专利名称：一株自养硝化细菌及其筛选和鉴定方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体地说，本发明涉及一种自养硝化细菌及其筛选鉴定 方法。
背景技术：
污水生物脱氮是水处理领域关注和研究的热点，城市污水处理厂采用的废水生物 脱氮工艺一般由硝化和反硝化作用共同完成。硝化作用分为两个阶段，首先由氨氧化细菌 把氨氮氧化为亚硝酸盐氮，然后由硝化细菌把亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮。硝化细菌分为 自养型硝化细菌和异养型硝化细菌两类，异养型硝化细菌仅占很少一部分，自养型硝化细 菌是参与生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污水处理系统的硝 化效果和生物脱氮效率，是污水生物脱氮的限制性因素。目前，硝化细菌的文献报道集中在 富集培养、异养菌的纯化分离培养和混合菌群的多样性研究方面，对污水生物脱氮起主要 作用的完全自养型硝化细菌纯化分离报道不多，主要是因为(1)自养型硝化细菌时代时 间长、生长速率慢；( 形态极其微小不易观察；C3)对环境因子变化敏感易受损；(4)生物 量小，生长迅速的伴生异养菌会掩蔽目标菌群，这给自养型硝化细菌的深入研究带来困难。经文献检索发现，现有技术公开的为申请号1786184A的中国发明专利，公开了异 养硝化细菌的分离筛选方法，将混合菌群涂布于牛肉膏-蛋白胨培养基中，30°C恒温培养 7 10d，在形成的菌落中挑取单菌落，划线纯化得到纯菌，然后将纯菌菌苔接种与硝化效 果鉴定培养基中进行硝化效果鉴定。申请号03118597. 5的中国发明专利，公开了一株异养 硝化细菌WR-2，培养方法及应用。还未有技术公开的自养硝化细菌，筛选鉴定方法的发明专 利。因此，筛选鉴定自养型硝化细菌显得尤为重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株自养硝化细菌，该菌株具有很好的硝化效果。本发明的另一个目的是为了解决现有的自养硝化细菌分离筛选困难，提供筛选和 鉴定自养硝化细菌的方法。本发明所提供的自养硝化细菌N. W-3，已于2009年11月05日保藏在位于北京 市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 3390，分类命名为维氏硝化杆菌Nitrobacter winogradskyi。经过富集培养和多次分离筛选得到的优势菌株N. W-3的硝化效果高达90%，硝化 速率最高可达42. 7mg/L*d，具体结果见图1。N. W-3菌落乳白色、湿润、针尖大小，细胞为短 杆状，革兰氏阴性，吲哚实验、明胶液化实验、甲基红实验、淀粉水解试验均为阴性，需养性 实验、接触酶实验为阳性，葡萄糖产酸试验结果不产酸，系统发育地位见图4。本发明自养硝化细菌的筛选和鉴定是按下述步骤实现的首先是自养硝化细菌的筛选，共包括以下六个步骤
(1)稀释菌源取活性污泥做微生物菌源，将样品与无菌水按体积比1 9的比例 放入盛有玻璃珠的三角瓶中，在恒温、150r/min的条件下，空气浴摇床振荡15min，使 微生物菌群分布均勻；(2)制备富集培养基向 IOOOmL 超纯水中加入 NaNO2 0. 0-1. 5g、NaCl 0. 1-0. 6g、 K2HPO4 0. 0-0. 7g、MgSO4 0. 5-1. 0g、FeSO4 0. 1-0. 6g 和 Na2CO3 0. 5-1. 5g,调节 pH = 7· 8，并 121 °C高温灭菌30min ；(3)富集培养将稀释好的样品按体积比1 9的比例接种至装有硝化细菌富集 培养基的锥形瓶中恒温黑暗培养8个月。培养前期用二苯胺试剂检测N03_的生成情 况，二苯胺试剂可以使NO3-生成蓝色的物质，根据是否变蓝和蓝色的深浅可以指示是否有 NO3-生成，当蓝色深时，取吸取富集液至装有新鲜培养液的锥形瓶中继续富集培养，不断淘 汰杂菌。培养后期进行硝化效果定量检测(测定Ν02 、Ν03 、TN的变化情况)，当NO3-N的 生成率在90%以上时，吸取富集液至装有新鲜培养液的锥形瓶中继续富集培养，不断淘汰 杂菌；(4)制备分离培养基在 IOOOmL 超纯水中加入 NaNO2 0. 