强化发酵方法

专利名称：强化发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种强化发酵的新方法，即在方法的任一步骤中采用电刺激。
该电刺激最好用于厌氧的、嗜温的且在腐烂条件下产甲烷的微生物发酵中，尤其是废水处理，接种物形成或用于对含有混合产乙酰微生物-产甲烷微生物或仅含产甲烷微生物的微生物种群的厌氧污泥增加其分解能力。
本发明的工艺主要可用于环境控制，尤其是污水处理方面，但也可用于其它领域，如B12辅酶(钴胺酰胺辅酶)发酵和最好在腐烂条件下用混合的、厌氧的、嗜温的产甲烷的微生物种群所进行的其它发酵过程。
世界范围的自然环境恶化在过去二、三十年内愈演愈烈。工业和农业的大规模发展，人口增长率都是导致生态平衡遭到破坏的因素。大气层、水界及陆界都同样受到对环境不利的人类活动的危害。
污水处理是环境控制的主要任务之一。在本世纪上半个世纪中，按照广泛使用的污水处理法(主要从城市源产生的污水)，污水盛于大敞口池中通气，然后让形成的活化淤泥在厌氧条件下于大的加热的容器(消化器)内发酵，同时产生沼气(biogas)，作为最终产品所获得的淤泥再放在一层沙上干燥，最后用作农业上使用的有机肥。
第二次世界大战后几十年间，由于迅速发展的工业和农业的耗水量的增加，在环境中再循环的污水量增加了。为数不多的低容量污水处理厂(仍然采用旧技术工作)，再也不能处理已增加的污水处理量，因此工业、农业和城市污水成为威胁自然水源的最大危害。
到六十年代，专家们开始认识到a.)过去几十年中所发展起来的生产结构浪费材料，导致形成过多的大量的工业和农业废物，因此，第一步，他们通过优化这些大规模的生产过程开始将废水降至最低限度，况且，b.)只有当建立了适当的具有工业背景的科学研究和发展的基础(这需要一个新的工业分支，新工艺，制造新设备、工具、机器、仪器等)，才能实现环境工程。
此后，由于水需求的潜在增加，和同样重要的，能源价格的迅速增长，人们开始了广泛的研究和开发项目，以确立污水的成分及其微生物-生物化学性质。
到七十年内后半期，随着经济发展，高容量厌氧污水处理法出现了，到八十年代已用于工业规模[Anaerob Digestion(1988)，Eds.E.R.Hall和P.N.Hobson，Pergamon Press，Oxford，Tokyo，Toronto，等]。其主要目的是对水处理过程中产生的纯水进行再循环，使其进入天然水源或引入技术，以及获得从有机物质转化而来的以甲烷形式存在的可观的能量。
在自然界中，复杂有机物质被混合种群的微生物所分解。参与该过程的微生物以共生形式存活，一个降解步骤的产物即是下一步骤活化群的被用物。在平衡条件下，该过程是稳定的且具有很高的灵活性，亦即，每一组微生物的比例，在一定限度内，可灵活地适应代谢物的浓度。在产生沼气的厌氧工艺中，可清楚地区分四个步骤在第一个步骤中水解微生物的活动是主要特征(蛋白酶、纤维素酶等)。由于胞外酶的作用高分子物质主要是不溶性的多糖、蛋白质和脂类在兼性厌氧条件下被增溶溶解及消化。
在第二步中，第一步骤中的代谢物(碳水化合物、肽、高级脂肪酸等)在兼性厌氧条件下被产酸微生物进一步降解，导致生成低级脂肪酸、醇、氢气和二氧化碳。
在第三个步骤中，由产乙酰微生物从各种有机酸和醇中主要生成乙酸盐。
在最后步骤中生成甲烷。乙酸盐和cl化合物(甲醇、甲酸、甲胺)以及二氧化碳和氢气充当产甲烷微生物转化成甲烷的被用物。利用二氧化碳和氢气制备甲烷的亲氢产甲烷微生物以及通过裂解乙酸盐分子制备甲烷和二氧化碳的促乙酰产甲烷微生物也是为人们所熟知的。
在头两个步骤中兼性厌氧微生物在pH值4.5～5.5范围内发挥作用，而在后两个步骤中该专性的厌氧产乙酰微生物-产甲烷微生物则在pH7～7.5范围内发挥作用[Anaerob Digestion.Intern.Symp.in Cardiff(Wales，1979);in Travemunde，FRG(1981);in Boston，USA(1983);in Guangzhou，China(1985);in Bologna，Italy(1988)]。在自然界中，复杂厌氧分解在同样的地点发生，对单个的细菌组群而言不保证最好的物理化学条件，因之自然过程的产量总是低于最优值。
