一种提高厌氧氨氧化包埋颗粒活性的方法与流程

本发明属于废水处理领域，涉及废水处理过程中常用的微生物固定化技术，具体涉及一种能够提高厌氧氨氧化包埋颗粒活性的方法。

背景技术：

以厌氧氨氧化为主体的脱氮过程以其脱氮效率高，能耗与成本低等优点在废水生物脱氮工艺中具有良好的应用前景。在这一过程中，厌氧氨氧化菌以亚硝酸盐为电子受体，将氨氮氧化为氮气。与传统脱氮工艺相比，厌氧氨氧化系统具有需氧量少，不需外加有机碳源，产生的剩余污泥量少的优点。而相关研究表明厌氧氨氧化菌增殖速度极为缓慢，倍增时间长达11天，并且厌氧氨氧化污泥是anammox菌、厌氧菌、兼性菌和好氧菌组成的复杂微生物共生体系，因此往往导致难以在反应器内维持较高的厌氧氨氧化微生物量。为了实现反应器内厌氧氨氧化微生物的高浓度、低流失，采用微生物固定化技术将厌氧氨氧化微生物固定在限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。对各种包埋材料的性能进行比较优选后确定使用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)的混合材料作为厌氧氨氧化菌的包埋材料。在厌氧氨氧化菌固定化技术中存在一个瓶颈就是难以使微生物在固定区域具有较高的密度，且由于存在传质阻力，包埋菌厌氧氨氧化活性不高。而AHLs类信号分子可调控革兰氏阴性菌的生理行为，影响菌群增殖速度与世代长短等指标，影响菌群结构和优势菌，从而影响污泥微生态组成与功能。

技术实现要素：

基于现有技术中存在的问题，本发明提供一种能够提高厌氧氨氧化包埋菌活性及脱氮性能的方法及应用，解决现有技术中难以提高厌氧氨氧化菌在固定区域的密度和活性不高导致包埋菌在废水脱氮处理过程中稳定性有限，对废水中氮等污染物的处理效率不太理想的问题。

为了达到上述目的，本发明通过如下技术方案来实现：

一种能够提高厌氧氨氧化包埋颗粒活性的方法，在培养驯化厌氧氨氧化种泥时向种泥中加入AHLs群体感应信号分子，然后将培养的污泥与PVA-SA包埋剂混合，混合过程中再次加入信号分子，交联数小时后制备成PVA-SA厌氧氨氧化包埋颗粒。具体操作步骤和工艺条件如下：

(1)种泥的培养：取适量种泥至SBR反应器，加入含氨氮及亚硝氮的营养液，营养液中氨氮及亚硝氮的浓度均为4.5mmol/L，然后向SBR反应器并加入一定浓度的信号分子，环境温度为32～33℃，pH为7.8～8.3，DO浓度在0.15mg/L以下，进行间歇培养，每次更换营养液时加入信号分子，间歇式培养30天；

(2)包埋剂的配制：称取一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)加入水中，加热溶解，混合均匀；

为了提高机械强度，还可向上述溶液中再加入一定浓度的粉末活性炭，搅拌均匀，制成包埋剂；

(3)种泥与包埋剂混合：用pH为7.0的碳酸氢钾缓冲液冲洗步骤(1)培养后的厌氧氨氧化种泥去除表面杂质并补充无机碳源及碱度，然后进行离心，最后与包埋剂进行混合，混合过程中加入与步骤(1)中相同类型及浓度的信号分子；

(4)厌氧氨氧化包埋小球的制备：将步骤(3)培养好的厌氧氨氧化种泥与包埋剂混合均匀后，将混合液逐滴加入到2～6wt％的CaCl₂溶液中，密封避光4℃交联12小时，得到固定化的厌氧氨氧化小球，然后用磷酸缓冲液和灭菌水清洗后备用；

(5)厌氧氨氧化包埋小球的活化：在处理污水前，将厌氧氨氧化包埋小球活化培养一周。

所述的包埋剂中PVA的含量为6～10wt％，SA的含量为2～4wt％，粉末活性碳的含量为8～12g/L。

所述的交联剂为CaCl₂溶液，对于CaCl₂溶液其质量百分数为2～6wt％。

所述的信号分子为AHLs，对于AHLs，只有C4-HSL能提高厌氧氨氧化包埋小球的活性。

C4-HSL的浓度为0.05μM～3.0μM，优选浓度为1.5μM时可明显提高厌氧氨氧化包埋小球的活性，继续增加浓度时其活性不再继续提高。信号分子加入时，先采用有机溶剂将信号分子溶解，一般采用二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(dimethyl formamide)，溶解度为20mg/mL～30mg/mL。

