专利名称：一种利用聚氨酯海绵固定白腐真菌去除水中2,4-二氯苯酚的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物固定化载体，更具体来讲，本发明涉及一种结合化学吸附作 用的聚氨酯海绵生物固定化载体，以及使用该固定化载体去除水中2， 4- 二氯苯酚的方法。
背景技术：
氯酚类物质是一类难降解化合物，长期以来被广泛应用于木材防腐、杀虫剂以及 除草剂的生产。其中，2， 4-二氯苯酚是一种有毒、难降解的污染物，广泛存在于农药、染料和 增塑剂等的生产废水中。美国、中国等国家已把其列入水中有害物质或优先污染物黑名单。 因此，如何消除环境中氯酚类化合物的污染成为受到广泛重视的课题。目前，随着在环保以 及可持续发展方面的要求不断提高，出现了多种用于控制氯酚污染的方法，其中的一种途 径即为水处理生物反应。尽管生物处理也存在一些问题，但是由于它的低成本使它仍然是 解决氯酚类化合物污染问题的最好方法。 近年来，许多研究表明在含氯酚类化合物废水处理中白腐真菌是很有发展前景的 微生物。白腐真菌是一类可以降解木质素的丝状真菌，由于其特有的木质素降解酶系，白腐 真菌能非特异性地降解氯酚类、多氯联苯、多环芳烃、染料等难降解有机污染物，并能够将 氯酚类化合物彻底降解为二氧化碳和水。如果将其大规模应用于水处理生物反应，可有效 控制水处理成本。但是没有经过处理的白腐真菌在生长的过程中菌丝不断伸长，容易被振 荡产生的机械剪切力破坏，进而影响其正常生长，抑制酶活。为了达到更好的降解效果，势 必需要选择特定的载体来固定白腐真菌，以期更彻底地降解水中氯酚类污染物。
生物固定化技术是通过一定的固定化手段让微生物附着生长在载体里的技术。固 定化微生物技术以其在重复利用性和稳定性方面的优势具有良好的应用前景。按照固定载 体及固定方式不同，生物固定化方法大致可以分成吸附法、包埋法、交联法和共价键结合法 四种。交联法和共价键结合法都是利用两个或两个以上的功能团制剂，直接与微生物肽链 某些氨基酸残基进行交联反应，从而与微生物形成共价键使微生物固定化的方法(例如参 见中国专利公开文件CN 1478734A)。但这两种方法化学反应激烈，对微生物活性影响较大， 使用的交联剂大多有毒且价格昂贵，从而限制其在实际中的应用。包埋法是用高分子水凝 胶材料形成将微生物固定化的网络、微囊等，或利用水溶单体聚合形成凝胶时将微生物包 埋在其内(例如参见中国专利公开文件CN 1277942A)。该方法对微生物活性影响较小，但 因其载体网络结构的阻碍而不利于传质，且水凝胶耐冲击性不佳、寿命短。而一般吸附法所 采用的载体强度较低，在厌氧条件下易被微生物分解且传质性能较差，在进行微生物固定 时易造成细胞失活。 相比之下，聚氨酯作为一类高分子材料物化性能稳定，价格低廉，易于处理回收， 作为细胞固定化载体具有应用研究的潜力。以聚氨酯海绵作为固定生物载体具有如下优 势首先是多孔性与亲水性；其次，聚氨酯海绵化学性能稳定，在酸/碱性水溶液中不溶解、 抗水解能力强；再者，聚氨酯的生物承载量和传质速率高，相容性好，可以有效吸附固定微生物，适用于对多种污水执行生物反应处理。此外，聚氨酯海绵具有可靠的生物安全性，利 于微生物附着生长。迄今为止，还未出现使用聚氨酯海绵作为生物固定化载体的报道。
发明内容
基于上述考虑，本发明的目的是提供一种利用具有较强吸附能力的生物载体固定
白腐真菌去除水中2，4-二氯苯酚的方法。该方法可保持聚氨酯泡沫与微生物结合处理污
水所具有的优点，同时又能克服一般固定化方法载体强度和传质性能的不足。该方法可以
避免白腐真菌细胞在固定时失活，改善载体强度，还可以提高固定化白腐真菌对2，4-二氯
苯酚的去除率。本发明通过选择载体的原料并对其进行加工实现了上述目的。 根据本发明的一方面，本申请提供了一种用于水处理的聚氨酯海绵生物固定化载
体的方法，该方法包括步骤 1)将聚氨酯海绵切割成大小为2X1X1立方厘米的长方体，室温下，在体积分数 为70%的乙醇溶液中浸泡4小时，除去海绵碎屑； 2)用超纯水将上述聚氨酯海绵清洗3次，将烘箱温度设为12(TC焙干； 3)将得到的块状聚氨酯海绵放入装有无机盐液体培养基的锥形瓶中，每100毫升