在需氧污水处理法中，对有机物质进行微生物氧化所需的空气必须与污水混合。在该过程中约50%的有机碳被氧化成了二氧化碳，残留碳变成了活化淤泥的一部分。
在厌氧污水处理过程中，约80%可消化的碳以甲烷+二氧化碳形式作为沼气而释放出来。此外，厌氧法在能量方面也更有利些。形成0.5m3.(其甲烷浓度为55～60%)的沼气需要1kg COD(化学耗氧量)(25.5MJ/N.m3＝6000kcal/N.m3)，这等于0.3kg的燃油(42MJ/kg＝10000kcal/kg)，也就是说，厌氧法是一种产生能量的方法，而在需氧法中1kgCOD在通气中需要0.5～1kwh的耗量。
考虑到厌氧法中较有利的能量条件及所形成的淤渣量显著降低，这种淤渣甚至不需要任何最终处理即可用作土壤改良，因此人们把注意力集中于厌氧法上。两个平行的国际专题讨论会被发起召开并且从那以后每隔2～3年不间断地进行着-“ANAEROBIC DIGESTION”(1979，1981，1983，1985，1988和1990)和“MICROBIAL GROWTH ON CI COMPOUNDS”(第六届会议于1989年在Gōttingen召开)。
厌氧法制备甲沼气的技术在不同时期在世界各国发展起来了，而处理的规模和容量，则取决于发展水平和面临的特殊问题(能量短缺、环境控制)。
如果考虑到该方法的规模、应用及装置，则可分为两大组a.)小规模沼气生产。在常规装置中将居民家中、农场及小社区中的液体肥料、农业及公共废渣转化成沼气。这些装置被称为农场沼气工厂，四川型沼气工厂即是这一家族的典型代表。在这样大的国家，人们居住得又很分散，建设供电网络既费钱速度又慢，因此必须寻找当地能源。1985年，中国已有420万座四川型农场沼气工厂在运行。第三世界其它国家的情形也大致类似，尤其是在印度(Desai和Patel型工厂)。在工农业生产已很发达的国家，如荷兰、比利时、丹麦、德国，到六十年代末和七十年代开始引进农场沼气工厂，后来开发出更经济的工业规模的处理厂。
b.)工业规模的沼气生产。有两大类原料可用于生产沼气高干燥度的有机废料[大于15%(v/v)](玉米叶、玉米杆、麦草、椰纤维等)和低或中干燥度的废料[低于15%(v/v)]。后一种废料在工业、食品工业、农业以及以城市污水形式存在的沉渣中大量地产生着。
多年来所进行的大量研究已揭示出，通过增加活性的产甲烷微生物的生物量的浓度，改进内在接触及增加接触表面积，可开发出一种全新的厌氧工艺。发掘众所周知的产甲烷微生物可形成密聚体的特性，则可采用适当的技术在该生物量中形成活的聚粒(即颗粒)或者在惰性载体上形成固定的生物膜，该活性生物物质在反应器中的停留时间即可延长。这还需要设计低液压保留时间(HRT)的新反应器-这是因为大大增加了活性表面-在较高的稀释比率下操作，结果这种反应器的容积也就显著降低。
此外，还应认识到，如果将该混合厌氧法分成空间上彼此隔开的两个步骤-产酸微生物和产甲烷微生物-每一步骤保证各自微生物组群的最佳条件，废水首先导入产酸微生物处理单元然后再导入产甲烷微生物处理单元，则可大大提高产率。
待开发的工艺主要取决于来源、出现周期性和污水的性质。但尽管非常类似，大多数污水处理厂都有各自的设计，这种设计应考虑以下主要方面-污水中可能含有可观量的可能是大颗粒的固体物质，如果不预处理(过滤沉积等)可能堵塞某些类型的反应器;
-对溶解有机物含量高的污水(COD40-50kg/m3)而言，处理后的流出液即使转化率为95%，仍可含有2～2.5Kg的COD/m3，应通过进一步处理降至所需的低COD值(第二步厌氧步骤或需氧处理);
-化学工业或制药工业的污水含有很难分解的有机物成份(脂肪族卤化物、芳香化合物等)，这些成份可能需要预处理或需要较长时间发生适应性变化。产甲烷微生物(methanogens)在“the Progress in Industrial Microbiology”[Vol.16，PP.233～237(1982)]上＃曾给予详细报道，W.E.Balch，G.E.Fox等报道了它们的形态及物理性质[Microbial Rev.Vol.43，260～296(1979)];其代谢作用在“the Handbook on Anaerobic Fermentations”一书中也报道过[pp.537～545(1988)，Eds.Larry E.Erickson and Daniel Yee-Chak Fung.Marcel Dekker.Inc.New York，Basel]。
