和尿素复配为氮源的发酵培养基中能够制备具有较高絮凝活性的新型生物絮凝剂REA－11。该生物絮凝剂是一种以半乳糖醛酸为主要组分的蛋白聚糖。本发明为指导设计育种和实现代谢调控奠定了基础,推动了生物絮凝剂的工业化进程。
文档编号C02F3/34GK1322681SQ0110804
公开日2001年11月21日 申请日期2001年1月11日 优先权日2001年1月11日
发明者陈坚, 何宁, 李寅, 伦世仪 申请人:无锡轻工大学