5-1. 2g，NaClO. 2-0. 5g， K2HPO4 0. 15-0. 8g, MgSO4 0. 05-0. 7g, FeSO4 0. 15-0. 4mg, (NH4)6Mo7O24O. 05-0. 6mg, CaCO3 1.0-3. Omg，调节pH = 7.8，并121°C高温灭菌30min，以质量分数2 %的琼脂糖做平板分离 支持物；(5))细菌的分离纯化选取硝化效果好的富集培养液，采用“十字划线法”进行平 板分离培养。恒温、黑暗培养14 21d，观察菌落生长情况，待长出针尖大小的菌落后， 挑取单菌落至分离平板，重复划线分离2 6次；(6)对步骤( 得到的纯菌株用接种环挑取一接种环菌苔接种与硝化细菌分离培 养基中，恒温黑暗培养14d，测定N02-N、N03-N、TN的变化情况，选取硝化效果好的菌株， 即完成对自养硝化细菌的筛选。然后是对筛选出的自养硝化细菌进行16S rDNA的鉴定，共包括以下两个步骤(1)观察菌落的形态大小、革兰氏染色和生理生化实验，所得结果与《伯杰士细菌 鉴定手册》比较，初步确定该自养硝化细菌属于硝化杆菌属；(2)提取该细菌的DNA进行PCR扩增，建立单克隆体系，对阳性重组子测序，将测序 得到的核酸序列与GenBank核酸数据库进行比对分析，确定该细菌的系统发育分析地位。本发明PCR扩增的引物F 为 5' GGTGAATTCATGGACATCCGAGCTCAAGTT,R 为 5' GCAAAGCTTTTACTAGAAGCCTATGGTCCTCT ；本发明PCR扩增的体系10XPCRBuffer :5μ L “。!!!!!!(^/!^々(!^!^含！^2+) 1 μ L ； DNA 模板IyL ；正反向引物(10pmol/L)各 1 μ L ;primestar 聚合酶(5U/μ L) :0. 5yL;超 纯水40. 5 μ L。PCR扩增的程序94°C预变性5min ；94°C变性50s ；54°C退火50s ；72°C延伸 lmin30s ；35个循环；72°C后延伸IOmin程序；本发明的克隆体系4 μ L回收的PCR产物、1 μ LpEASY-blunt载体，室温反应 15min。加连接产物至50 μ L大肠杆菌Trans-T感受态细胞中，冰浴30min，42°C热击30s， 立刻置于冰上anin，然后加入至300 μ L LB (不含Kan+)培养基中，37°C、180r/min孵育lh。 取200 μ L菌液涂布LB平板(含X-Gal、IPTG、Kan+)，隔夜孵育，挑取平板上的白色菌落于600 μ L的LB培养基中，37°C培养4小时，重组子进行PCR阳性检测。相对于现有技术，本发明具有下述优点(1)筛选出了一种自养硝化细菌。(2)提供了一种自养硝化细菌筛选的方法，解决了由于自养硝化细菌生物量小， 异养菌生长速度快，容易占优势而造成的自养硝化细菌筛选困难，该方法采用不同的富集 和分离培养基不断淘汰异养菌，“十字划线法”分离单株纯菌，通过测定NO2-N、NO3-N, TN等 指标反应硝化效果，根据硝化效果筛选出菌株N. W-3。(3)提供了一种结合传统微生物学和现代分子生物学鉴定硝化细菌的方法。
图1为N. W-3的硝化效果图；图 2 为 N. W-3 的 16S rDNA 的 PCR 扩增图；图3为N. W-3的重组子阳性检测的琼脂糖电泳图；图4为N. W-3的系统发育图。
具体实施例方式结合具体实例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明而不用于限制本发明 要求保护的范围。实施例1自养硝化细菌的筛选(1)菌源稀释取北京市肖家河污水处理厂A2/0处理工艺的好氧段活性污泥作为菌源。将活性 污泥与无菌水按体积比1 9的比例放入盛有玻璃珠的三角瓶中，28°C恒温、150r/min的条 件下，空气浴摇床振荡15min，使微生物菌群分布均勻。(2)富集培养基的制备称取NaNO2 lg, NaCl 0. 5g, K2HPO4 0. 5g, MgSO4 0. 5g, FeSO4 0. 