专利名称：异养硝化细菌，培养方法及其应用的制作方法
发明所属领域本发明属于微生物领域，具体地说，本发明涉及新的具有脱氮生物学活性的细菌，培养该类细菌的方法，可在水体中脱氮的含有该类细菌的组合物，及该类细菌在生物脱氮和筛选硝化抑制剂中的应用。
背景技术：
氮素是所有生命必须的营养元素，也是全球生态系统物质循环的重要组成部分。使用氮肥已经成为农作物特别是粮食作物高产、增产的主要手段。但氮肥的使用在大幅度提高作物产量的同时也带来了严重的环境问题如饮用水硝酸盐积累的不断增长、湖泊等封闭半封闭水域的富营养化、NH4+-NH3进入水体危害鱼贝等水产资源，以及温室气体之一的N2O不断排放加剧了大气温室效应和对臭氧层的破坏等。提高氮素利用率、降低氮肥损失并降低氮对环境的不良影响已经成为目前工农业生产和环境保护面临的一个巨大挑战。同时，氮素形态转化又与污水污泥脱氮效率、脱氮工艺的改良提高，水体富营养化的解决密切相关。目前解决水体的氮素富营养化有物理方法、化学方法和生物方法。随着氮素污染的不断加剧和人们对环境问题的日益重视，除氮技术，特别是生物脱氮技术已经成为控制水体污染的重要方向和手段。
氨氮是造成水体富营养化的主要氮素污染物之一。日前普遍认为，在生物脱氮过程中，废水中的氨氮首先被自养硝化菌在好氧条件下氧化为NOx-，然后NOx-在缺氧条件下被反硝化细菌还原为气态氮如N2等从水中逸出。硝化和反硝化既可在活性污泥反应器中进行，又可在生物膜反应器中进行，而实际应用最多的还是活性污泥法，硝化菌和反硝化菌处在同一活性污泥中。由于目前发现和使用的硝化菌的好氧和自养特性与反硝化菌的缺氧和异养特性明显不同，脱氮过程通常需在两个反应器中独立进行，如Bardenpho工艺、UCT(University ofCapetwon)工艺、双沟式氧化沟工艺等，或在一个反应器中顺次进行如SBR(Sequencing Batch Reactor，序批式反应器)。当混合污泥进入缺氧池或处于缺氧状态时，反硝化菌工作，硝化菌处于抑制状态；当混合污泥进入好氧池或处于好氧状态时情况则相反，硝化菌工作，反硝化菌处于抑制状态。
但是，不管传统的微生物附着型污水处理构筑物，如生物滤池、生物转盘和淹没式生物滤池，还是新开发的一些高效生物膜处理系统，如两相流化床、三相流化床、厌氧流化床，电极-生物膜法等，这些方法所采用的硝化菌群多为自养菌，增殖速度慢且难以维持较高生物浓度，需先经曝气处理降低有机物浓度，菌株才能生长并表现生物学活性，抗冲击能力弱；高浓度氨氮和亚硝酸盐会抑制硝化菌的生长，使硝化作用不完全，导致总氮去除率很低。
目前，国外有研究者对好氧条件下的生物脱氮过程进行了研究，利用某些微生物种群在好氧条件下具有反硝化的特性来实现同步硝化与反硝化。研究结果表明，泛养硫球菌(Thiosphera pantotroph)、粪产碱菌(Alcaligenea faecalis)、假单胞菌(Pseadonmonas sp)、丛毛单胞菌(Comamonos sp.)等微生物在好氧条件下可利用NOx-N进行反硝化。将硝化菌和反硝化菌置于同-反应器如曝气池内混合培养，虽可达到单个反应器的同步硝化反硝化。但反硝化结果不尽人意，无实际应用价值。
国内也进行了一些相关的研究工作利用好氧反硝化菌群和自养硝化菌群组合脱氮(耿金菊，刘登如等，应用与环境生物学报，2002，8(1)78-82)。虽然具有较好的氨氮脱除能力，但抗冲击能力较弱，氨氮浓度高于0.3克/升的高浓度的氨氮能抑制菌体的生长，并且氨氮浓度高于0.2克/升时，脱氮后氨氮残余量较多；同时不耐高的有机碳浓度，0.5克/升的有机碳浓度抑制菌体生长并降低脱氮效果。
硝化抑制剂是选择性抑制氨氧化细菌的专性化学制剂，开发各种硝化抑制剂是控制硝化作用、提高氮肥利用率的有效措施之一。虽然目前已经有品种门类众多的硝化抑制剂，但是国内外实际应用和广泛报道的多限于60-70年代初筛选出的2-氯-6(三氯甲基)吡啶(N-serve，也称nitrapyrin或西吡CP)、4-氨基-1，2，4-三唑盐酸盐(ATC)、双氰胺(DCD)、硫脲(TU)、脒基硫脲(ASU)、2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶(AM)等少数几种化合物；新的研究也并不尽如人意。造成这种情况的主要原因之一在于，硝化微生物组成复杂、硝化抑制剂对靶微生物的作用机制不十分明确。
已有的研究结果表明，硝化抑制剂对不同土壤的抑制浓度相差甚远，如N-Serve，浓度可以在0.5-20g N-Serve g-1土壤变化(Norton J.M.，Handbookof soil science，2000，160-175)。除了土壤质地、pH、含水量、有机质含量、温度等具有密切关系外(Keeney D.R.，Ntrification inhibitors potentialsnandlimitations，1980，33-46)，其中作为靶标的硝化微生物的组成，不同土壤硝化微生物组成上的差异、尤其异养硝化微生物的存在和它们的活动，对硝化抑制剂的施用效果具有重要的影响。有实验显示，目前常用的一些硝化抑制剂，如乙炔、N-Serve、1-烯丙基-2-硫脲在能够抑制自养硝化细菌的浓度下，并不能抑制部分供试异养硝化细菌纯培养的硝化作用，它们需要高得多的抑制浓度(Verstraete W.and Alexander M.，J.Bacterial.，1972，110955-961；Hynes R.K.and Knowles R.，Can.J.Microbiol.，1982，28334-340)。以异养硝化细菌中提纯的氨单加氧酶(AMO)进行的实验得到了相似的结果，1mM(相当于2.5％)的乙炔并不能抑制异养硝化微生物一脱氮副球菌AMO的酶活，恶臭假单胞菌，5％浓度乙炔才能抑制它对氨的氧化，而欧洲亚硝化单胞菌，0.25μM的乙炔就可强烈抑制它对氨的氧化，3.8μM的乙炔可完全抑制它的酶活(HynesR.K.and Knowles R.，Can.J.Microbiol.，1982，28334-340；Moir J.W.B.et al，FEBS Lett.，38771-74；Daum M.et al，Curr.Microbiol.，1998，37281-288)。
