专利名称：一种可降解去除水华中微囊藻毒素的微生物的制作方法
技术领域：
本发明专利申请涉及一种我们筛选的微生物菌种(Ralstonia solanacearum，简称RS菌)及酶制剂降解去除微囊藻毒素(Microcystins，简称MC)的方法，其特征是用培养的RS菌及制备的酶制剂作为一种快速、安全和高效的生物催化剂，按一定比例投加入受MC污染的水体后，使MC得到高效降解去除的方法。属于生物技术领域。
水体富营养化是指湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生变化，导致藻类特别是蓝藻的异常繁殖生长而出现的蓝藻水华现象。当水华污染严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味，不仅破坏了健康平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。目前，世界上淡水湖泊蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现迅猛的增长趋势，发生的地点遍布全球各地。欧洲、非洲、北美洲和南美洲分别有53、28、48和41％的湖泊存在不同程度的富营养化现象，亚太地区54％的湖泊处于富营养化状态，我国目前60％左右的湖泊存在不同程度的富营养化现象。自1878年首次报道了动物由于饮用含蓝藻的水而死亡以来，国内外因藻毒素引起的水生动物、鸟类、畜类甚至人类死亡的事件频繁发生。如何控制蓝藻水华污染现象和有效去除藻毒素是摆在我国乃至世界面前的一个环境科学难题。
蓝藻水华污染所带来的主要危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素，其中MC是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。研究结果显示MC的主要靶器是肝脏，主要表现为使肝脏充血肿大，严重时可导致肝出血和坏死。MC致毒机理是通过抑制肝细胞中蛋白磷酸酶的活性，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，导致哺乳动物肝细胞微丝分解、破裂和出血。另据调查发现，饮用水中MC的存在与人群中原发性肝癌和大肠癌的发病率有很大的相关性。
虽然微生物降解是去除MC的一条非常有前途的方法，但MC的环状结构和间隔双键具有相当的稳定性，一般的多肽分解酶不能对MC进行分解，只有一些特殊的微生物菌种才具备对MC的降解能力，这也是MC在天然水体中能够存在很长时间的一个重要原因。我国学者采用序批式生物膜反应器对3种类型MC进行降解的实验显示，混合菌对MC有一定的降解能力，对MC的降解好氧条件好于厌氧条件，但在3d内MC的去除量都低于400μg/l。日本学者发现从天然水体中分离出的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)对MC-LR和RR 2种类型的MC有降解能力，其中鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)对MC-RR和LR的降解速率分别达到每天13.0和5.4mg/l，这是目前世界上报道的最大MC生物降解速率。澳大利亚学者研究了鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)对MC-LR的降解途径，发现至少有3种微囊藻毒素酶(microcystinase)参与了MC-LR的催化降解反应，并将对应的基因进行了克隆和分子特点识别。尽管还有其它国外学者在纯菌种和混合菌对MC的可降解性进行了研究，但我国在利用纯菌种高效降解MC的方面还未见有文献报道。因此筛选出具有我国自主知识产权，可高效降解去除MC的微生物新菌种，无论在基础研究还是应用开发方面都具有非常重要的意义。本发明专利的内容包括1、在生物降解MC的研究工作中，我们分离出了能够降解MC的微生物纯菌种，经中科院微生物研究所鉴定为Ralstonia solanacearum(RS菌)。研究发现此菌种在3d时间内可将初始浓度分别为50.2和30.1mg/l的MC-RR和LR全部降解，日平均降解MC-RR和LR的速率分别高达16.7和9.4mg/(