由产乙酰微生物生成的乙酸盐、氢气和二氧化碳连续地被甲烷微生物所还原，该反应保证了产乙酰微生物-产甲烷微生物的微生物种群的存活[Anaerob DigestionProceedings of the First Intern.Symposion on Anaerob Digestion.Eds.D.A.Stafford，B.I.Wheatley，D.E.Hughes pp 15-20 Pergamon Press，Cardiff，Wales(1979)]。采用混合产乙酰微生物-产甲烷微生物的微生物种群是选择用来处理含中等长度的脂肪酸，其它有机酸、醇和有机胺的污水的方法[Handbook on Anaerob Fermentations，PP.597-600(1982).Eds.Larry E.Erickson，Daniel Yee-Chak Fung.Marcell Dekker，Inc.New York，Basel]。
培植在取自城市污水处理厂的次级厌氧消化装置的刚刚消化的淤渣上的接种物，主要用于生产B12辅酶。
刺激是生物学中用途广泛使用的一种工具。刺激是施加于活的组织上的一种外影响力从而使组织产生不同的响应。机械、热、光、各种化学作用以及电流和放射性辐射都代表了刺激的某种类型。人工刺激细胞通常是这样来进行的，通过改变电脉冲的振幅和周期，可以容易地调节用作刺激能的电脉冲。由于可精确调谐振电压的特性，用电流刺激也是科学研究中首选的刺激法[F.Brunó StraubBiological Lexikon，Vol.2.PP.280-281.Akadémiai Kiadó，Budapest，Hungary(1978)]。
按照美国专利说明No.4，822，470，将经过连续电场(由100～800v/cm交流电所产生)预处理过的细胞放入高频振荡高强电场(5～20kv/cm和50KHz～500MHz)中，则细胞膜的渗透性增强，暂时会在细胞膜上形成大大小小的孔隙，这甚至会诱发细胞融合。
该方法可高产率地用于将生物活性化合物-DNA.RNA.蛋白质、抗体、激素、酶、生长素等引进各种动物、人体、植物和细菌细胞中，也可用于它们的细胞间交换以及通过细胞融合产生具有新的生物性质的杂交细胞。
东德专利说明书No.248，140(Wirtschafts patent;economic patent)描述了在置于直流电场中的发酵装置中进行的厌氧无菌发酵过程。发酵液(环绕以两个Helmholtz线圈)被电刺激5毫秒，再停歇顿62毫秒，用这种办法，该抗菌发酵的产率提高了约10%。并且该法还有一个优点，即无需将电极浸入发酵液中。
大约30年前人们就已知道，B12辅酶是从淤渣中存在的营养素和微生物由发酵法而制得的，如果需要的话，可补充各种其它营养素。该工艺最大的优点是在非无菌条件下进行发酵;但其缺点是不得不将大量的淤渣从污水处理厂运到发酵装置所在地，淤渣的组成和细菌种群都是可变的，也还存在着长出“野生菌株”的机会(这会抑制稳定细菌种群的发展)。
匈牙利专利说明书No.153，740描述了厌氧、非无菌制备B12辅酶的新方法。其中，污水淤渣单次地加在含必需养分的培养媒介质中，经过至少五次接种后，生成了自身足以起接种物作用的一种混合微生物种群，生成的B12辅酶浓度约为6～6.2mg/l的发酵液。然而，这种“无淤渣”过程要求至少5次接种，也就是说，淤渣中的微生物适应B12辅酶生成的适应性变化进行得相当缓慢，B12辅酶产量低，还需要多种养分，也就是说，该法操作成本太高。
还有几种制备B12辅酶和改进其产率的方法也是大家所熟知的(美国专利说明书Nos.3，954，971和3，979，259)，这些方法都致力于强化上述的“无淤渣”操作法。
匈牙利专利说明书No.167，658是描述嗜温混合甲烷发生微生物种群的最早的文献，该种群含棒状杆菌sp.24A1，棒状杆菌sp.62B9，乳酸杆菌sp.244B/Cl和丙酸菌sp.239A1/6，该文献存于“National Institute of Hygiene”Budapest，Hungary(OKI)，文献编号分别是00076，00077，00078和00079。