所述的厌氧氨氧化包埋小球包埋剂与厌氧氨氧化污泥体积比为1：0.5～1:2。

所述的厌氧氨氧化包埋小球粒径为3～5mm。

所述的厌氧氨氧化包埋小球活化是指在32℃温度条件下用目标废水批式培养一周，使固定化的厌氧氨氧化微生物活性得到充分恢复。

本发明方法制得的厌氧氨氧化包埋颗粒用于污泥脱氮。

本发明在取出的厌氧氨氧化种泥中加入最佳浓度(优选浓度)的信号分子，使用营养液培养30天，然后将该厌氧氨氧化种泥经过碳酸氢钾缓冲液冲洗后离心，与包埋剂按照一定体积比均匀混合，混合过程中再次加入相同浓度相同类型的信号分子。用蠕动泵将混合液逐滴加入到交联溶液(CaCl₂溶液)中，密封避光4℃交联12小时制得固定化厌氧氨氧化小球，将固定化小球清洗后放入4℃生理盐水中冷藏备用。在对目标废水进行处理之前，厌氧氨氧化包埋小球经历为期一周的活化阶段。目标废水中亚硝酸盐浓度不可过高(低于200mg/L)，以免对厌氧氨氧化微生物产生较强的抑制作用。

本发明的作用原理：固定化技术是持留生物量的有效手段，但依然存在微生物在固定区域密度不高，且由于传质阻力，包埋菌厌氧氨氧化活性不高的问题。将信号分子C4-HSL加入到厌氧氨氧化种泥中再使用包埋材料PVA-SA将厌氧氨氧化污泥固定化，显著提高了固定化厌氧氨氧化小球的厌氧氨氧化活性。这是因为在培养厌氧氨氧化种泥初期和包埋过程中均加入信号分子C4-HSL，当C4-HSL的浓度达到阈值(本发明中C4-HSL的阈值为1.5μM)时可被微生物检测到，此时信号分子可通过细胞膜的转运作用进入细胞内部到达目的位置进而调控相关基因的表达，控制催化厌氧氨氧化反应的酶的合成，如亚硝酸盐还原酶等，导致一个信号转导级联反应开始，并最终使机体行为发生改变，促使厌氧氨氧化菌的比厌氧氨氧化活性大为提高，并且厌氧氨氧化菌增值速度也得以加快。

本发明和现有技术相比，具有如下优点和效果：

(1)厌氧氨氧化活性高。在厌氧氨氧化污泥中加入信号分子，利用信号分子C4-HSL对厌氧氨氧化微生物生理行为的调控作用使厌氧氨氧化微生物的厌氧氨氧化活性明显提高。

(2)包埋固定化小球内厌氧氨氧化微生物数量提高。信号分子C4-HSL提高了厌氧氨氧化菌的生长速率，使包埋小球内微生物量增加。

(3)强化了厌氧氨氧化包埋小球内革兰氏阴性菌的种间合作。厌氧氨氧化污泥是多菌混配物，其中厌氧氨氧化菌为优势菌，也兼有硝化菌、反硝化菌等，信号分子C4-HSL不仅能调控厌氧氨氧化菌的生理行为，也可作为厌氧氨氧化菌、硝化细菌及反硝化细菌等的交流信号，促使其相互合作、互利共生。

(4)制备过程简单，操作方便，性能稳定。

附图说明

图1是实施例1投加不同信号分子时氨氮、亚硝氮和硝氮浓度随时间变化曲线；图1(a)是氨氮浓度随时间变化曲线；图1(b)是亚硝氮浓度随时间变化曲线；图1(c)是硝氮浓度随时间变化曲线。

图2是实施例2包埋剂与污泥体积比不同时投加信号分子后氨氮、亚硝氮和硝氮浓度随时间变化曲线；图2(a)是氨氮浓度随时间变化曲线；图2(b)是亚硝氮浓度随时间变化曲线；图2(c)是硝氮浓度随时间变化曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的内容做进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。在使用PVA-SA混合包埋材料包埋厌氧氨氧化污泥方面，能否找到适合类型的信号分子，并且该信号分子能否提高PVA-SA厌氧氨氧化包埋颗粒的活性及稳定性尚不清楚，相关研究也属空白。因此本研究选取三种AHLs信号分子(C4-HSL，C6-HSL和C8-HSL)人为添加到厌氧氨氧化污泥中，考察信号分子对厌氧氨氧化包埋菌活性的影响，以期能够进一步提高厌氧氨氧化技术在废水脱氮中的效果。

材料：

厌氧氨氧化污泥：取自稳定运行2年的UASB反应器上部絮状污泥，取出的污泥经PBS(0.1M，pH7.4)冲洗3次，去除污泥表面的残留基质，4000r·m^-1离心10min后备用。

包埋材料：所用的包埋材料为聚乙烯醇(PVA，聚合度1750±50，皂化度98.5％)和海藻酸钠(SA，粘度150mpa·s)，均为分析纯。

信号分子：N-[(3S)-tetrahydro-2-oxo-3-furanyl]-butanamide(中文名称：N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯，简称C4-HSL)；N-[(3S)-tetrahydro-2-oxo-3-furanyl]-hexanamide(中文名称：N-己酰基-L-高丝氨酸内酯，简称C6-HSL)；N-[(3S)-tetrahydro-2-oxo-3-furanyl]-octanamide(中文名称为：N-辛酰基-L-高丝氨酸内酯，简称：C8-HSL)，均购自美国sigma-aldrich公司。