而目前大多数硝化抑制剂的筛选研究和效果比对，多是在土壤培养下进行；迄今为止，自养硝化细菌还是被认为是土壤尤其是农业土壤硝化作用的主要执行者，硝化抑制剂的开发筛选也主要以自养硝化细菌为靶标进行。另外，从抑制剂筛选的方法学来看，除ATC、叠氮化钠或钾、双氰胺、硫脲少数几种抑制剂外，大量的供试化合物多为难溶于水的有机化合物，使用时须加入有机溶剂或表面活性剂，而研究者往往忽略了这些有机物对硝化微生物的组成、活性表现的影响。
发明技术内容本发明的一个目的是提供一种新的具有脱氮生物学活性的细菌，该细菌具有脱除水体氮素的能力。
本发明的另一个目的是提供一种组合培养条件，使该细菌能体现更强的硝化活性和氨氮脱除能力。
本发明的再一个目的是提供新的细菌在水体生物脱氮中的应用。单独或联合使用新的细菌可有效地脱除水体中的氮素。
本发明的再一个目的是提供新的细菌在筛选硝化抑制剂中的应用。新的菌株可作为模式菌株筛选硝化抑制剂。
本发明的再一个目的是提供一种具有脱氮生物学活性的细菌组合物，以及该细菌组合物在水体生物脱氮中的应用。
通过本发明可达到以上所述各目的。
一种具有脱氮生物活性的细菌，该细菌具有较高的硝化活性和单株氨氮脱除能力。这类菌株是异养硝化细菌，在生物脱氮中能有效地将NH4+通过硝化作用转化为NO2-或NO3-，也能将NH4+直接转化成各种氮元素的气体方式如NO、N2O和N2气体逸出。更具体地，这类细菌是节杆菌属球形节杆菌种的一类细菌。在本发明的一个具体例子中，既具有较高的硝化活性又具有单株氨氮脱除能力的细菌是球形节杆菌WR-2，Arthrobacter globiformis WR-2，这株细菌于2002年11月5日在中国专利局指定的保藏单位-中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏登记号为CCTCC M202043。
本发明以河南省封丘的华北潮土这种碱性石灰性土壤为供试土样，经PM平板分离、纯化、活性检验，格利斯试剂鉴定，获得了大量的格利斯反应呈阳性的异养菌株，初步确认它们具有氨氧化能力。这些菌株分属于节杆菌属、欧文氏菌属、棒状杆菌属、小单孢菌属、芽孢杆菌属等。
具体地，从土壤中筛选到的属于节杆菌属球形节杆菌种的有8株细菌，这8株细菌都具有相似生物学功能，其硝化活性和单株氨氮脱除能力比从土壤中筛选到的其它种属菌脱氮生物活性高，但8株菌在形态学上有差异。各株细菌特征如下(1)B173PM平板上菌落圆形，浅黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为长短不一的杆菌，7天时为球状细胞，有特定排列；(2)B256PM平板上菌落圆形，黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为直或弯曲的小杆菌，有的有分支，7天时为球杆状细胞；(3)B459PM平板上菌落圆形，浅黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，有二分支，形状不规则，7天时为球菌、球杆菌；(4)B464PM平板上菌落圆形，浅黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，有分支，7天时为球菌、球杆菌；(5)B602PM平板上菌落圆形，蛋黄色，不透明，凸起，光滑；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，7天时为球菌，球形或椭球形；(6)B605PM平板上菌落圆形，蛋黄色，凸起，光滑；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，细长弯曲，7天时为球菌、球杆菌；(7)WY-1PM平板上菌落圆形，黄色，凸起，光滑；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，有的有分支，7天时为球菌、球杆菌；(8)WR-2可以在PM平板上形成很小的菌落，圆形，扁平，全缘；表面不光滑有皱纹、菌苔表面呈土黄色；革兰氏阳性；培养早期，细胞呈不规则的杆状，延长培养时间则出现球形，老化的细胞几乎全为球状；多以链状形式排列；不运动，不形成内生孢子。
本发明人从8株细菌进一步反复检测比较，结果从河南省封丘的华北潮土中分离到一株具有较高的硝化活性和单株氨氮脱除能力的细菌，经鉴定为球形节杆菌WR-2，Arthrobacter globiformis WR-2。该球形节杆菌WR-2菌株具有以下特征1.菌落形态特征在营PM平板养琼脂平板上，恒温28℃好气培养7天后形成很小的菌落，圆形，扁平，全缘；表面不光滑有皱纹、菌苔表面呈土黄色，基质未见明显的可溶性色素产生。
2.菌体形态特征革兰氏阳性；培养早期，细胞呈不规则的杆状，延长培养时间则出现球形，老化的细胞几乎全为球状；多以链状形式排列；不运动，不形成内生孢子。
3.主要生理生化特性见表1最适培养温度为28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
