专利名称：一种提高硝化细菌氨氧化能力的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种硝化细菌的培养方法，特别涉及一种可以提高硝化细菌氨氧化能力的培养基和培养条件。
背景技术：
由于经济社会的不断发展，人们对水产品的需求量越来越大，促使高密度水产养 殖的迅速推广，导致养殖水环境和周边水域的恶化。水体微生态环境的严重破坏加剧了大 面积氨和亚硝酸盐过度积累和水产生物中毒事件频繁爆发，直接或间接造成了我国经济的 巨大损失。针对上述问题，目前采用的治理方法多为化学和物理处理法，但这些方法存在效 率低，二次污染大等缺点，生物治理法因其绿色环保，效率高，效用时间长的特点将成为水 产养殖领域中有效方法。然而，我国市面上硝化细菌产品极其匮乏，大多为其他种类低效混 合微生物的替代产品，如光合细菌、芽孢杆菌等，尤其以专门针对富营养化水体中氨降解的 微生态菌剂的缺失。因此，具有高效氨氧化能力的硝化细菌菌剂的开发和研究显得尤为重 要。硝化细菌能在好氧的条件下将氨氧化为亚硝酸盐，最后转化为植物的无机营养硝酸盐， 其中硝化细菌催化的亚硝化过程是硝化作用的限速步骤，因而具有高效氨氧化能力的硝化 细菌在自然界氮素循环中起着重要的作用。硝化细菌是一种化能无机自养型细菌，只能利用无机培养基进行生长繁殖，存在 生长缓慢、需氧量大、环境因素影响大等缺点，使硝化细菌培养的困难加大。
发明内容
本发明的目的在于针对以上所述硝化细菌培养过程中存在的问题，提出了一种可 以促进硝化细菌生长，并同时提高其氨氧化能力的培养基及其培养条件。本发明目的通过如下技术方案实现一种提高硝化细菌氨氧化能力的培养方法，在每IOOOmL水中溶解碳酸氢钠 1. 0-4. 0g、硫酸铵 0. 5-1. 2g、碳酸钠 0. 3-0. 8g、氯化钠 0. 1-0. 5g、磷酸二氢钾 0. 1-0. 5g、硫 酸镁0. 1-0. 5g、硫酸亚铁0. 01-0. 05g和微量元素0. 1-1. OmL，组成培养基；然后调节培养基 PH至6. 8-8. 0，以质量百分比0. 5% -5%的比例投加电气石到培养基中；将硝化细菌按照 体积百分比为10 15%的接种量接种至加有电气石的培养基中，在温度28°C _34°C、溶氧 ≥2. Omg/L的条件下培育7 10天；所述微量元素在培养基中配方组成为FeCl3 · 6H20 1. 5g/L, H3BO3 0. 15g/L, CuSO4 ·5Η200· 03g/L，KI 0. 18g/L,MnCl2 ·4Η20 0. 12g/L,Na2MoO4 ·2Η20 0. 06g/L, ZnSO4 ·7Η20 0. 12g/L, CoCl6 · H2O 0. 15g/L 和 EDTA 二钠 10g/L。为进一步实现本发明目的，所述的pH通过盐酸调节。所述的电气石的粒径为0. 1 10 μ m。相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果
(1)优化得到的培养方法可使硝化细菌菌体量提高20%以上，氨氧化能力甚至可 提高120%，说明本发明有利于促进硝化细菌的生长繁殖和硝化细菌氨氧化能力的提高；(2)本发明利用电气石增加硝化细菌细胞膜的通透性，培养基中添加电气石有助 于增强细胞的活力，促进细菌的快速增殖，同时电气石可稳定硝化细菌培养过程中的PH 值，有益于硝化细菌的生长；(3)本发明培养基是全无机培养基，不含有机物；硫酸铵是唯 一氮源，碳酸钠和碳 酸氢钠提供唯一碳源；整个培养过程是一个全无机培养的过程，解决了有机物对硝化细菌 生长抑制的问题；(4)不需要对培养基进行灭菌，节省了能源。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于实施 例的范围。本发明原始的硝化细菌培养基组成是按IOOOmL水中溶解碳酸氢钠6. 0g、硫酸铵
2.0g、碳酸钠1. 0g、氯化钠0. 6g、磷酸二氢钾0. 8g、硫酸镁0. 6g、硫酸亚铁0. Ig ；用0. IM HCl调节pH至7. 0，30°C下以10%的接种量和2. Omg/L的溶解氧进行培养，7d后收获硝化 细菌菌体，检测硝化细菌菌悬液的0D_和硝化细菌氨氧化能力，其(培养前后0D_ 的增加量)=0. 530，氨氧化能力为 420mgNH4+-N/gMLSS · d(MLSS = 1. 21 X OD600)。下面实施例中，电气石是一种以含硼为特征的铝、钠、铁、钙、镁的环状硅酸盐晶体 矿物，其化学结构通式可表示为XY3Z6 [T6O18] [BO3JV3W, X = Ca、Na、K或空位，Y = Mg2+、Fe2+、 Mn2+、Al、Cr3+、V3+、Fe3+、Ti4+，Z = Mg、Al、Fe3+、V3+、Cr3+，T = Si、Al，B = B、空位，V = 0H、 0-
，W = 0H、F ；属于三方C3v5-R3m晶系，为异极性矿物，Mohs硬度7 7. 5，密度2. 9
