本发明涉及一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法。
背景技术：
在人类居住的环境中，细菌无处不在。尤其是在人口密集的区域，大量致病菌潜伏在空气和水介质中。以空气为例，据估算，每立方米约有28万个细菌，对人类生活和生产安全造成了巨大的隐患。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌通常作为测试空气中细菌总数的代表性物种。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周生鞭毛，能运动，无芽孢；能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3。国家规定，每毫升饮用水中的菌落总数小于100，每100mL水中不得检出总大肠菌群。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )，也称“金葡菌”，细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密，染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色，相反，阴性菌的细胞壁肽聚糖层薄、交联度差，脂类含量高，所以紫色复合物被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色。金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故得名，多数为非致病菌，少数可导致疾病。白色葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，是医院交叉感染的重要来源，菌体直径约0.8μm，小球形，但在液体培养基的幼期培养中，常常分散，细菌细胞单独存在。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种UV/H2O2技术具有工艺流程简单，氧化效率高，无二次污染的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，本方法包括两步，第一步构建用于H2O2合成的生物电化学系统，该系统使用石墨-炭黑混合辊压电极作为阴极；第二步构建杀菌的UV/H2O2高级氧化体系，该高级氧化体系的H2O2来源为石墨-炭黑混合辊压电极阴极，功率为4W的低压汞灯作为紫外光源，反应体系进行遮光处理，紫外光源与高级氧化液相反应体系的光程为2cm，溶液的pH值调整为7.0±0.5。
所述的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，所述的第一步的阴极的制备方法，是将粉末状石墨、粉末状导电碳黑按5:1的比例混合，与无水乙醇混合，超声搅拌10 min，使混合碳粉充分分散和溶解在无水乙醇中，在超声搅拌的条件下，逐滴加入聚四氟乙烯乳液，再超声搅拌10 min；上述混合物质在80 ℃水浴条件下搅拌120min，加入无水乙醇使其成为胶团状，将其在辊压机上不断辊压，直至压制成薄片，制得石墨-炭黑混合辊压电极。
所述的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，将第一步所得的石墨-炭黑混合辊压电极用于H2O2合成生物电化学系统；将石墨-炭黑混合辊压电极装填入双室BES的阴极室中，将碳刷作为阳极放置入阳极室；阳极接种废水；在阴极室中加入50 mM 浓度的Na2SO4溶液并不断进行曝气；构建了石墨-炭黑混合辊压电极阴极生物电化学系统，在该系统的阴极室合成H2O2。
有益效果：
1.本发明基于UV/H2O2高级氧化的原理，结合生物电化学系统原位合成过氧化氢的技术，开发出成本低廉，工艺简单，环境友好、能耗低且对溶液中的甲醛具有高杀菌效率的方法。
本发明采用UV/H2O2高级氧化技术，利用UV激发解离H2O2产生强氧化氢羟基自由基（·OH），而使细菌表面的有机分子发生氧化反应矿化，从而使细胞破裂和死亡。
