本发明涉及一种复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法
背景技术：
煤泥水是煤炭洗选加工过程中产生的一种选煤废水。目前，煤泥水处理主要采用添加有机高分子絮凝剂和无机絮凝剂来加速煤泥颗粒的絮凝沉降。有机高分子絮凝剂中的聚丙烯酰胺由于具有长分子链且侧链上带有大量的活性基团被广泛用来提高煤泥水的絮凝率。但聚丙烯酰胺的大量使用也会带来一些负面作用：一方面，残留聚丙烯酰胺聚集在选煤厂循环水中，在加入浮选药剂前就有部分聚丙烯酰胺吸附在煤泥颗粒上，致使浮选药剂的吸附能力下降；另一方面，含聚丙烯酰胺的循环水由于得不到及时有效治理而被大量外排，会造成对环境的污染。因此，对选煤厂煤泥水中残留聚丙烯酰胺的有效处理具有十分重要的现实意义。
目前，采用复合菌种生物降解法，降解处理煤泥水中残留聚丙烯酰胺的研究未见报道。由于煤泥水中残留的聚丙烯酰胺对湿法选煤工艺系统会产生不利影响，含聚废水外排又会对环境造成一定的危害，因此煤泥水中的残留聚丙烯酰胺的降解问题正逐渐引起人们的关注。微生物降解法能有效地处理各种难降解污染物，由于其技术成熟、无二次污染、运行费用低廉，在环境污染物处理方面起着重要的作用。微生物降解法将会成为无害化处理煤泥中残留聚丙烯酰胺的有效手段。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其优点在于：聚丙烯酰胺的降解效果良好，弥补单菌种降解的不足，能充分发挥不同菌种之间的协同作用，降低了各因素对降解效果的限制,增强了降解适应性。
本发明中所用生物材料来源如下：黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，编号：BKMF-1767，购自广东省微生物研究所菌种保藏中心；球红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides),取自中国矿业大学化工学院实验室的保藏菌种，密封保存于冰箱中。
其中黄孢原毛平革菌的培养条件为：在160rpm，30℃的培养基条件下培养2-4d；球红假单胞菌的培养条件为：在120rpm，30℃的培养基条件下培养2-4d。
权利要求
1、复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征是：将球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液作为复合降解菌悬液，在一定的聚丙烯酰胺浓度下,将球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液按1:X的体积比加入到降解培养基中，调制含聚丙烯酰胺的降解培养基PH至5～7、培养温度25～50℃等条件下，通过生物降解作用对聚丙烯酰胺进行降解。
2、根据权利要求1所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌的活化及驯化包括以下步骤：
1)球红假单胞菌：a、活化培养：从冰箱中取出甘油保存的菌种放置一段时间，用无菌吸管吸取0.3～0.5ml的液体菌种，转到液体基础培养基中，培养一段时间后再转接一次，即可得到复活的球红假单胞菌；b、驯化培养：在150ml的锥形瓶中加入灭菌的50ml的基础培养基和20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，然后将活化的0.5ml菌接入锥形瓶中，在摇床中震荡培养。培养两天后倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，往后每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，持续5天。再将菌液按2％的比例接入到250ml的锥形瓶中(含50ml基础培养基和150ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液)，3d后每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，此过程持续7d,待菌液变浑浊。取驯化液体培养基中的菌接种到相应的固体培养基上，待在恒温培养箱中长出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形态较好的菌落或孢子接种到斜面培养基上进行保藏；
所述球红假单胞菌基础培养基配方为：NH4CL 1g、K2HPO4 0.2g、NaCL 0.5g、NaHCO31g、CH3COONa 2g、酵母膏1g、MnCL2·4H2O 0.3g、微量元素5ml、琼脂20g、1000ml去离子水、PH＝7，其中微量元素配方为：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MgCL2 2g；所述液体培养基配方为：同固体培养基配方，不加入琼脂；
2)黄孢原毛平革菌：a、活化培养：取在冰箱中斜面保藏的黄孢原毛平革菌，在无菌操作台上挑取斜面培养基上的孢子接种到新鲜的黄孢原毛平革菌固体培养基上，挑取成熟的孢子再接种到固体培养基上，等长出成熟的孢子作为活化的菌种使用，并置于冰箱中保藏；b、驯化培养：在150ml的锥形瓶中加入灭菌的50ml的基础培养基和20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，然后将活化的0.5ml菌接入锥形瓶中，在摇床中震荡培养。培养两天后倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，往后每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，持续5天。再将菌液按2％的比例接入到250ml的锥形瓶中(含50ml基础培养基和150ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液)，3d后每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，此过程持续7d,待菌液变浑浊。取驯化液体培养基中的菌接种到相应的固体培养基上，待在恒温培养箱中长出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形态较好的菌落或孢子接种到斜面培养基上进行保藏；
所述黄孢原毛平革菌基础培养基配方为：马铃薯淀粉20g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，琼脂20g，去离子水1000mL，维生素B18mg，PH＝6，其中微量元素配方为：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MnCL2·4H2O 0.5g；所述液体培养基配方为：同固体培养基配方，不加入琼脂。
3、根据权利要求2所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌驯化培养步骤的条件为：在120rpm，30℃的条件下培养。
4、根据权利要求3所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液分别通过以下步骤制备得到：
1)球红假单胞菌：接种驯化后的球红假单胞菌到液体培养基中，置于温度30℃、转速120rpm的摇床中震荡培养40h；再取适量发酵培养液于低速离心机上4000转离心10min，倒出上清液，用无菌生理盐水冲洗底部的细菌，采用血球计数器计数，最后配制成109/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。
2)黄孢原毛平革菌：在30℃培养5d的黄孢原毛平革菌固体培养基上加入10mL的无菌生理盐水，并用灼烧的接种环刮下一定量的孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶。然后，放置30℃200r/min的摇床充分振荡5h。最后，通过采用血球计数器计数配制成107/ml的孢子悬液，4℃冰箱保存备用。
5、复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在降解培养基中加入体积比为1:X球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液，搅拌均匀，其中：球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液按(1～5)％的比例加入降解培养基中；
2)调制含聚丙烯酰胺的降解培养基PH至4～9、培养温度25～50℃、摇床转速70～170r/min。
6、根据权利要求5所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述的复合菌降解试验中基础培养基：马铃薯淀粉20g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，琼脂20g，去离子水1000mL，维生素B1 8mg，PH＝6；液体培养基：同上不加入琼脂；降解培养基：葡萄糖2g、酒石酸铵0.2g、MgSO4 1g、KH2PO4 3g、维生素B1 8mg，微量元素10ml、去离子水1000mL、Ph＝6，其中微量元素：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MnCL2·4H2O 0.5g。
7、根据权利要求5所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：选择混合菌的接种量分别为(2～4)％。
8、根据权利要求7所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述调节含聚丙烯酰胺的降解培养基PH至5～7。
9、根据权利要求8所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述调节含聚丙烯酰胺的降解培养基温度至30～35℃。
10、根据权利要求9所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述调节降解试验摇床转速130～150r/min。
本发明不同于现有技术之处在于：目前选煤厂中含聚丙烯酰胺的煤泥水对整个工艺的影响已经逐渐引起选煤工作者的注意，但是对选煤厂煤泥水中聚丙烯酰胺采用复合菌种生物降解的研究鲜有报道。本发明是从对聚丙烯酰胺有较好降解效果的菌株中挑选出黄孢原毛平革菌和球红假单胞菌进行研究，首先是利用含有聚丙烯酰胺残留的选煤循环水对所选菌株进行诱导驯化，然后将两种不同的菌株复合对聚丙烯酰胺进行降解试验。本发明解决的技术问题是提供了一种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的复合菌种和使用该复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其优点在于降解效果良好，弥补了单菌种不足，能充分发挥菌株间的协同作用，降低了各因素对降解效果的限制，增强了降解适应性。
下面结合附图对本发明做进一步说明。
附图说明