然而，这种厌氧的、嗜温的、混合的甲烷发生微生物种群仅能够缓慢地适应含有不是通常养分的媒介，需要6～7次接种，每一接种循环需要约7天才能完成，亦即，欲获取适于大规模工业生产的上述新混合微生物种群，约需40～50天，而这是费时费钱的。
在美国专利说明书No.4，752，584所描述的方法中(匈牙利专利说明书No.188，954，匈牙利优先权日1983.9.16.)发明家们又回到原来的淤渣上来，让淤渣中存在的微生物种群直接适应新养分媒介，这样就生成了新的、厌氧的、嗜温的、混合的甲烷发生微生物种群，而已生成的厌氧的、嗜温的、混合的甲烷发生微生物种群不适应一个新的养分媒介。
然而，在特殊的媒介上，所列的任何一种接种物完全适合B12-辅酶的制备。
厌氧污水处理法中所用技术数据的说明化学耗氧量(COD)负荷量纲CODg(kg)/l(m3)发酵装置/小时(天)/COD(g，kg)输入量与消化装置(或发酵装置)的工作容积(1，m3)的比值对时间(小时，天)的函数。
工作容积为媒介所充满的消化装置(或发酵装置)的容积。
液压载荷量纲污水流入液l(m3)/l(m3)发酵装置/天[流入污水容积与消化装置(或发酵装置)的工作容积的比值对时间的函数]。
设备容量量纲转化的CODg(kg)/l(m3)发酵装置/天[转化成沼气量与消化装置(或发酵装置)的工作容积之比对时间的函数]。COD转化率(%)流出污水的COD(g/l)乘以单位时间的流出物体积(l)再除以污水流入COD(g/l)和单位时间流入物体积的乘积%＝ (污水流出量(l)×流出物COD(g/l))/(污水流入量(l)×COD输入量(g/l)) ×100液压保持时间(HRT)量纲小时或天在消化装置(或发酵装置)中污水停留时间。
HRT值是稀释比率(D)的倒数。
稀释比率(D)在单位时间内流经消化装置(发酵装置)的工作容积的污水的体积与发酵装置工作容积的比值D＝ (污水流量(l/天))/(发酵装置的工作容积(l))量纲h-1或天-1产甲烷微生物的活度由1g于生物量在消化装置(或发酵装置)内1天中所产生的甲烷(ml).量纲l沼气/l发酵装置/天沼气产率单位时间内在1单位消化装置(或发酵装置)的工作容积中所产生的沼气的体积。
量纲l沼气/l发酵装置/天本发明的目的是，更新通常的制取沼气的厌氧污水处理方法和厌氧、非无菌发酵制取B12辅酶工艺，和将B12发酵的甲醇组分转化成燃料-甲烷，此外，显著的提高污水处理方法及B12辅酶生产的速率和产量。
我们在实验过程中发现1.)将厌氧的、已消化的淤渣(例如按照匈牙利专利申请书No.9203241生产的)用电刺激激活后，加入取自不同污染源的污水中，在比以前短得多的时间内，即形成了高产乙酰微生物-产甲烷微生物活性的混合微生物种群，因之显著加快了有机物质转化为沼气的速率，或2.)对厌氧、嗜温甲烷发酵和制备B12辅酶发酵施加电刺激，甲醇分解活性增强，导致B12辅酶产量增加，和，3.)上述两种方法均可在任何种类的反应器中进行。
基于电刺激对不同种类的微生物种群产生同样的不可预测的正效应这一事实，发酵媒介(液)的电刺激可用于强化不同种类的发酵过程，应是不言而喻的。
按照本发明的具体操作法，如果用一定振幅和频率范围的直流低频的方波脉冲进行刺激，而且是短期刺激-在数小时内循环地间歇，则在产甲烷微生物过程中可记录下述变化a.)培养物的特征产甲烷微生物活性(CH4ml/l×液/天)增加50～80%而发酵媒介中的溶解有机物减少;
b.)在几天的刺激期中，所调查的样品中形成了颗粒直径为0.5～1.5mm的微生物聚集体，而该聚集体的特征产甲烷微生物活性是原来的4～5倍，c.)甚至在中断刺激70～80天后，增加的产甲烷微生物活性仍保持稳定，没有检测到显著的降低。
基于我们的经验，通过将厌氧消化的淤渣进行电刺激，提出了用于制备一种活性接种物的方法，该方法适合食品工业的各种污水类型，适合将厌氧污水处理法的容量提高40～60%。如果需要，可在适应性变化或污水处理过程中或在发酵的平稳(stationer)(产生)阶段，周期性地重复电刺激。
本发明涉及强化发酵的一种方法，该方法包括在发酵过程中的任一步骤中对发酵媒介施加电刺激，亦即在接种物制备阶段和/或在适应性变化阶段，和/或在发酵的平稳产生阶段。