本发明的能耗低微电流低碳环保，且对过滤到溶液中的细菌具有高杀菌效率的优点，是生物电化学高级氧化，效率高且无二次污染。
附图说明：
附图1是本发明的石墨-炭黑复合辊压阴极制备流程图。
附图2是本发明的生物电化学/高级氧化耦合体系杀菌方法流程图。
附图3是本发明实施例4的效果对比图。
附图4是本发明实施例5的效果对比图。
附图5是本发明实施例6的效果对比图。
具体实施方式：
下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：
一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，本方法包括两步，第一步构建用于H2O2合成的生物电化学系统，该系统使用石墨-炭黑混合辊压电极作为阴极；第二步构建杀菌的UV/H2O2高级氧化体系，该高级氧化体系的H2O2来源为石墨-炭黑混合辊压电极阴极，功率为4W的低压汞灯作为紫外光源，反应体系进行遮光处理，紫外光源与高级氧化液相反应体系的光程为2cm，溶液的pH值调整为7.0±0.5。
本方法所涉及的生物电化学/高级氧化耦合杀菌体系由用于H2O2合成的生物电化学系统和紫外/ H2O2高级氧化系统两部分组成。
实施例2：
实施例1所述的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，所述的第一步的阴极的制备方法，是将粉末状石墨（型号HTF0325，粒径40 μm,纯度> 99.9 %）、粉末状导电碳黑（型号Vulcan XC-72R, 粒径30 nm）按5:1的比例混合，与无水乙醇混合，超声搅拌10 min，使混合碳粉充分分散和溶解在无水乙醇中，在超声搅拌的条件下，逐滴加入聚四氟乙烯乳液，再超声搅拌10 min；上述混合物质在80 ℃水浴条件下搅拌120min，加入无水乙醇使其成为胶团状，将其在辊压机上不断辊压，直至压制成薄片，制得石墨-炭黑混合辊压电极。
实施例3：
实施例2所述的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，将第一步所得的石墨-炭黑混合辊压电极用于H2O2合成生物电化学系统；将石墨-炭黑混合辊压电极装填入双室BES的阴极室中，将碳刷作为阳极放置入阳极室；阳极接种废水；在阴极室中加入50 mM 浓度的Na2SO4溶液并不断进行曝气；构建了石墨-炭黑混合辊压电极阴极生物电化学系统，在该系统的阴极室合成H2O2。
实施例4：
实施例1所述的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，
步骤如下：
1）称取1g 导电炭黑，5g石墨碳粉，与无水乙醇混合，在超声搅拌的条件下，逐滴加入聚四氟乙烯乳液，再超声搅拌10 min；将混合物质在80 ℃水浴条件下搅拌120min，加入无水乙醇使其成为胶团状，将其在辊压机上不断辊压，直至压制成薄片，制得石墨-炭黑复合辊压电极；
2）将该电极装入生物电化学系统的阴极池中，以碳刷作为阳极，以BES出水作为阳极接种液，以50 mM 浓度的Na2SO4 溶液作为电解液；将合成H2O2的BES的阴极溶液按1:1的比例分别与金黄色葡萄球菌的稀释液发生反应，其pH值为中性。
）金黄色葡萄球菌的营养肉汤NB液体培养基成分包括：蛋白胨: 5 g，牛肉膏: 30 g，氯化钠: 5 g，蒸馏水:1000mL，pH:7.0~7.2，固体培养基添加15000 g/LmL琼脂粉。
冻干粉菌种复苏培养步骤如下：①. 按照说明打开安瓿管取0.2 mL NB培养基溶解冻干粉菌；②. 无菌条件下各取0.1 mL溶解液涂布平板；③. 在37℃、恒温培养箱培养2880 min；然后挑去复苏的金黄色葡萄球菌单菌落于5 mL NB液体培养基，于37℃、120 rpm 摇床培养1440 min；取出活化完全的金黄色葡萄球菌，无菌条件下以1:100传代培养，在37 ℃、120 rpm 摇床培养1440 min，传代培养至第3代；取出第三代金黄色葡萄球菌，在无菌条件下以10倍稀释法稀释至10-6，取稀释后菌液0.1 mL涂布固体平板培养基；将原菌液1：1加入上述H2O2溶液并于紫外下照射30 min；将处理后菌液1mL涂布固体平板培养基，在37℃恒温箱培养1440 min计数。
