一种用于强乳化三元复合驱采出水破乳的硝酸盐还原菌的筛选方法与流程

本发明属于工业微生物技术领域，涉及用于强乳化三元复合驱采出水的生物破乳菌筛选方法。

背景技术：

目前，我国大多数油田已经进入注水开采的后期。为进一步提升原油采出率，包括三元复合驱采油技术在内的强化采油技术得到广泛应用。其中，三元复合驱采油技术可将原油采收率提升20％以上。三元复合驱技术已经在我国包括大庆油田在内的多个油田实现工业化应用，但三元复合驱采油技术的运用产出了大量含表面活性剂、聚合物和胶质颗粒、乳化油、硫酸盐还原菌等的采出水，具有强乳化、易生物酸化的特点。

常规用于水驱和聚合物驱的油水分离方法难以满足三元复合驱采出水的油水分离需求。而目前发展出的包括电絮凝、沉淀吸附、膜过滤、气浮、化学破乳剂等技术存在操作流程复杂、二次污染风险大、经济成本高等缺点。如何实现对强乳化的悬浮小粒径油滴经济、高效、绿色的去除是三元复合驱采出水处理的关键。

生物破乳菌剂是利用微生物代谢产生的具有乳液破乳功能的活性物质来实现对乳液的破乳，它认为是一种环境友好、破乳效率高的油水分离方法。但目前针对强乳化三元复合驱采出水的生物破乳菌的筛选方法还未见报道。

微生物在生产破乳剂的过程中通常需要投加氮源，同一种破乳菌也可以利用多种类型的氮源，包括：蛋白胨、氯化铵、硝酸钾、硝酸铵等。然而，目前关于具有高效硝酸盐还原特性的生物破乳菌还鲜有报道。

硝酸盐还原菌通常可以分为异养硝酸盐还原菌和自养硝酸盐还原菌。异养硝酸盐还原菌以有机物为电子供体，以硝酸盐为电子受体，将硝酸盐经亚硝酸盐、一氧化氮和氧化亚氮，最终生成氮气的过程。微生物可进行其中的几步或者全部。自养硝酸盐还原菌以硫化物等为电子供体，以硝酸盐为电子受体，可将硫化物转化为单质硫或硫酸盐，而硝酸盐则经过经亚硝酸盐、一氧化氮和氧化亚氮，最终生成氮气。这两类硝酸盐还原菌都具有控制油藏或采出水生物酸化的潜力。其中，异养硝酸盐还原菌通过电子供体竞争或者代谢中间产物亚硝酸盐来抑制硫酸盐还原菌的活性。而自养的硝酸盐还原菌可以降解采出水或油藏中的硫化物。同时，自养的硝酸盐还原菌还可以在还原硝酸盐的过程中积累亚硝酸盐，利用亚硝酸盐进一步的抑制硫酸盐还原菌的活性。依靠这些作用，硝酸盐还原菌可以用来对油藏或采出水的生物酸化进行强化控制。

三元复合驱采出水中含有大量的乳化油和硫酸盐还原菌，如果利用具有硝酸盐还原能力的破乳菌对强乳化的三元复合驱采出水进行破乳的同时，则可在一定程度上增强采出水中硝酸盐还原菌的物种丰度，进而提升依赖于硝酸盐还原菌的生物酸化控制过程。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足和问题，提供一种针对强乳化三元复合驱采出水破乳的硝酸盐还原菌高效筛选方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于强乳化三元复合驱采出水破乳的硝酸盐还原菌筛选方法，其特征在于，包括以下4个步骤：

(1)对接种物进行富集培养，并对其产物进行分离、纯化；

(2)从分离、纯化的培养物中筛选烷烃降解菌；

(3)从得到的烷烃降解菌中进一步筛选具有硝酸盐还原特性的烷烃降解菌；

(4)利用多元线性方程预测具有硝酸盐还原特性的烷烃降解菌对强乳化三元复合驱采出水的破乳效果。

作为本发明的一种优选方式，所述接种物取自活性污泥或三元复合驱采出水井周围被原油污染的油泥。

进一步优选地，所述的富集培养方法为：将5～10g接种物投加进无机营养盐培养基中，在30～35℃，120～200rpm条件下培养5d；然后吸取2～10ml的富集液投加进新的营养盐溶液中，重复上述培养步骤2～3次。

进一步优选地，所述的无机营养盐培养基成分为：kno33g/l，kh2po44g/l，k2hpo43g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，cacl20.02g/l，fecl30.05g/l，微量元素溶液2ml/l，液体石蜡4％(v/v)，ph7.0。