4g, Na2CO3Ig,用超 纯水定容至lOOOmL，调节pH值至7. 8，121°C高温灭菌30min。(3)富集培养将稀释好的菌源按体积比1 9的比例接种至装有硝化细菌富集培养液的锥形瓶 中，28°C恒温黑暗富集培养，培养前期用二苯胺试剂检测N03_的生成情况，二苯胺试剂可以 使N03_生成蓝色的物质，根据是否变蓝和蓝色的深浅可以指示是否有N03_生成，当蓝色深 时，取吸取富集液至装有新鲜培养液的锥形瓶中继续富集培养，不断淘汰杂菌。培养后期进 行硝化效果定量检测(测定N02-N、NO3-N, TN的变化情况)，直至在7d左右，NO3-的生成率 在90%以上，进行分离纯化培养。经过几个月不断更换培养基的富集培养，硝化效果定量检测结果表明在3. 3天 左右时硝酸盐氮大量生成，并且积累量开始超过亚硝酸盐氮，硝化细菌进入对数生长期，第 6天时，亚硝酸盐氮全部转化为硝酸盐氮，完全自养型硝化细菌富集培养取得了预期结果。(4)分离培养基的制备称取NaNO2 IgjNaCl 0. 5g, K2HPO4 0. 15g, MgSO4 0. 05g, FeSO4 0. 15mg，(NH4)6Mo7O24 0. 05mg, CaCO3 :3mg，超纯水定容至lOOOmL，调节pH值至7. 8，121 °C高温灭菌30min，以质量分数2%的琼脂糖做平板分离支持物。(5)细菌的分离纯化采用“十字划线法”接种富集培养后的菌源至琼脂糖平板分离培养。恒温黑暗 培养14 21d，待长出针尖大小的菌落后，挑取单菌落至分离平板，重复划线分离3次。通 常，可以认为一个菌落是由一个细胞发育而来，因此是由一个种类细菌组成的。可是，也有 由几类不同的几个细菌细胞形成一个菌落的可能，所以，为了慎重起见需要对这些菌落进 行多次分离纯化。经过2 3周琼脂糖平板分离培养，平板上长出13株无色或乳白色针尖大小菌 落。通过连续3代单菌落纯化培养，淘汰重复菌落，最后分离得到7株无色或乳白色的菌落， 编号为N. W-I至N. W-7。(6)细菌的硝化效果测定用接种环分别挑取N. W-I至N. W-7 一接种环分离纯化后的细菌菌苔接种与硝化细 菌分离培养基(不加琼脂糖)J8°C恒温黑暗培养14d，用离子色谱(DIONEX IC-1000)和 T0C(SHIMADZU TOC-Vcph)分别测定Ν02_Ν、N03-NTN的变化情况，每隔2天测定一次。菌株N. W-3具有最理想的硝化效果，结果如图1所示，从图1可知N. ff-3在第0 4天，硝酸盐氮的转化率为0 ；第4 8天，开始有硝化效果，并且硝化速率逐渐增，N. W-3在 第4天后，硝化速率为7. 35mg/L · d ；第6天后，硝化速率为14. 7mg/L · d ；第8 10天为 对数生长期，硝化速率最快，第8天后，硝化速率为42. 7mg/L · d ；第10 14天，进入稳定 生长期，第10天后，硝化速率为27. 8mg/L · d，第12天后，为9. 54mg/L · d，亚硝酸盐氮在第 14天全部转化为硝酸盐氮，硝化效果可达100%。根据硝化效果，初步确定其为自养硝化细 菌，完成自养硝化细菌的筛选。实施例2自养硝化细菌的鉴定(1)形态观察、生理生化实验N. W-3菌落乳白色、湿润、针尖大小，细胞为短杆状；参照《微生物学实验》对分离出的菌株进行革兰氏染色实验和相应的生理生化实 验。实验结果为革兰氏阴性；喷哚实验、明胶液化实验、甲基红实验、淀粉水解试验均为阴 性，需养性实验、接触酶实验为阳性，葡萄糖产酸试验的结果是不产酸。参照《伯杰士细菌鉴定手册》，初步确定活性污泥中分离出的菌株N. W-3属于硝化 杆菌属。(2) 16S rDNA 鉴定采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取N. ff-3的DNA，用作16SrDNA扩增的 模板。应用Oligo 软件设计引物,F 为 5' GGTGAATTCATGGACATCCGAGCTCAAGTT，R 为 5' G CAAAGCTTTTACTAGAAGCCTATGGTCCTCT,预期扩增片段大小为1500bp左右，引物序列由上海生 工生物工程技术服务有限公司(北京合成部)合成。