实验结果表明：按照步骤①制备的石墨-炭黑复合辊压电极安装到生物电化学系统的阴极池中，在步骤②设置的实验参数下，反应30min，接种液中金黄色葡萄球菌浓度为2.4*109 CFU/mL，处理后无检出活菌如（附图3）。
实施例5：
实施例1所述的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，
步骤如下：
①称取1g 导电炭黑，5g石墨碳粉，与无水乙醇混合，在超声搅拌的条件下，逐滴加入聚四氟乙烯乳液，再超声搅拌10 min；将混合物质在80 ℃水浴条件下搅拌120min，加入无水乙醇使其成为胶团状，将其在辊压机上不断辊压，直至压制成薄片，制得石墨-炭黑复合辊压电极；
②将该电极装入生物电化学系统的阴极池中，以碳刷作为阳极，以BES出水作为阳极接种液，以50 mM 浓度的Na2SO4溶液作为电解液；将合成H2O2的BES的阴极溶液按1:1的比例分别与白色葡萄球菌的稀释液发生反应，pH中性。
③白色葡萄球菌的LB液体培养基成分包括：蛋白胨: 10 g，酵母提取物: 5 g，氯化钠: 10 g，蒸馏水:1000mL，pH: 7.0~7.5，固体培养基添加10000 g/mL 琼脂粉。
冻干粉菌种复苏培养步骤如下：按照说明打开安瓿管取0.2 mL LB培养基溶解冻干粉菌，无菌条件下各取0.1 mL溶解液涂布平板，37℃，恒温培养箱培养2880 min；挑取复苏的白色葡萄球菌单菌落于5 mL LB液体培养基于37℃，120 rpm 摇床培养1440 min；取出活化完全的白色葡萄球菌，在无菌条件下1:100传代培养，37 ℃，120 rpm 摇床培养1440 min；传代培养至第3代；取出3代白色葡萄球菌，无菌条件下以10倍稀释法稀释至10-6。；取稀释后菌液0.1 mL涂布固体平板培养基；将原菌液1：1加入上述H2O2溶液并于紫外下照射30 min。将处理后菌液1mL涂布固体平板培养基，在37℃恒温箱培养1440 min计数。
实验结果表明：按照步骤①制备的石墨-炭黑复合辊压电极安装到生物电化学系统的阴极池中，反应30min，接种液中白色葡萄球菌浓度为1*105 CFU/mL，处理后无检出活菌如（附图4）。
实施例6：
实施例1所述的一种基于生物电化学、高级氧化耦合体系杀灭细菌的方法，
步骤如下：
①称取1g 导电炭黑，5g石墨碳粉，与无水乙醇混合，在超声搅拌的条件下，逐滴加入聚四氟乙烯乳液，再超声搅拌10 min；将混合物质在80 ℃水浴条件下搅拌120min，加入无水乙醇使其成为胶团状，将其在辊压机上不断辊压，直至压制成薄片，制得石墨-炭黑复合辊压电极；
②将该电极装入生物电化学系统的阴极池中，以碳刷作为阳极，以BES出水作为阳极接种液，以50 mM 浓度的Na2SO4 溶液作为电解液；将合成H2O2的BES的阴极溶液按1:1的比例分别与大肠杆菌的稀释液发生反应，pH中性。
③大肠杆菌的培养液为LB液体培养基，蛋白胨: 10 g，酵母提取物: 5 g，氯化钠: 10 g，蒸馏水:1000mL，pH: 7.0~7.5，固体培养基添加10000 g/mL琼脂粉；取出于-80 ℃保存的大肠杆菌甘油菌，无菌条件下1:50接种于5 mL培养基，37 ℃，120 rpm 摇床培养1120min；取出活化完全的大肠杆菌，无菌条件下1:100传代培养，37 ℃，120 rpm 摇床培养600 min；取出2代大肠杆菌，无菌条件下以10倍稀释法稀释至10-3，取稀释后菌液0.1 mL涂布固体平板培养基；将原菌液1：1加入上述H2O2溶液并于紫外下照射30 min；将处理后菌液1mL涂布固体平板培养基，在37℃恒温箱培养1440 min计数。
实验结果表明：按照步骤①制备的石墨-炭黑复合辊压电极安装到生物电化学系统的阴极池中，反应30min，接种液中大肠杆菌浓度为1.2*105 CFU/mL，处理后仅有1个检出活菌（1CFU/mL，附图5）。