表1 WR-2菌株的生理生化特性检测项目 结果 检测项目 结果生长需生物素 + 液化明胶 +硫胺素- 水解淀粉 +NO3→NO2+ D-木糖 -/+尿酸 + 松三糖+m-羟基苯甲酸 + D-葡萄糖醛酸盐-/+α-酮基-戊二酸+ 环己六醇 -棉子糖- D-甘露糖 -D-甘氨酸 + 蔗糖 -/+乳糖 -注+表示阳性反应或能利用；-表示阴性反应或不能利用。
4.氨氧化活性以丙酮酸为碳源，硫酸铵为氮源，菌株在初始pH5.0-9.0，培养温度15-35℃范围内均能很好的生长和发生硝化作用；在90-100r/min摇床培养14天积累的亚硝酸盐浓度均高于60.0mg NO2-N L-1，个别单株可高达95mgNO2-N L-1以上。初始pH低于5时，菌体无生长无硝化活性。
5.脱氮活性以浓度为0.075mol L-1乙酸钠为碳源，C/N为5∶1时，培养28天，氨氮脱除率为65％，全氮去除率为62％；浓度为0.050mol L-1的丙酮酸为碳源，C/N为5∶1时，培养28天，氨氮脱除率为90％，全氮去除率为68％。所残余的全氮几乎为菌体细胞。
参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版的分类鉴定，该菌株为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)。因此将其命名为球形节杆菌WR-2。球形节杆菌WR-2已于2002年11月5日在中国专利局指定的保藏单位-中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M202043。
我们从土壤中分离到的球形节杆菌WR-2，在存在氮素如氨态氮和/或硝酸盐和/或亚硝酸盐的水体中，不仅具有较高的硝化活性，而且能将铵态氮转化双氮气体N2的能力，这种作用发生的环境是在好氧条件之下，并且在较高的碳/氮比条件下，生物学活性更强，这样，对富营养化的水体，不需进行化学曝气处理过程。
一种培养球形节杆菌体现更强的硝化活性和氨氮脱除能力的方法，该方法包括在a)pH为5.0-9.0；b)温度为15-35℃；c)铁离子浓度以FeSO4·7H2O计为0.005-0.02克/升；d)碳/氮比为1∶10-20∶1条件下培养细菌。优选的方法组合包括a)pH为6.0-8.0；b)温度为18-30℃；c)铁离子浓度以FeSO4·7H2O计为0.01-0.02克/升；d)碳/氮比为1∶1-10∶1条件下培养细菌，最佳的方法组合包括a)pH为7.0；b)温度为30℃；c)铁离子浓度以FeSO4·7H2O计为0.01克/升；d)碳/氮比为5∶1条件下培养细菌。
球形节杆菌WR-2是既具有较高的硝化活性又具有单株氨氮脱除能力的细菌。在常规的生长条件下就可表现出硝化活性，并在单独存在时体现氨氮脱除能力。在合适的pH值，温度，碳/氮比和铁离子浓度等组合培养条件下，球形节杆菌WR-2能体现更强的硝化活性和氨氮脱除能力。
本发明从土壤中分离筛选的球形节杆菌WR-2可在含有氮素污染的水体中生长繁殖，通过细菌体内的生物反应过程，一部份氮素转化成双氮气体排出，另一部份转化成细菌菌体物质，残余的氮素在普通水体合理含量范围内，经球形节杆菌WR-2生物处理的污水达到环保排放标准。本发明提供了从土壤中分离筛选的球形节杆菌WR-2在水体生物脱氮中的应用。在本发明的具体实施例中，球形节杆菌WR-2，CCTCC M202043应用于水体中氮素污染物的脱除。
球形节杆菌WR-2是一株异养好氧性的微生物，在水体特别是富营养化水体包括存在铵盐、亚硝酸盐、有机氮的水体中能进行氮素无害化生物处理，经球形节杆菌WR-2生物处理的水体达到排放或饮用的合格水体标准。球形节杆菌WR-2的水体无害化生物处理是在有氧条件下进行，不需特殊的设备和额外的实验条件，并且水体氮素的生物无害化处理在一个反应池中同时进行硝化与反硝化的过程。
本发明还公开了球形节杆菌WR-2在筛选硝化抑制剂中的应用。球形节杆菌WR-2这种模式细菌可作实验菌筛选硝化作用的抑制剂，在本发明的一个具体实施例中，以球形节杆菌WR-2，Arthrobacter globiformis WR-2，保藏登记号CCTCCM202043为供试菌，发现维生素C可有效地抑制土壤中硝化作用的发生，这有助于合理地施用氮肥。
一种在水体中脱氮的细菌组合物，含有效量的球形节杆菌WR-2和水体脱氮工艺中可接收的载体。水体脱氮工艺中可接收的载体包括吸附剂，硝化和反硝化细菌等。本发明中采用的吸附剂如20％的聚乙烯醇；硝化细菌如蜡状芽孢杆菌NBB-135(CGMCC No.0560)；反硝化细菌如植物短小杆菌WO-8(CCTCCM202044)等。蜡状芽孢杆菌NBB-135，CGMCC No.0560在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利程序保藏；植物短小杆菌WO-8(CCTCC M202044)在中国典型培养物保藏中心进行专利程序保藏。
本发明提供了细菌组合物在水体生物脱氮中的应用。使用本发明提供的细菌组合物可有效地脱除水体中的氨态氮。
本发明提供的球形节杆菌WR-2是一株异养好氧性的微生物，不仅具有较高的硝化活性和具有单株氨氮脱除能力，而且对普遍使用的硝化抑制剂如4-氨基-1，2，4-三唑盐酸盐(ATC)无敏感性；本发明人以球形节杆菌WR-2为模式菌，进行硝化抑制剂的筛选工作。在本发明的一个具体实施例中，我们以球形节杆菌WR-2为模式菌，发现维生素C可明显抑制其生长繁殖，并影响其生物学活性。
在本发明中的铵态氮或氨态氮是指可溶性的铵根离子NH4+-NH3；氮氧化物是指NO和N2O。
在本发明中硝化作用是指微生物将NH4+氧化为NO2-，继而NO2-再氧化为NO3-的过程，或者由于微生物作用导致氧化态氮增多的过程。它是自然界氮素循环的重要环节，也是农田氮素损失的关键途径之一。生物硝化作用可以分为三大类型化能自养型硝化作用、异养型硝化作用和甲烷营养型硝化作用。