本发明可非常有利地应用于厌氧的、嗜温的、产生甲烷的发酵过程。
本发明的一个优选实施方案一个厌氧的、嗜温的、产生甲烷的发酵过程，通过产乙酰微生物-产甲烷微生物的微生物种群，该发酵过程最好用于改善在腐烂情况下的污水处理，包括a)将从城市污水处理厂的最终消化器中新鲜获得的污渣装入带有两根电极的密闭不透气的发酵装置(最好用循环电刺激对该淤渣进行预处理)中，在中温温度范围内保持上行循环流动1～4天(使混合微生物种群适应新环境，亦即适应这一步骤的新设备)，然后b)每天向所形成接种物上加入至少等体积的0.1～3.5gCOD/l污水，开始循环电刺激、系统保持强上行流动方式，将形成的沼气输入贮气罐并收集与污水流入液体积相等的流出液，然后c)待处理的污水的COD负荷逐渐增加到浓度为3～40gCOD/l，同时在5～30天内保持循环电刺激，在此期间，生成了已适应该特定污水的高产甲烷微生物活性的生物物质，然后停止电刺激，如果需要的话可继续进行污水处理。
d)处理过的污水被弃去或进一步纯化，生成的沼气输入贮气罐中备用，或，本发明还涉及一种厌氧、嗜温、产甲烷发酵方法，该方法特别适合应用于腐烂条件下改进B12辅酶的生产，涉及在已知营养素的一种媒体中使用一种产甲烷微生物的微生物种群(包括对发酵液进行循环电刺激)。
本发明还涉及，通过将厌氧消化的淤渣进行循环电刺激，制备含一种厌氧的、嗜温的、主要是产乙酰微生物-产甲烷微生物的混合微生物种群的一种新及种物的方法。该方法的优选实施方案包括下述步骤a)向一个间歇式发酵装置中加入25～35%(v/v)的一种接种物和65～75%(v/v)的1～4gCOD/l污水(以工作体积计算)，将该体系搅拌均匀，pH值调到6.5～7.5，然后b)在厌氧条件下于中温温度范围内进行间歇式发酵5～10天(最好是6～8天)，然后，c)5～10天(最好是6～8天)后，接着搅匀，移出65～75%(v/v)的发酵液，加入等体积的、浓度为1～4gCOD/l的污水，再按a2.)段中说明的操作步骤重复间歇式发酵，d)在类似条件下再进行间歇式发酵5～12天(最好是6～10天)，但对发酵液进行电刺激，e)收集所得到的经电刺激的接种物。
用直流方波脉冲产生电刺激，该脉冲的振幅为30～250v，频率为5～50Hz，脉冲间的间歇时间为5～50秒。
由于可以通过改变其参数(振幅、脉冲宽度)容易地改变刺激能量，因此通常用电脉冲对细胞、神经细胞和肌肉进行人工刺激[F.Brunó StraubBiological Lexikon，Vol.2.pp.280-282(1978)，Akadémiai Kiadó，Budapest，Hungary]。
激发性和脉冲传导性是所有活细胞的特性。在所有细胞中，刺激过程的起始和发展与细胞膜的电性质的变化性相关[H.SchaeferElektrobiologie des Stoffwechsels.Handbuch d.allgem.Pathologie，Band 4，Teil Ⅱ.Berlin-Gōttingen-Heidelberg，Springer(1957)]。
电荷被细胞膜的内外表面分离，这样在静止时就形成了一个电位差，该细胞膜处于极化状态[A.L.Hodgkin.，B.KatzJ.Physiol 108，37(1949)]。
受到电刺激时极化状态被去极化，形成一个作用电势。静止时，细胞膜外表面和内表面间的电位差达到-90mv;而受到电刺激时，不仅这一电势差被抵消，还产生+50mv的反极化强度[P.BálintPhysiology.PP.38，39，59，67，Medicina Press.Budapest，Hungary(1963)]。
作用电势过程为了产生一个作用电势，刺激必须达到一个特定临界值，在选定实验条件下所产生刺激的振幅保持稳定。
仅在间隔较长时间后，不能产生亚最小临界值的作用电势，即使用超最大刺激也不能诱导响应。为了恢复其起始激发性，在两次刺激之间必须有一个时间间隔，这就是间歇时间两次刺激之间的时间间隔[J.W.Woodbury，H.D.PattonMedical Physiology andBiophysics(1960)，Eds.T.C.Ruch，J.F.Fulton，18th Ed.Saunders，Philadelphia-London]。