无机盐液体培养基中加入2块海绵； 4)超声处理30分钟； 5)12rC高温灭菌20分钟，灭菌结束后冷却至室温即获得固定化用的聚氨酯海绵 载体； 通过上述方法得到的载体表面多孔性良好，可以吸附固定微生物。所述聚氨酯海 绵载体是一种由海绵塑料构成的基体，具有能允许载体内部与外面自由进行液体和气体交 换的贯通式孔隙。 根据本发明的另一方面，本申请提供了固定化白腐真菌去除水中2，4-二氯苯酚 的方法，该方法包括步骤 1)将于-S(TC条件下低温贮存的白腐真菌菌种通过梯度升温进行化冻，静置至室 温，在无菌条件下接入无机盐液体培养基中； 2)将装有无机盐液体培养基的锥形瓶放入恒温摇床中静置12小时，进行白腐真 菌与载体的固定化反应，获得固定化白腐真菌；
3)提高摇床的转速，恒温振荡培养； 4)菌种培养至对数生长前期，向锥形瓶中加入2，4_ 二氯苯酚废水； 5)用高效液相色谱仪测定12小时内2，4-二氯苯酚的残留，进样前将样品在6000
转/分条件下离心20分钟，取上清液。 本发明中，所述的无机盐液体培养基组成成分为葡萄糖10克/升，酒石酸铵 0. 22克/升，磷酸二氢钾0. 2克/升，硫酸镁0. 05克/升，氯化钙0. 01克/升，维生素
毫克/升。 本发明中，所述的白腐真菌优选使用黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。
下面结合附图和实施例对本方法进一步说明。 图1游离态与固定化白腐真菌降解2，4_ 二氯苯酚(初始浓度为10mg/L)比较。
具体实施例方式
下文将结合具体的实施方式对本发明作详细的介绍，但这些描述仅是示例性的。 通过在体积分数为70%的乙醇溶液中浸泡，除去海绵碎屑，得到一种聚氨酯生物固定化载 体。其表现出多孔性与亲水性的特性；化学性能稳定，在酸/碱性水溶液中不溶解、抗水解 能力强；生物承载量和传质速率高，相容性好，可以有效吸附固定微生物，适用于对多种污 水执行生物反应处理。此外，聚氨酯海绵具有可靠的生物安全性，利于微生物附着生长。本 方法成功实现了白腐真菌固定化细胞活性高及规模化制备。 将聚氨酯海绵切割成大小为2X1X1立方厘米的长方体。室温下，在体积分数为 70%的乙醇溶液中浸泡4小时，除去海绵碎屑。将上述聚氨酯海绵用超纯水清洗3次，将烘 箱温度设为12(TC焙干。将得到的块状聚氨酯海绵放入锥形瓶中，每100毫升无机盐液体培 养基中加入2块海绵，调节pH至4 6，使用功率200瓦、频率40千赫兹的超声波清洗器超 声处理30分钟，置于12rC高温灭菌20分钟。灭菌结束并冷却至室温后，用注射器和针头 式过滤器(带膜灭菌)向无机盐液体培养基中加入无菌20%葡萄糖溶液，在无菌条件下接 种白腐真菌，再将装有无机盐液体培养基的锥形瓶放入温度恒定的摇床中静置12小时，进 行白腐真菌与载体的固定化反应。然后将摇床的转速提高，恒温振荡培养培养至菌种对数 生长前期，向含有高效微生物和无机盐液体培养基的锥形瓶中加入一定浓度2，4-二氯苯 酚废水。利用高效液相色谱仪测定一段时间内氯酚的残留，进样前将样品在6000转/分的 条件下离心2分钟，取上清液。 以黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)降解水中的2， 4_ 二氯苯酚 为例 1.聚氨酯海绵的预处理 1)将聚氨酯海绵切割成大小为2X1X1立方厘米的长方体，室温下，在体积分数 为70%的乙醇溶液中浸泡4小时，除去海绵碎屑； 2)用超纯水将上述聚氨酯海绵清洗3次，将烘箱温度设为12(TC焙干； 3)将得到的块状聚氨酯海绵放入装有无机盐液体培养基的锥形瓶中，每100毫升
无机盐液体培养基中加入2块海绵，调节pH至4. 5 ; 4)使用功率200瓦、频率40千赫兹的超声波清洗器超声处理30分钟；
5) 12rC高温灭菌20分钟，灭菌结束冷却至室温； 6)用注射器和针头式过滤器(带膜灭菌)向IOO毫升无机盐液体培养基中过滤加 入5毫升无菌质量分数为20%的葡萄糖溶液，保持无机盐液体培养基中葡萄糖终浓度为4 克/升； 7)用注射器和针头式过滤器(带膜灭菌)向IOO毫升无机盐液体培养基中过滤加 入25微升浓度为100克/升的无菌维生素B工溶液，保持液体培养基中维生素B工终浓度为 25毫克/升。 2.固定化白腐真菌的制备及水中2，4-二氯苯酚的去除
1)将于-S(TC条件下低温贮存的白腐真菌菌种通过梯度升温进行化冻，静置至室
温，在无菌条件下接入无机盐液体培养基中，接种量为1乂105个孢子/毫升； 2)将装有无机盐液体培养基的锥形瓶放入温度为3(TC的恒温摇床中静置12小