在本发明中异养硝化广义上是指有机和无机氮化合物从还原态经生物氧化为多种氧化态的过程，狭义上的是指异养微生物在好氧条件下将氧化态-3的铵氮或有机态氮氧化为羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的过程。
在本发明中反硝化是指微生物将NO3-还原为NO2-，继而NO2-再还原为N2O、NO或N2的过程。
在本发明中碳/氮比，又称C/N比是指碳元素的摩尔浓度与氮元素的摩尔浓度之比，如C/N＝1相当于硫酸铵0.015mol L-1∶乙酸钠0.015mol L-1。
在本发明中脱氮是指水体中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH4+，NO2-和NO3-。
在本发明中水体脱氮工艺中可接收的载体包括吸附剂，硝化和反硝化细菌等。在本发明中使用的各种单位，有国家标准的一律采用国家标准，无国家标准的采用行业标准。亚硝酸盐浓度为60.0mg NO2-N L-1，表示每升溶液中含60毫克亚硝态氮，硝酸盐含量为0.18mg N L-1表示每升溶液中含0.18毫克硝态氮。
在本发明中，球形节杆菌WR-2是从土壤中分离筛选得到的，并作了专利程序的保藏，保藏号为CCTCC M202043，在本发明中，球形节杆菌WR-2等同CCTCC M202043。
附图1球形节杆菌WR-2的形态图1A平皿菌落图；B菌体显微照片附图2球形节杆菌WR-2在不同浓度乙酸钠培养时的菌体生长曲线，其中C1，C3，C5，C10分别表示乙酸钠浓度是0.015mol L-1，0.045mol L-1，0.075mol L-1，0.15mol L-1附图3球形节杆菌WR-2在不同浓度乙酸钠培养时的亚硝酸盐积累，其中C1，C3，C5，C10分别表示乙酸钠浓度是0.015mol L-1，0.045mol L-1，0.075mol L-1，0.15mol L-1附图4球形节杆菌WR-2在不同浓度ATC中的生长状况，其中碳源为丙酮酸，培养温度为28℃的静止培养附图5球形节杆菌WR-2在不同浓度ATC中的硝化活性表现，其中碳源为丙酮酸，培养温度为28℃的静止培养下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如土壤微生物研究会〖日〗编，叶维青等译，科学出版社，1983，土壤微生物实验法；许光辉等编，北京农业出版社，1986，土壤微生物分析方法手册；以及中国科学院南京土壤研究所微生物室编，科学出版社，1985，土壤微生物研究法等书中所述的条件，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例实施例1.培养基和试剂的配制1.1 PM液体培养基也叫牛肉膏蛋白胨培养基的配制称3克牛肉浸膏，5克蛋白胨，溶解于1000毫升蒸馏水中形成PM液体培养基，在上述未灭菌的液体PM培养基中加入20克琼脂，形成PM固体培养基。
用1N氢氧化钠调培养基pH至7.1。分装在三角瓶中，灭菌，培养基冷却至50℃时倒平板。PM液体培养基经高压液相色谱分析，结果是亚硝酸盐和硝酸盐含量均为迹量，亚硝酸盐未检出，硝酸盐含量为0.18mg N L-1。
1.2格利斯试剂的配制1.2.1对氨基苯磺酸试剂(A液)0.5克对氨基苯磺酸(Sulfanilic acid)溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中，贮于棕色瓶，冷藏备用。
1.2.2α-萘胺试剂(B液)0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸馏水和150毫升20％的稀醋酸溶液中，贮于棕色瓶，冷藏备用。
1.2.3格利斯试剂的使用液取等比例的A液与B液混合即可使用。
1.3 NB液体培养基的配制1.3.1无机盐溶液的配制称取(NH4)2SO42.1克，NaH2PO40.25克，K2HPO40.75克，MgSO4·7H2O 0.03克，MnSO4·H2O 0.01克，FeSO4·7H2O 0.01克，溶解于1000毫升蒸馏水中，用1M NaOH调培养基的pH值为7.0，分装在三角瓶中，灭菌。
1.3.2有机碳溶液的配制1.3.2.1乙酸钠溶液的配制称取27.2克三水乙酸钠溶解于1000毫升蒸馏水中形成0.20M的乙酸钠溶液，灭菌。
1.3.2.2甲酸钠溶液的配制称取20.8克二水甲酸钠溶解于1000毫升蒸馏水中形成0.20M的甲酸钠溶液，灭菌。
1.3.2.3丙酮酸溶液的配制吸取14.0毫升丙酮酸溶解于1000毫升蒸馏水中形成0.20M的丙酮酸溶液，灭菌。使用时按体积比取无机盐溶液90份与有机碳溶液10份混合，形成NB培养基。
1.4 4-氨基-1，2，4-三唑盐酸盐(ATC)的配制称取18克ATC溶解于1000毫升蒸馏水中形成1800毫克/升的ATC溶液，灭菌。
1.5维生素C的配制称取2.60克维生素C溶解于100毫升蒸馏水中形成2.60％的维生素C溶液，灭菌。
1.6聚乙烯醇(PVA2000)溶液的配制称取20.0克PVC2000溶解于100毫升蒸馏水中形成20％的PVA溶液。
1.7氯化钙(CaCl2)溶液的配制称取11.1克CaCl2溶解于100毫升蒸馏水中形成1.0M CaCl2溶液。
1.8聚乙烯醇和氯化钙混合溶液的配制按体积比取20％的PVA溶液80份，1.0MCaCl2溶液20份，混合均匀，即为聚乙烯醇和氯化钙混合溶液。
实施例2、分离鉴定具有硝化活性的异养细菌菌株2.1土壤样品采样地点河南省封丘县赵岗乡；分类名称中壤质黄潮土；来源耕层土壤，淤土；土样处理风干、研磨过20目筛；2.2称取1.0克风干土于含有50毫升无菌蒸馏水的250毫升三角瓶中，90r/min摇床振荡4小时。