PCR反应体系(50 μ L)组成10XPCR Buffer :5μ L ； 10mmol/L 的 dNTP (含 Mg2+) 1 μ L ;DNA 模板1 μ L ；正反向引物(10pmol/L) 各IyL ;primestar聚合酶(5U/ μ L) :0. 5 μ L ；超纯水40. 5 μ L。PCR反应条件94 °C预变性 5min ；94°C变性 50s ；54°C退火 50s ；72°C延伸 lmin30s ；35 个循环；72°C后延伸 lOmin。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析，通过和marker (DL2000)比较片段大小确定是否为目的片段，N. W-3的16S rDNA的PCR扩增结果见图2，由图可知，条带在1500bp左右，为目的条带。含有目的片段的PCR产物用TIANGEN DNA胶回收试剂盒进行片断回收。在微型离 心管加入4μ L回收的PCR产物、1 μ LpEASY-blunt载体，轻轻混合，室温反应15min。加连 接产物至50 μ L大肠杆菌Trans-T感受态细胞中，轻弹均勻，冰浴30min，42°C热击30s，立 刻置于冰上anin，然后加入至300 μ L LB (不含Kan+)培养基中，37°C、180r/min孵育lh。 取200 μ L菌液涂布LB平板(含X-Gal、IPTG、Kan+)，隔夜孵育，挑取平板上的白色菌落于 600 μ L的LB培养基中，37°C培养4小时，PCR扩增进行重组子阳性检测。阳性检测采用Ml3F 和 M13R 引物，M13F :TGTAAAACGACGGCCAGT ；M13R :CAGGAAACAGCTATGACC。PCR 产物经 1 %琼 脂糖凝胶电泳分析，通过和marker (DL2000)比较片段大小确定是否克隆成功，N. ff-3的重 组子阳性检测的琼脂糖结果见图3，由图可知重组子的阳性率可达100%。克隆成功的样品 送往测序公司进行测序，所得序列长度为lM2bp，结果见序列。将所得序列与GenBank核酸数据库进行同源性比对分析，结果表明，菌株N. ff-3与 Nitrobacter Winogradskyi98%, % NitrobacterHamburgensis 白勺;!5Pj 相似性为90%。从中挑选部分相似性高的菌株以及一些常见的硝化细菌作系统发育分析， 用MEGA软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，见图4，由图可知N. ff-3与 Nitrobacter Winogradskyi 的遗传距离最近，与常见硝化杆菌Nitrobacter Hamburgensis 禾口 Preudomonas aeruginosa的遗传距离较近，与硝化球菌Nitrococcus oceanus较远，而 与Nitrosomonaseuropaea的遗传距离最远。根据同源性比对和系统发育分析结果表明， N. W-3为维氏硝化杆菌。序列表
菌株N. W-3的核藤？序列，长度为1542bp
1ATGGACATCCGAGCTCMGTTTCGATGGTCTTTCACCTGGACAAGTGCATCGGTTGCCAC
61ACCTGCAGCATCGCGTGCAAGAACATCTGGACCGATCGCAAGGGCACCGAGTACATGTAC
121TGGAACMCGTGGAGACCAAGCCGGGTACGGGTTACCCGACACGTTGGGAAGACCAGACC
181AAGTATCGTGGCGGCTGGGTGGTTGACGGTCAGAGGCAGAAGAGCCTTCGGCTTCGGCTG
241CAGGGCMGTGGGGAACGCTGACGAACATTTTCTACAACCCCTATCTGCCGACGCTTGAC
301GACTATTTCGAGCCGTGGACCTACGATTACCAGAACCTGATCAATGCGCCGCTGGCTGAC
361GAGCAGCCGACCGCGCGGGCGATCTCGATGGTGACCGGCAAATACATGGACACGATCGAG