作为本发明的一种优选方式，所述的烷烃降解菌筛选方法为：在一个含无机盐培养基的具塞试管中，接种一环分离纯化的培养物，在30～35℃恒温培养箱中，120～200rpm条件下培养1d。

作为本发明的一种优选方式，所述具有硝酸盐还原特性的烷烃降解菌的筛选方法为：接种烷烃降解菌于已知硝酸盐浓度的无机盐营养培养基中，在恒温培养箱中培养3-5d；取适量培养液离心后，检测上清液中硝酸盐和亚硝酸盐的含量；硝酸盐含量减少并且亚硝酸盐积累的菌，即为具有硝酸盐还原特性的烷烃降解菌。

作为本发明的一种优选方式，利用多元线性回归方程预测步骤(3)筛选出的菌种对三元复合驱采出水的破乳效果包括以下步骤：

(1)构建破乳菌对三元复合驱采出水的破乳效果多元线性回归方程预测模型：

t＝-115.011+40.044×od600+4.136×os-0.401×zeta-0.719×no3^--nrem.ratio

其中，no3^--nrem.ratio为硝酸盐的去除率(％)；od600目标菌株在无机盐营养液中培养5d后的菌液吸光度值；os为目标菌株在无机盐营养液中培养5d后菌液的排油圈大小(cm)，zeta为目标菌的菌悬液zeta电位(mv/m)；t为三元复合驱采出水破乳后水相的透光率(％)；

(2)检测步骤(3)所得的菌液的od600值；

(3)用步骤(3)所得的菌种对三元复合驱采出水进行破乳，记录所形成的空白油圈直径，计为os(cm)；

(4)检测步骤(3)中所得菌液的zeta电位；

(5)计算步骤(3)中所得菌液的硝酸盐去除率no3^--nrem.ratio(％)；

(6)采用所述的多元线性回归方程计算破乳后水相的透光率，进而预测步骤(3)所得的菌种对三元复合驱采出水的破乳效果。

本发明的用于强乳化三元复合驱采出水破乳的硝酸盐还原菌筛选方法，具有的有益效果如下：

(1)提供了具有烷烃降解、硝酸盐还原和生物破乳功能的微生物菌剂的高效筛选方法；

(2)该筛选方法可对油田强乳化的三元复合驱采出水的生物处理提供重要的指导作用，有效推动了油田三元复合驱采出水的处理技术的进步；

(3)利用多元线性回归方程预测筛选出的生物破乳菌的破乳能力，经过验证，预测结果与实测结果高度吻合，证明该方法能够准确预测生物破乳菌的破乳能力。

附图说明

图1为模拟的强乳化三元复合驱采出水中油滴的平均粒径；

图2为多元线性回归方程预测值与实测破乳后水相透光率的关系；

图3为强乳化三元复合驱采出水破乳效果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

本发明提供的其中一个实施例是：一种针对强乳化三元复合驱采出水破乳的硝酸盐还原菌筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)将10g新鲜的活性污泥或三元复合驱采出井周围被原油污染的油泥接种在无机盐营养培养基中，在30～35℃，120～200rpm转速条件下培养5d；然后吸取2-10ml的富集培养产物投加进新的无机盐营养培养基中，重复上述培养步骤2～3次。

其中，无机盐营养培养基成分为：kno33g/l，kh2po44g/l，k2hpo43g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，cacl20.02g/l，fecl30.05g/l，微量元素溶液2ml/l，液体石蜡4％(v/v)，ph7.0。

微量元素溶液成分为：znso41.5g/l，cuso40.15g/l，h3bo31.5g/l，mnso41.5g/l。

连续富集培养得到目标微生物混合菌群，采用富集培养物采用酵母膏蛋白胨琼脂固体培养基，进行分离、并纯化出所有潜在目标菌种。

(2)取1接种环生长在酵母膏蛋白胨琼脂固体培养基上的已经纯化的每一种目标菌种分别接种至含2ml无机盐营养培养基的具塞试管中，在恒温(30～35℃)培养箱中，120～200rpm转速条件下培养1d。

微生物具有明显生长或乳化现象的即为烷烃降解菌。

(3)将步骤(2)中具有明显生长和乳化现象的试管在恒温(30～35℃)，转速为120～200rpm，继续培养4d。取1份培养液经离心后，检测出水硝酸盐和亚硝酸盐含量(硝酸盐和亚硝酸盐含量测试采用国标法测定)，保留具有显著硝酸盐去除和亚硝酸盐积累的菌种。

(4)随机选择步骤(3)所得的具有硝酸盐还原能力的10种微生物，分别接种至含有100ml无机盐营养培养基的锥形瓶中，在恒温(30～35℃)培养箱中，120～200rpm转速条件下培养5d。