2.3土悬液10倍梯度稀释后涂布于PM平板，每个稀释度三个重复。28℃培养7天后，挑取单菌落到PM平板，划线纯化。镜检，证明纯度。
2.4初筛，活性菌的鉴别将获得的经分离纯化后的异养菌株接种于PM平板，28℃培养10天，格利斯试剂直接点滴到平板，进行硝化活性确认，并以不接菌的平板作空白对照。1分钟内，格利斯试剂显色呈红色，表明有亚硝酸盐生成。再次接种细菌到平板，重复验证，显色反应仍呈阳性，初步确认为硝化活性菌。(见表2)。PM培养基经高压液相色谱分析，表明其中亚硝酸盐和硝酸盐含量均为迹量其中亚硝酸盐未检出，硝酸盐含量低于0.2mg N L-1，不会对结果构成正干扰。
2.5复筛、模式株的确立选取初筛时活性较强的代表性菌株进行。刮取生长于PM平板的纯菌菌苔入30毫升无菌水，使其充分分散均匀制成菌悬液。分别接种1毫升菌悬液入含不同有机物为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，每组三个重复。并以不接种的培养基作空白对照。28℃静止培养42天后，培养液4℃下5000g离心15min，格利斯试剂法比色测定上清液中的亚硝酸盐浓度。菌种样品培养上清比色值减空白对照上清比色值的差值大于0.3mg N L-1时判为异养硝化活性菌(见表3)。
表2 部分活性菌株的分类种(属)名 代表菌株节杆菌属(Arthrobacter)WY-1，WR-2球形节杆菌(Arthrobacter globiformis) WR-2欧文氏菌属(Erwinia) WT-1，XY-3棒状杆菌属(Corynebacterium) WY-19小单孢菌属(Micromonospora)WH-1芽孢杆菌属(Bacillus)短小芽孢杆菌(Bacillus brevis) WY-2，WY-21地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) WX2环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) WR-8坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus) WR-9表3 各菌株的比色值(以亚硝酸盐表示，NO2--N mg L-1) 2.6活性菌株的生理学鉴定参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版。细菌特征见表4，表5。
实施例3球形节杆菌WR-2的鉴定1.菌落形态特征在营养琼脂PM平板上恒温28℃好气培养7天后形成很小的表4 节杆菌属细菌的生理生化特性菌株号 厌氧生长 接触酶 淀粉水解 葡萄糖发酵 分解纤维素 吲哚实验 硝酸盐还原B173 - + + + - - +B256 - + + + - - +B459 - + + + - - +B464 - + + + - - +B602 - + + + - - +B605 - + + + - - +WY-1 - + + + - - +WR-2 - + + + - - +注+表示阳性反应或能利用；-表示阴性反应或不能利用。
表5 节杆菌属细菌的个体形态特征菌株号B173 PM平板上菌落圆形，浅黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为长短不-的杆菌，7天时为球状细胞，有特定排列B256 PM平板上菌落圆形，黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为直或弯曲的小杆菌，有的有分支，7天时为球杆状细胞B459 PM平板上菌落圆形，浅黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，有二分支，形状不规则，7天时为球菌、球杆菌B464 PM平板上菌落圆形，浅黄色，微凸起；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，有分支，7天时为球菌、球杆菌B602 PM平板上菌落圆形，蛋黄色，不透明，凸起，光滑；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，7天时为球菌，球形或椭球形B605 PM平板上菌落圆形，蛋黄色，凸起，光滑；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，细长弯曲，7天时为球菌、球杆菌WY-1 PM平板上菌落圆形，黄色，凸起，光滑；革兰氏染色阳性，无内生芽孢，12小时为杆菌，有的有分支，7天时为球菌、球杆菌WR-2 可以在PM平板上形成很小的菌落，圆形，扁平，全缘；表面不光滑有皱纹、菌苔表面呈土黄色；革兰氏阳性；培养早期，细胞呈不规则的杆状，延长培养时间则出现球形，老化的细胞几乎全为球状；多以链状形式排列；不运动，不形成内生孢子菌落，圆形，扁平，全缘；表面不光滑有皱纹、菌苔表面呈土黄色，基质未见明显的可溶性色素产生。
2.菌体形态特征革兰氏阳性；培养早期，细胞呈不规则的杆状，延长培养时间则出现球形，老化的细胞几乎全为球状；多以链状形式排列；不运动，不形成内生孢子。
3.主要生理生化特性见表1，最适培养温度为28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
4.氨氧化活性以硫酸铵为氮源，菌株在初始pH5.0-9.0，培养温度15-35℃范围内均能很好的生长和发生硝化作用；在90-100r/min摇床培养14天积累的亚硝酸盐浓度均高于60.0mg NO2-N L-1，个别单株可高达95mg NO2-NL-1以上。初始pH低于5时，菌体无生长无硝化活性。