421GCGGGCCCGAACTGGGACGACGACCTCGGCGGTTCGCAGGTTTACGCCAACAACGACCCG
481AACTTCGACGGCGCTTCCGATGAGGMATGCGCCAGATCAACGAGATCAACAGCACGGTG
541TTTTTCTATCTGCCGCGCATCTGCAACCATTGCCTCAATCCGGGATGCGTTGCGGCCTGT
601CCGCAGGGCGCGCTCTACAAGCGCGGCGAGGACGGCGTTGTGCTGGTGAGCCAGGAACGC
661TGCCGCGCCTGGCGCATGTGCGTCTCCGGCTGCCCCTACAAGAAGACCTACTTCAACTGG
721TCGACGGGCAAGGCCGAGAAGTGCATCCTGTGCTATCCGCGCCTTGAGAGCGGCCAGCCG
781CCGGCGTGTTTCCACTCCTGCGTGGGACGCATCCGGTATATCGGCCTCGTGCTTTACGAT
841GCGGATGCGATCGAGGAGACCGCGAAGTCGCCGCAGGATCAGCTGGTGATGGCCCAGCGC
901AACATCATCAAGGATCCGTTTGATCCGGAGATCATCGCGGCCGCGAGGGCCAACGGGATT
961CCGGACTCCAAGATTGAGGCGGCTCAGAAGTCTCCGGTATTTCAGTTCGTGAAGAAGTGG
1021GGCATCGCGCTGCCGCTGCATCCGGAGTTCCGCACGCTGCCGATGCTGTTCTATGTGCCG
1081 CCGCTGGGGC CGGTTCTGGC CAAGGTGGAG AACGGCGTGT ACGACAATGT AGCCAATGM1141 GCGCGGCTGG GACCGCTGAT GAGCTCGCTC GAACGGTCGC GTATTCCGCT TCGGTACATG1201 GCGAGCCTGC TGTCGGGCGG CAATGAGGAG ATCATCCGCG ACGTCTACAA GAAGCTGGTT1261 GCGGTGCGCG TCTACATGCG TTCGCGGAAG GTCAAGGACA TTCCGGACGA GGAGGTGCAG1321 CGGGCGCTGT CCGAAGGCAA GACCACCGCG GCGGAGGTCG AGGCGATCTG GCGTCTGACA1381 TCGATGCCAA CCTTCGAGGA GCGCTTCGTG GTTCCGCCGA TGGAGCGCGA GACGGCGGTT1441 GATGCCCTGT TCCCGCAGCT CGATCCGGTC TCTCATAACT ACCCGATCCG CAAGGGCGCG1501 GTCGGCGTCG GCTTCCACAC CGATCCGGCA AGAGGACCAT AGGCTTCTAG注ATG为起始密码子；TAG为终止密码子。
权利要求
1.一株具有硝化作用的细菌，其生物学特征在于该细菌是短杆菌N. W-3，保藏登记号 为CGMCC3900，命名为Nitrobacter winogradskyi。
2.一种如权利要求1中所述细菌的筛选方法，该方法是在PH值7. 恒温黑暗培 养的条件下，经过液体富集培养和平板分离培养筛选权利要求1中所述的细菌。
3.—种如权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于菌源稀释方法，该方法是将样品 与无菌水按体积比1 9的比例放入盛有玻璃珠的容器中恒温、150r/min的条件下， 空气浴摇床振荡，使微生物菌群分布均勻。
4.一种如权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于富集培养基制备方法，该方法 是向 IOOOmL 超纯水中加入 NaNO2 0. 0-1. 5g、NaCl 0. 1-0. 6g、K2HPO4 0. 0-0. 7g、MgSO4 0. 5-1. 0g、FeSO4 0. 1-0. 6g 禾口 Na2CO3 0. 5-1. 5g，调节 pH = 7. 8，并 121 °C高温灭菌 30min。