时，进行白腐真菌与载体的固定化反应，获得固定化白腐真菌； 3)将摇床的转速提高至160转/分，于3(TC条件下恒温振荡培养； 4)培养7天后，向含有白腐真菌和无机盐液体培养基的锥形瓶中加入含有2，4-二
氯苯酚的废水，保持锥形瓶内溶液中2，4-二氯苯酚的初始浓度为10毫克/升； 5)用高效液相色谱仪测定12小时内2，4-二氯苯酚的残留，进样前将样品在6000
转/分条件下离心20分钟，取上清液。 以游离态白腐真菌和空载体(不含白腐真菌)作为对照组，以固定化白腐真菌为 实验组，实验结果如图1。实验结果显示，12小时内对2，4-二氯苯酚的去除率只有14%。 虽然在实验中发现，聚氨酯海绵对氯酚类污染物有一定的吸附效果，但采用本方法固定化 的白腐真菌对2，4-二氯苯酚的平均去除率达到了 79%以上。并且实验中发现采用本方法 制备的固定化白腐真菌在聚氨酯海绵表面聚集成团，呈椭球状，菌落生长状态良好，显著提 高了白腐真菌对2， 4- 二氯苯酚的降解率。 本方法的有益效果是固定化白腐真菌强度高，弹性好，不易破碎，利于长期反复 使用，可有效降低生产成本，实现规模化制备；而且采用本方法制备的固定化白腐真菌与产 物容易分离，简化了分离工序的同时还可获得高品质的产品；另外，本方法所采用的聚氨酯 海绵载体不易被微生物分解也不易造成微生物失活，且固定化操作简单，并可显著提高固 定化白腐真菌对2，4-二氯苯酚的降解率，具有良好的应用前景。
权利要求
一种利用聚氨酯海绵固定白腐真菌去除水中2，4-二氯苯酚的方法，该方法包括步骤1)载体的预处理a)将聚氨酯海绵切割成大小为2×1×1立方厘米的长方体，室温下，在体积分数为70％的乙醇溶液中浸泡4小时，除去海绵碎屑；b)用超纯水将上述聚氨酯海绵清洗3次，将烘箱温度设为120℃焙干；c)将得到的块状聚氨酯海绵放入装有无机盐液体培养基的锥形瓶中，每100毫升无机盐液体培养基中加入2块海绵；d)超声处理30分钟；e)121℃高温灭菌20分钟，灭菌结束后冷却至室温即获得固定化用的聚氨酯海绵载体；2)白腐真菌的固定化及水中2，4-二氯苯酚的去除a)将于-80℃条件下低温贮存的白腐真菌菌种通过梯度升温进行化冻，静置至室温，在无菌条件下接入无机盐液体培养基中；b)将装有无机盐液体培养基的锥形瓶放入恒温摇床中静置12小时，进行白腐真菌与载体的固定化反应，获得固定化白腐真菌；c)提高摇床的转速，恒温振荡培养；d)菌种培养至对数生长前期，向含有白腐真菌和无机盐液体培养基的锥形瓶中加入含有2，4-二氯苯酚的废水；e)用高效液相色谱仪测定12小时内2，4-二氯苯酚的残留，进样前将样品在6000转/分条件下离心20分钟，取上清液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚氨酯海绵载体是一种由海绵塑 料构成的基体，具有能允许载体内部与外面自由进行液体和气体交换的贯通式孔隙。
3. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的无机盐液体培养基组成成分为葡萄糖10克/升，酒石酸铵0. 22克/升，磷酸二氢钾0. 2克/升，硫酸镁0. 05克/升，氯化 钙0. 01克/升，维生素毫克/升。
4. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述的白腐真菌为黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)。
全文摘要
本发明公开了一种利用聚氨酯海绵固定白腐真菌去除水中2，4-二氯苯酚的方法，属于环境微生物领域。该方法包括载体的预处理，固定化白腐真菌的制备以及对水中2，4-二氯苯酚的去除。该载体具有多孔性、亲水性与强吸附性的特性；化学性能稳定，在酸/碱性水溶液中不溶解、抗水解能力强；生物承载量和传质速率高，相容性好。固定化该载体可以有效吸附及固定白腐真菌，显著提高固定化白腐真菌对水中2，4-二氯苯酚的去除能力，并使得固定化白腐真菌与产物易于分离。该载体适用于对多种污水执行生物反应处理。
文档编号C02F3/34GK101734801SQ200910215720
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者李晓锋, 李艳霞, 牛军峰, 王乐实, 王姣, 盛美玲, 蒋国翔 申请人:北京师范大学