需要说明的是AHLs群体感应信号分子中的AHLs指的是N-酰基高丝氨酸内酯类群体感应信号分子。

遵从上述技术方案，以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：不同信号分子对厌氧氨氧化包埋小球活性的影响

在取出的厌氧氨氧化种泥中分别加入营养液和不同的信号分子C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL，三种信号分子的投加浓度分别设置为0.05μM、1.5μM和3.0μM(三种信号分子采用二甲基亚砜先进行溶解，配制的三种信号分子溶液浓度均为20mg/mL)，使用营养液及信号分子溶液间歇培养30天(出水氨氮浓度为进水氨氮浓度的20％时为一个周期)，然后将该厌氧氨氧化种泥经过pH为7.0左右的碳酸氢钾缓冲液冲洗3次后离心。配制质量分数为10wt％的聚乙烯醇(PVA)及2wt％海藻酸钠(SA)混合液，加热溶解，混合均匀。为了提高机械强度，再加入8g/L粉末活性炭，搅拌均匀，制成混合包埋剂。营养液中氨氮及亚硝氮的浓度均为4.5mmol/L。

将离心后的厌氧氨氧化种泥与包埋剂按体积比1:1混合均匀，混合过程中再次加入相同类型及浓度的信号分子。然后使用蠕动泵将上述混合液逐滴加入到交联剂CaCl₂溶液中，密封遮光后置于4℃冰箱中交联12小时后得到固定化厌氧氨氧化小球(粒径3～5mm)，用灭菌水清洗制备好的厌氧氨氧化小球后于4℃冰箱中冷藏备用。取适量固定化小球，加入目标废水，在32℃恒温振荡培养箱内培养一周(每天震荡三次，每次一小时)，当出水中氨氮浓度降为进水的20％时为一个活化周期，周期结束后换入新鲜的目标废水，活化一周以恢复厌氧氨氧化小球的活性。

取恢复活性后的厌氧氨氧化小球50mL，转入500mL的带塞血清瓶中，血清瓶用黑色反光纸包裹。加入400mL目标废水，放在恒温磁力搅拌器上，通过进气口通高纯氮气30min以吹脱反应器内的氧气保证厌氧环境(溶解氧浓度低于0.15mg/L)。磁力搅拌器转速150r/min，温度保持32℃，不控制pH。取50mL相同条件下制备活化的未投加信号分子的厌氧氨氧化小球作为对照组进行同步平行试验。废水氨氮浓度和亚硝酸盐浓度分别为95mg/L和125mg/L，反应时间为48小时，每隔8小时用注射器通过进气口取样，测定水样中“三氮”浓度。

实施例2：投加1.5μM C4-HSL后包埋剂与厌氧氨氧化种泥体积比对厌氧氨氧化包埋小球活性的影响

进行了包埋剂与厌氧氨氧化种泥体积比分别为1：0.5，1:1，1:2时的信号分子对厌氧氨氧化包埋小球活性影响的实验，实验操作步骤同实施例1。

测试及分析方法：

氨氮测定采用纳氏试剂光度法，硝氮测定采用紫外分光光度法，亚硝氮测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法(均采用紫外分光光度计DR5000，美国哈希公司)，DO测定采用HQ30d溶氧仪(美国哈希公司)，pH测定采用pHS-3c pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

结果与分析：

在0～16小时期间，投加1.5μM C4-HSL组中氨氮和亚硝酸盐的浓度最低，且通过折线斜率可看出该组对氨氮和亚硝酸盐的降解速率最快(附图1)，说明投加1.5μM C4-HSL后厌氧氨氧化包埋小球厌氧氨氧化活性得到较大程度提高。16～48小时期间，投加1.5μM C4-HSL组对氨氮和亚硝氮的降解速度逐渐变缓最后甚至接近未投加信号分子组，这是因为基质浓度大幅降低，起到了限制作用。投加另外两种信号分子C6-HSL和C8-HSL则对厌氧氨氧化包埋小球活性没有影响。投加1.5μM C4-HSL组在48小时后的最终监测结果为：氨氮浓度为0.97mg/L，去除率达到98.9％，亚硝氮浓度为1.55mg/L，去除率达99％，亚硝氮的去除量与氨氮去除量的比值为1.31，与理论值1.32接近。说明投加1.5μM C4-HSL后的厌氧氨氧化包埋小球表现出了更高的厌氧氨氧化活性，具有良好的应用前景。同时图2表明投加信号分子后包埋剂与污泥体积比对厌氧氨氧化包埋小球活性也有重要影响。包埋污泥含量较少(体积比1:0.5)时，厌氧氨氧化包埋小球活性不高，因为微生物数量不足；污泥含量较高(体积比1:2)时，厌氧氨氧化包埋小球活性同样不高，因为此时厌氧氨氧化包埋小球机械强度低，容易溶胀、破碎，不稳定，最佳体积比为1:1。