图1球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌复合菌与单一菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的降解率对比。其中■表示球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌复合菌；△表示球红假单胞菌；◇表示黄孢原毛平革菌；横坐标表示应用实例，纵坐标表示降解率(％)。
具体实施方式
煤泥水中残留聚丙烯酰胺的降解效果以聚丙烯酰胺的降解率来衡量，降解率越高，降解效果越好。通过测试生物降解前后聚丙烯酰胺浓度的变化，即可表示出聚丙烯酰胺的降解率η。
式中：C0为生物降解前聚丙烯酰胺质量浓度，mg/L；
Ct为生物降解后聚丙烯酰胺质量浓度，mg/L。
以下实例中所用降解培养基为含有聚丙烯酰胺的选煤厂浓缩池溢流液为基础的培养基。浓缩池溢流液取自淮南矿业集团望峰岗选煤厂，为煤泥水经过聚丙烯酰胺处理过的溢流液，在实验室中过滤后使用。
实例1
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将2％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和2％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为5，放置于30℃、130r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为32.5％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成2ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为21.9％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成2ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为31.5％。
实例2
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将3％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和3％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为6，放置于30℃、140r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为34.7％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成3ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为23.2％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成3ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为32.2％。
实例3
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将4％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和4％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为7，放置于30℃、150r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为33.4％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成4ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为22.9％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成4ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为31.4％。
实例4
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将3％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和3％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为5，放置于35℃、150r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为34.8％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成3ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为26.5％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成3ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为33.9％。
实例5
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将4％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和4％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为6，放置于35℃、130r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为35.5％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成4ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为25.7％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成4ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为34.7％。
实例6
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将2％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和2％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为7，放置于35℃、140r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为36.5％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成2ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为24.8％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成2ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为33.2％。
实例7
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将4％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和4％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为5，放置于40℃、140r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为31.2％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成4ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为21.7％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成4ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为30.5％。
实例8
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将2％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和2％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为6，放置于40℃、150r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为33.8％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成2ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为22.9％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成2ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为32.5％。
实例9
1)取含100ml降解培养基的锥形瓶，其中聚丙烯酰胺的浓度为100mg/L，将3％的黄孢原毛平革菌孢子悬液和3％的球红假单胞菌菌悬液一同加入到降解培养基中；
2)用笔型pH计调节培养基的pH值为7，放置于40℃、130r/min的震荡培养箱中连续培养6天；
3)培养期间每天用UV-5100紫外分光光度计于660nm处测定降解培养基的吸光度，与标准进行比较便可得到相应的聚合物的浓度，得到降解率为32.4％。在其他条件不变的情况下，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成3ml球红假单胞菌菌悬液，降解率为22.3％，将聚丙烯酰胺生物降解菌换成3ml换成黄孢原毛平革菌孢子悬液，降解率为31.2％。
本发明所述聚丙烯酰胺降解复合菌种是将球红假单胞菌菌悬液与黄孢原毛平革菌孢子悬液按1:X的体积比混合，并对煤泥水中残留聚丙烯酰胺进行降解试验。从实例1-9来看，复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺平均降解率为33.87％；球红假单胞菌单一菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺，平均降解为23.54％；黄孢原毛平革菌单一菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺，平均降解率为32.34％。从上述实施例可以看出，复合菌种的降解效果要优于单一菌种。球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌协同作用一方面提高了降解率，另一方面降低了其它因素对降解效果的限制和影响，降解的适应性更强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。