3.2g/cm3。其中电气石含量不低于40%，平均粒径为0. 1 10 μ m，主要分布在我国新疆、 云南、广西、内蒙古等地。实施例中的硝化细菌购自中山市百皓生物工程有限公司，硝化细菌商品名为“硝 化宝”，其菌体OD6tltl为20左右，活菌数为109CFU/ml，该产品用于水产养殖环境中氨氮和亚 硝酸盐的生物降解。实施例1 按IOOOmL水中溶解碳酸氢钠1. 0g、硫酸铵0. 5g、碳酸钠0. 3g、氯化钠0. lg、磷酸 二氢钾 0. lg、硫酸镁 0. lg、硫酸亚铁 0. Olg 和 0. ImL 微量元素(FeCl3 · 6H20 1. 5g/L，H3BO3 0. 15g/L, CuSO4 · 5H20 0. 03g/L, KI 0. 18g/L, MnCl2 · 4H20 0. 12g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 12g/L，CoCl6 · H2O 0. 15g/L 和 EDTA 二钠 10g/L。)的配方制成硝化细菌的 培养基，用0. IM HCl调节pH至6.8，并以0.5%的质量比投加粒径为0. Iym的电气石到培 养基中。将硝化细菌以体积比10% (OD600 0 . 5左右)的接种量接种到培养基中，于28°C、溶 解氧为4. 0mg/L的条件下进行培养7d。7d后对硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行检测， 并将结果与没有优化前，原始培养方法培养得到的硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行对 比，发现硝化细菌菌悬液AOD6tltl = 0. 640，菌体量增加了 20%，氨氧化能力为680mgNH4+-N/ gMLSS ·(!，提高了 62%。本实施例与未经优化的结果相比，硝化细菌菌体量和氨氧化能力均 有较大的提高，特别是氨氧化能力，说明本发明的硝化细菌培养方法有利于硝化细菌生长繁殖的促进和氨氧化能力的提高。实施例2 按IOOOmL水中溶解碳酸氢钠4. 0g、硫酸铵1. 2g、碳酸钠0. 8g、氯化钠0. 5g、磷酸二氢钾 0. 5g、硫酸镁 0. 5g、硫酸亚铁 0. 05g 和 1. OmL 微量元素(FeCl3 · 6H20 1. 5g/L，H3BO3 0. 15g/L, CuSO4 · 5H20 0. 03g/L, KI 0. 18g/L, MnCl2 · 4H20 0. 12g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 12g/L，CoCl6 · H2O 0. 15g/L 和 EDTA 二钠 10g/L。)的配方制成硝化细菌 的培养基，用0. IM HCl调节pH至8. 0，并以5%的质量比投加粒径为0. 5 μ m的电气石到培 养基中。将硝化细菌以体积比15% (OD600 0 . 5左右)的接种量接种到培养基中，于34°C、 溶解氧4. Omg/L的条件下进行培养7d。7d后对硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行检测， 并将结果与没有优化前，原始培养方法培养得到的硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行对 比，，发现硝化细菌菌悬液Δ OD600 = 0. 680，菌体量增加了 28%，氨氧化能力为785mgNH4+_N/ gMLSS · d，提高了 87%。实施例3 按IOOOmL水中溶解碳酸氢钠2. 0g、硫酸铵1. 0g、碳酸钠0. 4g、氯化钠0. 3g、磷酸 二氢钾 0. 3g、硫酸镁 0. 3g、硫酸亚铁 0. 03g 和 0. 5mL 微量元素(FeCl3 · 6H20 1. 5g/L，H3BO3 0. 15g/L, CuSO4 · 5H20 0. 03g/L, KI 0. 18g/L, MnCl2 · 4H20 0. 12g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 12g/L，CoCl6 · H2O 0. 15g/L 和 EDTA 二钠 10g/L。)的配方制成硝化细菌 的培养基，用0. IM HCl调节pH至7. 4，并以2%的质量比投加粒径为0. 8 μ m的电气石到培 养基中。将硝化细菌以体积比12% (OD600 0 . 5左右)，于30°C、溶解氧4. 0mg/L的条件下进 行培养7d。7d后对硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行检测，并将结果与没有优化前，原 始培养方法培养得到的硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行对比，，发现硝化细菌菌悬液 Δ OD600 = 0. 710，菌体量增加了 34%，氨氧化能力为 950mgNH4+_N/gMLSS · d，提高了 127%。实施例4 按IOOOmL水中溶解碳酸氢钠3. 