5.脱氮活性以乙酸钠为碳源时，浓度为0.075mol L-1时，C/N＝5∶1，培养28天，氨氮脱除率为65％，全氮去除率为62％；丙酮酸为碳源时，浓度为0.050mol L-1时，C/N＝5∶1，培养28天，氨氮脱除率为90％，全氮去除率为68％。所残余的全氮几乎为菌体细胞。
参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版的分类鉴定，该菌株为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)。因此将其命名为球形节杆菌WR-2。球形节杆菌WR-2已于2002年11月5日在中国专利局指定的保藏单位-中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M202043。WR-2菌株的培养特征和个体形态特征见图1中的A和B。
实施例4球形节杆菌WR-2的培养和生物学活性表现4.1刮取生长于PM平板的纯菌菌苔入20毫升无菌水，使其充分分散均匀制成菌悬液。分别接种1毫升菌悬液入含①乙酸钠，②苹果酸，③丙酮酸，④甲酸钠，⑤柠檬酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，每组三个重复。并以不接种的培养基作空白对照。28℃静止培养42天后，培养液4℃下5000g离心15min，格利斯试剂法比色测定上清液中的亚硝酸盐浓度，结果见表6。
表6 不同碳源时WR-2菌纯培养的生长及硝化活性Carbon sourceCell(Log N) Net NO2-(mg N L-1)①乙酸钠 8.8 8.2②苹果酸 8.7 8.0③丙酮酸 9.1 26.1④甲酸钠 7.9 9.2⑤柠檬酸钠 6.0 0.3CK6.1 0.3注CK表示不加任何有机物为碳源的培养4.2从PM斜面接一环菌苔入装有50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在28-30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时。按2％量接种，将1毫升菌液接至装有50毫升培养基的250毫升锥形瓶中。培养基初始pH值分别设定为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；培养温度分别设为15℃、25℃、30℃、30℃、35℃、37℃；铁离子浓度以FeSO4·7H2O计分别设为0克/升、0.005克/升、0.01克/升、0.02克/升、0.03克/升；碳/氮比分别为1∶10、1∶5、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1。设不接种对照组，3次重复。培养7天，14天，21天后，取培养液4℃下5000g离心15min，格利斯试剂法比色测定上清液中的亚硝酸盐浓度。结果见表7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6。
表7.1 不同初始pH条件下菌株的生长和亚硝酸盐积累(摇床培养14天)初始pH 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0OD6001.121.181.171.141.12NO2-59.51 70.53 80.16 83.98 84.54实验时温度30℃，铁离子浓度0.01gL-，碳/氮比2∶1。表中NO2-以mgN L-1表示表7.2 不同温度下菌株的生长和亚硝酸盐积累(静止培养21天)培养温度 15℃ 25℃ 32℃ 35℃ 37℃OD6000.52 1.10 1.00 0.92 0.83NO2-4.45 17.4329.9110.0 0.031实验时pH6.5，铁离子浓度0.01gL-，碳/氮比2∶1。表中NO2-以mgN L-1表示表7.3 不同温度下菌株的生长和亚硝酸盐积累(静止培养14天)培养温度 28℃ 30℃ 35℃OD6000.98 0.98 0.87NO2-3.96 17.5 14.71实验时pH6.5，铁离子浓度0.01gL-，碳/氮比2∶1。表中NO2-以mgN L-1表示表7.4 不同铁离子浓度下菌株的生长和亚硝酸盐积累(摇床培养14天)FeSO4·7H2O计(g L-1) 00.005 0.01 0.02 0.03OD6000.50 0.87 1.11 0.94 0.90NO2-1.18 17.3 52.6 36.2 19.2实验时pH6.5，温度30℃，碳/氮比2∶1。表中NO2-以mg N L-1表示表7.5 不同碳氮比下菌株的培养状况(30℃，静止培养28天)碳氮比 1∶10 1∶5 2∶1 4∶1 5∶1 10∶1 20∶1OD6000.18 0.30 0.80 1.09 1.12 1.08 0.90NO2-0.55 0.80 10.5526.105.57 2.03 1.56NH4+％ 92.45％ 89.22％ 41.82％ 18.36％ 10.63％ 19.63％ 17.50％TN％ 94.62％ 93.81％ 57.22％ 39.19％ 32.64％ 37.61％ 38.50％注NO2-以mg N L-1表示铵态氮残留百分比(NH4+％)＝接菌培养物的铵态氮浓度/不接菌对照的铵态氮浓度全氮残留百分比(TN％)＝接菌培养物的全氮/不接菌对照的全氮各组不同浓度碳源的培养均有总氮的减少。其中浓度为C/N＝4∶1、C/N＝5∶1、C/N＝10∶1时脱氮效果均很好，并以C/N＝5∶1最佳培养28天，氨氮脱除率为90％，全氮去除率为68％，所残余的全氮几乎为菌体细胞，积累的亚硝酸盐在5.57mg N L-1以下。C/N＝4∶1和C/N＝10∶1的培养氨氮和全氮脱除能力相近。球形节杆菌WR-2菌株发生硝化作用的最佳温度为30℃，最佳铁离子浓度0.01g L-，最佳碳/氮比5∶1，最佳初始pH为pH9.0，考虑到pH9.0时氨挥发严重，后续实验初始pH定为pH7.0。