5.一种如权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于富集培养方法，该方法是将稀释 好的样品按体积比19的比例接种至装有硝化细菌富集培养液的锥形瓶中。
6.一种如权利要求5中所述的筛选方法，其特征在于富集培养方法的NO3-检测方法， 该方法采用二苯胺试剂检测N03_的生成情况。
7.—种如权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于分离培养基制备，是在IOOOmL 超纯水中加入 NaNO2 0. 5-1. 2g, NaCl 0. 2-0. 5g, K2HPO4 0. 15-0. 8g, MgSO4 0. 05-0. 7g, FeSO4O. 15-0. 4mg, (NH4)6Mo7O24 0. 05-0. 6mg, CaCO3 1. 0-3. Omg，调节 pH = 7. 8，并 121 °C高 温灭菌30min。
8.—种如权利要求7中所述的筛选方法，其特征在于所述分离培养基制备是以质量分 数1-5%的琼脂糖做平板分离支持物。
9.一种如权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于细菌分离纯化方法，该方法是采 用“十字划线法”进行平板分离培养，并恒温、黑暗培养14 21d，重复划线分离2-6 次。
10.一种权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于细菌分离纯化方法的硝化效果，将 分离纯化后获得的菌株用接种环挑取一接种环菌苔接种与硝化细菌分离培养基进行硝化 效果检测，28°C恒温黑暗培养14d，测定N02-N、NO3-N, TN的变化情况。
11.一种权利要求要求1中所述细菌的鉴定方法，该方法是采用16S rDNA鉴定方法。
12.如权利要求11中所述的鉴定方法，其特征在于PCR扩增程序，该程序是94°C预变 性 5min、94°C变性 50s、54°C退火 50s、72°C延伸 lmin30s、;35 个循环、72°C后延伸 lOmin。
13.如权利要求11中所述的鉴定方法，其特征在于PCR扩增体系，该体系是 IOXPCRBuffer 5 μ L、10mmol/L 的 dNTP (含Mg2+) 1 μ L、DNA 模板 1 μ L、正反向引物(lOpmol/ L)各 1 μ L、primestar 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ L、超纯水 40. 5 μ L。
14.如权利要求11中所述的鉴定方法，其特征在于PCR扩增引物，该引物是F 为 5' GGTGAATTCATGGACATCCGAGCTCAAGTT,R 为 5 ‘ GCAAAGCTTTTACTAGAAGCCTATGGTCCTCT。
15.如权利要求11中所述的鉴定方法，其特征在于克隆体系，该体系是3-5μ L回收 的PCR产物、1 μ LpEASY-blunt载体，室温反应10_20min。加连接产物至50 μ L大肠杆 菌Trans-T感受态细胞中，冰浴30min，42°C热击30s，立刻置于冰上2_3min，然后加入至 300 μ L LB (不含 Kan+)培养基中，37°C、180r/min 孵育 0. 5-1. 5h。取 200 μ L 菌液涂布 LB平板(含X-Gal、IPTG、Kan+)，隔夜孵育，挑取平板上的白色菌落于600 μ L的LB培养基中， 37°C培养2-5小时，重组子进行PCR阳性检测。
全文摘要
本发明属于微生物领域，具体地说，本发明公开了一种新的自养硝化细菌，该细菌有很好的硝化效果。同时，本发明还公开了该细菌的筛选和鉴定方法，该方法简单有效、选择性强，解决了自养硝化细菌分离困难的难题。
文档编号C12Q1/04GK102071157SQ200910223298
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者刘鸿亮, 周岳溪, 宋宏宾, 蒋进元, 陈梅娟 申请人:中国环境科学研究院