电流通过时检测不到任何刺激或作用电势。只是电路接通及关闭时所引起的刺激能的变化才看作刺激。仅在刺激后才出现作用电势(刺激的结果)[P.BálintPhysiology，P.64(1963)，Medicina Press，Budapest，Hungary]。
一种刺激的出现和消失的增加速率和减少速率至关重要，这就是为什么推荐使用方波脉冲的原因，因极陡的信号波形其刺激增加速率是最高的。
脉冲技术定义如下[K.TarnayElectrone tube connections.2nd Ed.Technical Press，Budapest，Hungary(1962)]脉冲 单电压冲击，单电能冲击脉冲波形 电压-时间关系曲线脉冲振幅 电压值(v)重复时间 两次脉冲之间的时间重复频率 单位时间的刺激次数脉冲宽度 电压处于大于零的稳压值时的时间填充因子 脉冲宽度与重复时间之比间歇时间 两次刺激之间间歇的时间间隔刺激时间 对培养物的刺激时间。
本发明方法中所使用的电刺激的技术参数说明方波脉冲;振幅30～250v，最好80～100v;频率5～50Hz，最好20～30Hz;间歇时间5～50秒，最好10～20秒;刺激时间4～12小时/天，最好是5～8小时/天。
按本发明的实施方案，通过从任一城市污水处理厂的消化装置中移去新鲜消化的淤渣来制备接种物。这些消化装置通常有几千米3的容积，对工业规模的接种物制备而言，需要约1～2米3的淤渣;而对于实验室试验几升就足够了。该新鲜消化的淤渣输入一个配备有搅拌器和加热夹套的发酵装置中。在实验室里，如果已有了用于将已消化淤渣混匀的机械搅拌，用带有密封盖的一个容器就可以了。
按本发明该实施方案，微生物繁殖所要求的中温温度范围非常重要，此温度范围应是25～40℃，最好是30～38℃。可用任何已知的方法实现该特定温度范围，例如让所需温度的水或任何其它液体在发酵装置的夹套中循环。在大发酵装置中无需加热夹套，这是由于发酵是一放热过程的缘故。在实验室里，发酵装置可放在有空调的房间内或恒温箱内。
工业或实验室用发酵装置与一个贮气罐相连，以确保厌氧条件并收集生成的沼气进一步利用。在实验室实验中，测定沼气的体积对评价该实验是很重要的，这是由于沼气产率(ml沼气/l发酵母液)是发酵过程的主要参数之一。
在2～10天(最好是4～7天)中让刚刚消化的淤渣适应新条件，这是由于活的体系(个种微生物的混合)不得不适应新的环境。也可以通过每天移出5～10%(v/v)的污水淤渣补入等体积的已消化的淤渣或懦种易纯化的污水的办法，使其起适应性变化。
几天内新的平衡就稳定了，然后终止适应性变化，开始用一刺激源对该系统进行电刺激。刺激持续时间每天4～10h(最好6-8h)，持续5～12天(最好是6～10天)。最后得到含有厌氧的，嗜温的、主要是产乙酰微生物-产甲烷微生物的混合微生物种群的新接种物，该接种物用于处理来自各种污染源的污水。
向受到上述电刺激的接种物(在非无菌条件下，最好每天都进行电刺激)中加入浓度为0.1～3.5gCOD/l(如果必要可稀释)的等体积的污水，能改进污水处理效果。按照该方法的另一种操作法，不使用经电刺激的接种物，而是将浓度为0.1～3.5gCOD/l(如果必要可稀释)污水直接加到城市污水处理厂的刚刚消化的污水淤渣中。即使在这种情况下，最好还是让淤渣适应环境几天。加到接种物上的污水量和最终稀释倍数取决于污水的来源和质量。待处理污水的浓度经常高于0.1～3.5gCOD/l，最好稀释，因为这样一来，该接种物的厌氧的、嗜温的、主要是产乙酰微生物-产甲烷微生物种群可更快地适应各自的污水。可以用水稀释，但污水处理厂的流出液是更好的稀释剂，因为，正如我们在关于污水纯化的专利说明书中“实施例3”所描述的，流入污水的COD浓度是30g/l，经转化率为92%的转化后，流出物的COD浓度仍达2.4g/l(这需要进一步纯化)。在我们的“实施例4”中，乳品厂的污水不需要稀释，因为，与“实施例3”不同，其COD浓度在0.1～3.5gCOD/l范围内，此外，其所含杂质可容易地转化成沼气。适应性变化的持续时间以及稀释比率及是否需要稀释总是由待纯化的污水的质量所决定的，然而，这不需要超出本发明及该领域中人所共知的知识以外的专门知识。