实施例5球形节杆菌WR-2的在水体中的脱氮5.1不同浓度的乙酸钠为碳源时的脱氮效果5.1.1培养基为NB培养基，以乙酸钠为碳源，浓度分别0.015mol L-1，C/N＝1∶1；0.045mol L-1，C/N＝3∶1；0.075mol L-1，C/N＝5∶1；0.15mol L-1，C/N＝10∶1。配制方法同1.3。
5.1.2培养过程预培养从PM斜面接一环菌苔入装有以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时。按2％量接种，将预培养之菌液1毫升接至装有以不同浓度乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中。设不接种对照，3次重复。30℃，静止培养。结果如表8、表9、图2、图3所示。
表8 不同浓度乙酸钠为碳源时WR-2菌株的生长和亚硝酸盐积累(30℃，静止培养42天)碳氮比 1∶1 3∶1 5∶1 10∶1OD6000.50±0.0100.78±0.0200.90±0.0210.83±0.018NO2-7.26±0.0500.41±0.0980.12±0.0200.09±0.016NH4+16.38±5.375.62±0.22 4.59±1.34全氮 89.81±1.99注C0以mol L-1表示；全氮、NH4+、NO2-以mg N L-1表示；数据表示平均值±标准误n＝3。
表9 不同浓度乙酸钠为碳源时的培养状况(30℃，静止培养)碳氮比 1∶13∶1 5∶128天 42天28天48天 28天38天NO2-1.19±0.29 4.15±1.33 0.074±0.0210.41±0.19 0.094±0.0100.090±0.016NH4+％ - 42.08±6.16％ 37.4±1.90％- 34.5±1.84％9.38±0.78％TN％70.9±1.24％ 54.7±3.03％45.0±2.97％23.6±1.85％ 37.7±1.20％22.3±1.82％注NO2-以mg N L-1表示。
铵态氮残留百分比(NH4+％)＝接菌培养物的铵态氮浓度/不接菌对照的铵态氮浓度全氮残留百分比(TN％)＝接菌培养物的全氮/不接菌对照的全氮数据表示平均值±标准误n＝3。
球形节杆菌WR-2具有很好的氨氮脱除能力，且生物脱氮过程中测量亚硝酸盐浓度仅为0.1mgN L-1，无亚硝酸盐的积累。其中在以乙酸钠浓度为0.075mol L-1，C/N为5∶1和0.15mol L-1，C/N为10∶1的培养时，氨氮脱除能力强，在以乙酸钠浓度为0.045mol L-1， C/N为3∶1次之。
实施例6 WR-2和硝化菌蜡状芽孢杆菌NBB-135，CGMCC No.0560的混合培养
6.1培养基为以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的NB培养基，配制方法同1.3。
6.2预培养6.2.1从PM斜面接一环蜡状芽孢杆菌NBB-135，CGMCC No.0560的菌苔入装有以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时，调菌体OD值为OD600＝0.40。
6.2.2从PM斜面接一环球形节杆菌WR-2的菌苔入装有以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时，调菌体OD值为OD600＝0.40。
6.3培养NBB-135(6.2.1之培养物)和WR-2菌(6.2.2之培养物)按11(体积比)混合，再以2％量的接种混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸盐为碳源的NB培养基(配方同1.3)在30℃，静止培养28天。以靛酚蓝比色法测氨态氮，格利斯试剂比色法测定亚硝态氮，开氏法测定总氮。
6.4结果混合培养物在培养28天后，脱除了体系全氮的62.3％，铵氮去除率为78.1％，亚硝酸盐浓度仅为0.52mg N L-1。
实施例7 WR-2和反硝化菌植物短小杆菌WO-8，CCTCC M202044的混合培养7.1培养基为以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的NB培养基，配制方法同1.3。
7.2培养7.2.1从PM斜面接一环植物短小杆菌WO-8，CCTCC M202044的菌苔入装有以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时，调菌体OD值为OD600＝0.40。
7.2.2从PM斜面接一环球形节杆菌WR-2的菌苔入装有以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时，调菌体OD值为OD600＝0.40。
7.2.3 WO-8(7.2.1之培养物)和WR-2菌(7.2.2之培养物)按1∶2(体积比)混合，以2％的接种量将混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸盐为碳源的NB培养基(配方同1.3)，30℃，静止培养28天。以靛酚蓝比色法氨态氮，格利斯试剂比色法测定亚硝态氮，开氏法测定总氮。