(5)在紫外可见光分光度计上检测步骤(4)所得的所有菌液的od600值。

(6)取1个直径15cm的培养皿，加去离子水100ml，然后滴加50μl的原油，待形成稳定的油膜后，在油膜的中央滴加步骤(4)中所得的具有硝酸盐还原能力的细菌菌液50μl，待油圈稳定(约1min)后记录所形成的空白油圈直径。该步骤重复3次，取平均值，计为os(cm)。

(7)分别取10ml步骤(4)中所得菌液，13000rpm离心得到的菌体。分别用10ml正己烷清洗2次后13000rpm离心，用10ml去离子水重新悬浮所得菌体。然后，采用美国布鲁克文zetapals分别检测菌悬液的zeta电位(mv/m)。

(8)分别取2ml步骤(4)中所得菌液，13000rpm离心得到的上清液。分别检测上清液的硝酸盐含量，计算硝酸盐的去除率no3^--nrem.ratio(％)。

(9)分别取2ml步骤(4)所得的菌液分别加入到含有8ml模拟强乳化三元复合驱采出水的刻度管中，在3000rpm条件下涡旋1min后放置于35℃的水浴锅中，静置24h后，检测破乳后试管液面以下5cm处的透光率t(％)。

(10)构建破乳菌对三元复合驱采出水的破乳效果多元线性回归方程预测模型，具体方法为：

采用步骤(5)～(8)得到的数据，利用r语言的多元线性回归函数拟合并评估，得到如下多元线性方程。

t＝-115.011+40.044×od600+4.136×os-0.401×zeta-0.719×no3^--nrem.ratio

其中，no3^--nrem.ratio为硝酸盐的去除率(％)；od600目标菌株在无机盐营养液中培养5d后的菌液吸光度值；os为目标菌株在无机盐营养液中培养5d后菌液的排油圈大小(cm)；zeta为目标菌的菌悬液zeta电位(mv/m)；t为三元复合驱采出水破乳后水相的透光率(％)。

(11)由实测结果，透光率t大于15％的菌株可认定为：具有硝酸盐还原能力的高效三元复合驱采出水生物破乳菌。该值可作为上述多元线性回归方程的预测阈值，即：方程预测得到的t大于15％即判定该菌株是用于强乳化三元复合驱采出水生物破乳的硝酸盐还原菌。

为了评估上述实施例中通过多元线性回归方程预测的生物破乳菌对三元复合驱采出水破乳效果的准确度，本发明设计并提供了以下验证试验。

1、模拟的强乳化三元复合驱采出水配制

首先配制矿物质水溶液。按质量比，取nacl1600mg/l，nahco32600mg/l，na2co3300mg/l，mgso4400mg/l，cacl220mg/l，naoh400mg/l，hpam(mw：300万)400mg/l，石油磺酸盐溶液(胜利油田提供，其中石油磺酸盐含量约50％)200ml，温和搅拌1h。

2、按体积比，取1.5ml原油加入500ml的矿物质水溶液中，在剪切乳化机(blenderlb20eg,waringcommercial,u.s.a.)上高速(转速等级:7)乳化5min。制得平均油滴粒径为65nm的强乳化三元复合驱采出水。图1展示了模拟强乳化三元复合驱采出水的油滴粒度分布。

3、破乳菌的培养

(1)配制无机盐营养液，成分为：kno33g/l，kh2po44g/l，k2hpo43g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，cacl20.02g/l，fecl30.05g/l，微量元素溶液2ml，液体石蜡4ml，去离子水1000ml，ph7.0。于121℃，高压灭菌15min。冷却备用。

(2)接种所有目标菌株于含有100ml无机盐营养液的锥形瓶中，在30～35℃，转速为120～200rpm下培养5d。

(3)分别取2ml微生物培养液，分别加入到8份含有模拟的强乳化三元复合驱采出水的刻度管中，在3000rpm下混匀1min。放置于35℃的水浴锅中，静置24h后，检测破乳后试管液面以下5cm处的透光率。

4、将实测结果与多元线性回归方程预测结果比较。图2展示了多元线性回归方程的预测结果与实测结果的关系，由图可知：该回归方程精确的预测了所得目标菌株对强乳化三元复合驱采出水的破乳效果。

图3展示了强乳化三元复合驱采出水的生物破乳效果。由图可知：通过本方法得到的微生物菌剂(菌1，菌2，菌3，菌4，菌6，菌7，菌8)对强乳化的三元复合驱采出水具有出色的破乳效果。