用方波电流脉冲对厌氧的、嗜温的、产生甲烷的工艺过程进行循环(有规律地周期性地继续)刺激，是本发明的一个主要特点。在污水处理过程的两步骤中进行刺激;或者，如果接种物的产乙酰微生物-产甲烷微生物(主要是产甲烷微生物)的微生物种群已适应最终稀释至浓度为0.1～3.5gCOD/l的污水，则可在第一个步骤进行刺激。当污水的COD浓度开始增加时，第二次进行循环刺激(持续1～20天，取决于污水来源及组成)。自然地，当污水不需要稀释时，也就不需要第二个刺激循环。第二次刺激循环时间通常是5～40天，与此同时，形成了由粒径为1～5mm的颗粒状的高产甲烷微生物活性的厌氧嗜温混合微生物种群所组成的颗粒床。
按本发明的另一个实施方案，形成的不是课颗粒而是具有高产甲烷微生物活性的固定在载体上的一种生物膜。载体可使用各种沸石，最好用AkvarosorbR。
按第二种方法，向10～50%(v/v)，最好是25～35%(v/v)的接种物(如果需要，可电刺激预处理)中加入污水(浓度为1～4gCOD/l)使其达到100%(v/v)，将该体系搅拌均匀，然后将pH值调至6.5～7.5。含接种物和污水的系统在厌氧条件下于中温温度范围培养5～10天(最好6～8天)，然后移去50～80%(v/v)[最好是65～70%(v/v)]的发酵母液，用等体积的相同COD浓度的污水补充进去，以后按上述继续发酵同样长时间。结束第二次发酵后，向发酵母液中加入0.1～3.0%(w/v)的载体(颗粒大小0.2～0.3mm)[通常某种沸石形矿物作载体，其中之一，AkvarosorbR(National Ore and Mineral Mines，Hegyalja，Mád，Hungary)证明是可优选的载体]，将整个系统搅拌几天(1～4天)。结束搅拌后，让悬浮液澄清，滗出上层清液(通常占总体积的80～90%(v/v)，取决于系统中所加的载体量)。固定在载体上的、保留下来的生物物体输入一个发酵装置(本发明确方法的第一种操作法中描述过)，在那里再保持剧烈上行循环几天，其后按以前的方法进行纯化。
在整个操作过程中精确地调pH值非常重要。一般在pH范围6～8(最好是6.8～7.5)进行操作。
以下实施例说明了本发明的应用范围，但本发明的应用范围并不区限在这些范围内。
实施例1制备接种物和增加厌氧的已消化淤渣的消化活性在1500ml配有用保温材料制作的密封盖的玻璃缸发酵装置中进行操作。两根不锈钢电极(直径2mm)，彼此间隔85mm，穿过上盖垂直插入发酵缸内。应选择电极长度使其能够浸入淤渣内130mm。
a.)将1000ml取自城市污水处理厂的2000米3消化装置中的新鲜已消化的淤渣倒入玻璃发酵缸中(发酵缸密闭，连接一贮气罐并放入一间温度为33～35℃有空调的房间)。淤渣每天搅拌一次(5分钟)，然后移出100ml淤渣，补充100ml已消化污水淤渣，然后再搅拌5分钟。这样半连续(每天移出和加入)消化持续7天以达到新的平衡，每天重复这种操作(移出-加入)。
b.)在上述所描述的移出-加入循环后的第8天，用一个发生器让该系统每天8小时接受电刺激。
电刺激参数类别 方波脉冲振幅 80v频率 20Hz间歇时间 15秒每天刺激持续时间 8小时接着16小时间歇表1，列出了先是7天无刺激消化然后连续10天在电刺激下化的试验结果。
表1无电 电 差率刺激 刺激 %消化的淤渣:
溶解COD(g/l) 2.8 1.6 -28.6生物气体(biogas)生成(ml/l) 435 762 +75.2生物气体组成%(v/v):
CH462 70 +12.9CO238 30 -21.1产生的CH4(ml/l) 269.7 533.4 +97.7
表中的数据说明在电刺激下a.)淤渣中的溶解COD显著将低(-28.5%)，b.)生物气体生成量(这是产甲烷微生物活性的一个典型特征)。大大增加(+75.2%)，c.)甲烷产量与无刺激样品比较几乎增加了一倍(这增加了生物气体的热值，而热值是判断该工艺是否可用的关键，最后，d.)生物气体中惰性物含量(CO2)显著降低。
实施例2连续污水处理(城市的)a.)在带有两个竖直不锈钢电极(直径2mm)的2000ml的玻璃缸发酵装置中进行操作。
将1500ml取自城市污水处理厂的厌氧消化装置中的刚消化的淤渣输入发酵装置中(该装置放在33-36℃的空调房间)，并以上行流动方式连续循环2天(用一个泵)。