7.3结果混合培养物在培养28天后，脱除了体系全氮的68.2％，铵氮去除率为79.7％，亚硝酸盐浓度仅为0.32mg N L-1。
实施例8固定化球形节杆菌WR-2的脱氮8.1球形节杆菌WR-2的固定化膜的制备8.1.1球形节杆菌WR-2浓缩菌体的制备从PM斜面接一环菌苔入装有以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时。按1％量接种将菌液接至装有0.015mol L-1乙酸钠为碳源的150毫升NB培养基的500毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养72小时。在5000r/min，4℃下离心15分钟，用生理盐水洗涤离心两次后，悬浮于15ml生理盐水。
8.1.2球形节杆菌WR-2固定将浓缩菌体加入到20％PVA和1.0mol L-1的CaCl2的混合溶液中，搅匀后平铺于有机玻璃板上，置于冰箱中，-20℃冷冻过夜，再在室温下解冻。重复冷冻解冻3-4次，有蒸馏水充分洗涤表明，即得平板状固定化细胞膜。
8.1.3固定化膜反应器及脱氮实验将所得的固定化细胞膜用法兰固定并组装生物脱氮反应器。反应器盛液量为1600毫升，以0.015mol L-1乙酸盐为碳源的NB培养基，其中铵态氮浓度减为100mg N L-1，置于28℃恒温培养箱中进行活化，待细胞活性稳定后，进行脱氮实验。实验过程中，控制溶解氧浓度为5-8毫克/升。每隔一定时间取少量样品分析其中的铵态氮、亚硝态氮和硝态氮浓度。结果显示在培养16天后，铵氮去除率为92.7％，亚硝酸盐浓度仅为0.22mg N L-1。
实施例9球形节杆菌WR-2作为模式菌筛选硝化抑制剂。
9.1不同浓度ATC对WR-2菌生长及硝化活性的影响9.1.1从PM斜面接一环菌苔入装有以0.020mol L-1丙酮酸为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时。按2％量接种将菌液接至装有50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中。设不接种对照，3次重复。ATC设4个浓度梯度分别为0，15mg L-1，75mg L-1，150mg L-1。ATC、碳源单独灭菌，使用前混合。在30℃，静止培养。
9.1.2结果如图4、图5。结果表明，在0-75mg L-1的浓度范围内，ATC对异养硝化活性菌株WR-2的生长和硝化活性无抑制效果。在150mg L-1高浓度时，ATC对菌株的生长和硝化活性都抑制。
8.2维生素C对WR-2细菌生长及硝化活性的影响8.2.1从PM斜面接一环菌苔入装有以0.015mol L-1乙酸钠为碳源的50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中，在30℃，120-130r/min摇床振荡培养24小时。按2％量接种，将菌液接至装有50毫升NB培养基的250毫升锥形瓶中。设不接种对照，3次重复。维生素C浓度为2.17克/升；维生素C、碳源单独灭菌，使用前混合。30℃，静止培养。
9.2.2结果如表11所示表11.添加Vc及未加Vc培养时菌株的生长和亚硝酸盐积累(30℃，静止培养21天)测定项目 添加Vc 对照(不加Vc)OD6000.0200.51NO2-0.12 7.10注NO2-以mgN L-1表示菌株无生长，无硝化活性，表明Vc浓度为2.17克/升可强烈抑制菌株的生长和硝化活性。
菌保目录菌株号WR-2 CCTCC M202043 Arthrobacter globiformis WR-2球形节杆菌WO-8 CCTCC M202044 Curtoacterium plantarum WO-8 植物短小杆菌NBB135CGMCC NO.0560 Bacillus cereus NBB-135 腊状芽孢杆菌
权利要求
1.一种具有脱氮生物学活性的细菌，其特征在于该细菌是球形节杆菌WR-2，Arthrobacter globiformis WR-2，其保藏登记号为CCTCC M202043。
2.一种培养权利要求1中所述细菌的方法，该方法是在a)pH为5.0-9.0；b)温度为15-35℃；c)铁离子浓度以FeSO4·7H2O计为0.005-0.02克/升；d)碳/氮比为1∶10-20∶1条件下培养细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，该方法是在a)pH为6.0-8.0；b)温度为20-35℃；c)铁离子浓度以FeSO4·7H2O计为0.01-0.02克/升；d)碳/氮比为1∶1-10∶1条件下培养细菌。
4.根据权利要求3所述的方法，该方法是在a)pH为7.0；b)温度为30℃；c)铁离子浓度以FeSO4·7H2O计为0.01克/升；d)碳/氮比为5∶1条件下培养细菌。
5.一种在水体中脱氮的细菌组合物，含有效量的一种如权利要求1中所述的细菌和水体生物脱氮中可接收的载体。
6.一种权利要求1中所述的细菌在水体生物脱氮中的应用。
7.一种权利要求5中的细菌组合物在水体生物脱氮中的应用。
8.一种权利要求1中所述细菌在筛选硝化抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新的既具有硝化活性，又具有单株氨氮脱除能力的细菌和含有该类细菌的组合物；该细菌能有效脱除氨态氮，保护环境。本发明还公开了培养该细菌的方法，以及该细菌在生物脱氮和筛选硝化抑制剂中的应用。
文档编号C02F3/34GK1483813SQ0311859
公开日2004年3月24日 申请日期2003年2月14日 优先权日2003年2月14日
发明者彭光浩, 王一明 申请人:中国科学院南京土壤研究所