0g、硫酸铵0. 8g、碳酸钠0. 6g、氯化钠0. 3g、磷酸 二氢钾 0. 2g、硫酸镁 0. 3g、硫酸亚铁 0. 03g 和 0. 4mL 微量元素(FeCl3 · 6H20 1. 5g/L，H3BO3 0. 15g/L, CuSO4 · 5H20 0. 03g/L, KI 0. 18g/L, MnCl2 · 4H20 0. 12g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 12g/L，CoCl6 · H2O 0. 15g/L 和 EDTA 二钠 10g/L。)的配方制成硝化细菌 的培养基，用0. IM HCl调节pH至7.0，并以1 %的质量比投加粒径为0. 5 μ m的电气石到培 养基中。将硝化细菌以体积比12% (OD600 0 . 5左右)，于30°C、溶解氧4. 0mg/L的条件下进 行培养7d。7d后对硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行检测，并将结果与没有优化前，原 始培养方法培养得到的硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行对比，，发现硝化细菌菌悬液 AOD6qq = 0. 690，菌体量增加了 30%，氨氧化能力为 857mgNH4+-N/gMLSS. d，提高了 104%。实施例5 按IOOOmL水中溶解碳酸氢钠2. 5g、硫酸铵0. 6g、碳酸钠0. 5g、氯化钠0. 3g、磷酸 二氢钾 0. 3g、硫酸镁 0. 2g、硫酸亚铁 0. 02g 和 0. 6mL 微量元素(FeCl3 · 6H20 1. 5g/L，H3BO3 0. 15g/L, CuSO4 · 5H20 0. 03g/L, KI 0. 18g/L, MnCl2 · 4H20 0. 12g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 12g/L，CoCl6 · H2O 0. 15g/L 和 EDTA 二钠 10g/L。)的配方制成硝化细菌 的培养基，用0. IM HCl调节pH至7. 6，并以3%的质量比投加粒径为1.Oym的电气石到培 养基中。将硝化细菌以体积比10% (OD600 0 . 5左右)，于32°C、溶解氧4. 0mg/L的条件下进行培养7d。7d后对硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行检测，并将结果与没有优化前，原始培养方法培养得到的硝化细菌的菌体量和氨氧化能力进行对比，，发现硝化细菌菌悬液 AOD6qq = 0. 700，菌体量增加了 32%，氨氧化能力为 890mgNH4+_N/gMLSS · d，提高了 112%。
权利要求
一种提高硝化细菌氨氧化能力的培养方法，其特征在于在每1000mL水中溶解碳酸氢钠1.0-4.0g、硫酸铵0.5-1.2g、碳酸钠0.3-0.8g、氯化钠0.1-0.5g、磷酸二氢钾0.1-0.5g、硫酸镁0.1-0.5g、硫酸亚铁0.01-0.05g和微量元素0.1-1.0mL，组成培养基；然后调节培养基pH至6.8-8.0，以质量百分比0.5％-5％的比例投加电气石到培养基中；将硝化细菌按照体积百分比为10～15％的接种量接种至加有电气石的培养基中，在温度28℃-34℃、溶氧≥2.0mg/L的条件下培育7～10天；所述微量元素在培养基中配方组成为FeCl3·6H2O 1.5g/L，H3BO3 0.15g/L，CuSO4·5H2O0.03g/L，KI 0.18g/L，MnCl2·4H2O 0.12g/L，Na2MoO4·2H2O 0.06g/L，ZnSO4·7H2O 0.12g/L，CoCl6·H2O 0.15g/L和EDTA二钠10g/L。
2.根据权利要求1所述的提高硝化细菌氨氧化能力的培养方法，其特征在于，所述的 PH通过盐酸调节。
3.根据权利要求1所述的提高硝化细菌氨氧化能力的培养方法，其特征在于，所述的 电气石的粒径为0. 1 10 μ m。
全文摘要
本发明一种提高硝化细菌氨氧化能力的培养方法，在每1000mL水中溶解碳酸氢钠1.0-4.0g、硫酸铵0.5-1.2g、碳酸钠0.3-0.8g、氯化钠0.1-0.5g、磷酸二氢钾0.1-0.5g、硫酸镁0.1-0.5g、硫酸亚铁0.01-0.05g和微量元素0.1-1.0mL，以质量百分比0.5％-5％的比例投加电气石到培养基中；将硝化细菌按照体积百分比为10～15％的接种量接种至加有电气石的培养基中，在温度28-34℃、溶氧≥2.0mg/L的条件下培育7～10天；本发明使硝化细菌的生长代谢速度显著加快，平均降解能力比常规培养基提高了50％-120％，具有简单、重复性好、效果显著的特点。
文档编号C12N1/38GK101805720SQ20101012644
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者林炜铁, 罗剑飞 申请人:华南理工大学