图1)，远高于国外最新报道的日降解MC-RR和LR速率13.0和5.4mg/l的水平。同时，国内外未发现有RS菌降解MC的研究报道。图1 Ralstonia solanacearum菌降解MC-RR和LR的动力学过程2、离心收获批量培养3天的RS菌细胞，加入到含MC-RR和LR的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)后，RS菌降解去除MC的过程显示，随着初始RS菌细胞干重浓度的增加，降解去除MC的速度加快，在细胞初始干重浓度为0.05g/l及以上时，在24小时内可将初始分别为51.5和29.5mg/l的MC-RR和LR全部降解去除(图2和3)。图2 Ralstonia solanacearum菌不同细胞干重浓度对MC-RR的降解去除图3 Ralstonia solanacearum菌不同细胞干重浓度对MC-LR的降解去除3、用超声波振荡破碎培养的RS菌细胞后，经18000转/分高速离心20分钟后，取上清液既RS菌的无细胞提取液(TOC＝47.3mg/l)作为酶制剂，分别加入到含MC-RR和LR的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。HPLC图谱显示，反应仅20分钟就可以观察到MC-RR和LR的峰高明显地减少(图4和5)，同时各发现了一个酶催化降解的中间代谢产物A和C(图4和5)。图4 Ralstonia solanacearum菌酶催化降解MC-RR的HPLC谱5 Ralstonia solanacearum菌酶催化降解MC-LR的HPLC谱图我们进行的研究结果表明，无论是RS菌细胞还是RS菌无细胞提取液(酶)都对MC-RR和LR2种MC有很强的降解去除能力。本发明专利的实施例如下1、首先配制RS菌的生长培养基，其组成为(每升)MgSO47H2O 1.0g，KH2PO40.5g，K2HPO44.0g，NaCl 1.0g，CaCl220.0mg，FeSO45.0mg，ZnCl25.0mg，MnCl24H2O 5.0mg，CuCl20.5mg，添加MC-RR和LR初始浓度分别为500和300mg/l的蓝藻无细胞提取液100ml作为RS菌生长的碳源和氮源。此配制的培养基初始pH为7.5左右。用500毫升三角瓶加入配制好的液体培养基100毫升，将瓶口用脱脂棉封闭后在高温高压(124℃)下进行灭菌20分钟，然后在洁净工作台内紫外线照射下在灭菌20分钟。
2、在洁净工作台内无菌条件下，接种1毫升RS菌液于三角瓶培养基中，在温度30℃，摇床转速150转/分条件下进行批量培养3天后，采用离心后(12000转/分，10分钟)倒去上清液的方法收获RS菌细胞，最后将收获的RS菌细胞保存在0.5％的NaCl溶液中作为RS菌剂，如果暂时不用可放在-80℃低温冰箱中长期保存。
3、取RS菌细胞干重为1.3g/l的悬浊液20ml加入到50ml玻璃管中，将此玻璃管插入冰水中后，用超声波细胞破碎仪对RS菌细胞进行破碎，条件是间隔2秒，超声振荡10秒，破碎时间15分钟(每次5分钟)。细胞破碎完毕后，将细胞破碎液进行18000转/分20分钟的离心后，缓慢倒出上清液作为RS菌的无细胞提取液(酶制剂)，如果暂时不用也可放在-80℃低温冰箱中长期保存。
4、根据受蓝藻水华污染饮用水或其它水体中的MC浓度，将培养制备的RS菌及酶制剂作为一种快速、安全和高效的生物催化剂按一定比例进行投加，达到迅速高效降解去除MC的目的。
5、对于发现有MC存在的污水生物处理过程中，也可以按一定比例投加RS菌及酶制剂，使污水处理场去除MC的效率得到大幅度提高。
6、对于因MC污染而急性中毒的动物，可以探索通过口服RS菌酶制剂等方式进行抢救和解毒的应用途径。
综上所述，本发明是在筛选和培养Ralstonia solanacearum菌的基础上，利用RS菌及酶制剂作为一种生物催化剂高效去除蓝藻污染水体中MC的应用技术。在降解去除蓝藻水华所产生的MC污染方面具有非常重要的意义。
权利要求
1.一种采用Ralstonia solanacearum菌进行降解去除微囊藻毒素(Microcystins)的方法，其特征是将培养的Ralstonia solanacearum菌细胞或从Ralstoniasolanacearum菌细胞中提取制备的酶按一定比例投加入蓝藻水华污染水体后，达到快速、安全和高效降解去除微囊藻毒素的方法。
2.在权利要求第1项记载的方法中，Ralstoniasolanacearum菌的培养包括批量和发酵培养等任何培养方式。
3.在权利要求第1项记载的方法中，将Ralstoniasolanacearum菌细胞或制备的酶加载或固定在一定载体后进行应用的方法。
4.在权利要求第1项记载的方法中，将Ralstoniasolanacearum菌细胞或制备的酶应用于微囊藻毒素中毒动物的抢救和解毒。
全文摘要
利用1株微生物菌种(Ralstonia solanacearum，简称RS菌)高效降解去除微囊藻毒素(Microcystin)的方法，其特征是用培养的RS菌及制备的酶作为生物催化剂，按一定比例投加入受蓝藻水华污染的水体后，使微囊藻毒素得到快速高效降解去除的方法。另外，还可以将Ralstonia solanacearum菌细胞或制备的酶应用于因微囊藻毒素而引起中毒动物的抢救和解毒。在环境污染治理和生物医药的研究与应用方面具有重要意义。
文档编号C02F3/34GK1435383SQ0215646
公开日2003年8月13日 申请日期2002年12月18日 优先权日2002年12月18日
发明者阎海, 潘纲, 张明明 申请人:中国科学院生态环境研究中心