b.)第三天，停止已消化淤渣的循环，开始连续通入污水;将1500ml/天的城市污水(0.5g/l的COD)从底部导入发酵装置，造一个容器中收集等量的流出液。与此同时将电极引出线与发生器相连，开始电刺激。
电刺激参数类别 方波脉冲振幅 80v频率 20Hz间歇时间 10秒每天刺激持续时间 12小时，接着12小时间歇据此，通过12小时的上述电刺激处理，该混合产乙酰微生物-产甲烷微生物的微生物种群和连续输入污水的COD浓度逐渐增加到14.0g/l，调整整个系统使之适应从高有机物含量(COD)向甲烷的转化。电刺激连续进行15天。随着COD载荷和电刺激的逐渐增加，从适应的第15～20天起生成微生物聚集体，到适应的第30～35天，发酵装置中高产甲烷微生物活性的颗粒(直径2～4mm)的生成结束。
适应的第35天的实验参数发酵装置内污水流入物的COD浓度 14g/l发酵装置中污水流出液的COD浓度 0.56g/l生物气体转化率 96%发酵装置单位容积的生物气体产量 5.81/l发酵装置/天生物气体的甲烷含量 80%表2列出了在相同条件下，使用及不使用实施例2所述的电刺激时，用同样的消化淤渣在同样的发酵装置中进行污水处理的技术参数。
表2无电 电刺激 差率%刺激适应时间(天) 80 35 -56.25污水流出液COD值(g/l) 1.54 0.56 -63.6COD转化率(%) 89 96 +7产生的生物气体 5.2 5.8 +11.5(1/1发酵装置/天)生物气体组成:
CH4% 74 80 +6CO2% 26 20 -6上述的数据说明，使用电刺激时a.)适应时间和b.)流出污水的COD浓度显著降低，而c.)生物气体产量和d.)生物气体中能量成份含量(CH4)增加。
实施例3含挥发性脂肪酸的工业污水处理a.)将3升按照实施例1，b.)所述程序进行电刺激的消化淤渣移入工作容积10升的发酵装置中，然后加入7升含低级烷基(C2～C5)脂肪酸的污水(1.5g/l的COD)，搅拌混合物，用氢氧化钠溶液将pH值调到6.8～7.2。将发酵装置密闭，放入33～35℃的有空调的房间，在厌氧条件下间歇发酵7天。
在间歇发酵接种进行的第7天，在剧烈搅拌后，放出7升的发酵母液并弃去，向发酵装置中剩余下来的3升接种物中，加入7升新的污水(1.5g/l的COD)，用氢氧化钠溶液将pH值调到6.8～7.2，关上发酵装置，再厌氧间歇发酵7天。
接种后的第6～8天，加入50g“AkvarosorbR”载体粉末(颗粒大小0.2～0.3mm)(National Ore and Mineral Mines，Hegyalja，Mád，Hungary)，将混合物缓慢搅拌48小时，然后轻轻倒出8.5升的清澈的上层清液并弃去。
b.)将固定在1500ml载体上的残余生物物质转入玻璃发酵缸中并以上形流动方式循环2天。
第三天停止循环，按实施例2.b)段所述的方法继续进行操作，但用含1.5g/l的COD和1.2g/l的挥发性脂肪酸的污水来开始适应(污水连续地通过固定在载体上的生物物质。
使用的电刺激参数类别 方波脉冲振幅 100v频率 40Hz间歇时间 30秒每天持续刺激时间 8小时，接着16小时间歇此后，含脂肪酸污水的COD浓度连续地、逐渐地增至30g/l，每天8小时进行电刺激使整个系统适应以加速高含量有机物(COD，挥发性脂肪酸)转变成甲烷。在适应的头10天中使用电刺激。
从适应的第20天起，将COD浓度为30g/l的污水源源不断地输入发酵装置中。
污水处理过程平衡的参数如下发酵装置中流入污水的COD浓度 30g/l发酵装置中污水流出液的COD浓度 2.4g/l生物气体转化率 92%单位发酵装置容积的生物气体产量 7.51/l发酵装置/天生物气体中的甲烷含量 78%如果在相同条件下在同样的发酵装置中进行污水处理而不使用电刺激，则至多只能处理18gCOD/l的污水(转化率85%，适应时间为50天)。
结果列于表3中。
表3无电 电 差率刺激 刺激 %适应时间/天 50 20 -60流入污水的COD值(g/l) 18 30 +66.6流出污水的COD值(g/l) 2.7 2.4 -11COD转化率(%) 85 92 +7生物气体产量 4.3 7.5 +74(1/1发酵装置/天)生物气体组成:
CH4% 71 78 +7CO2% 29 22 -7实施例4乳品厂污水处理a.)用实施例3、a.)段中所述的操作步骤，但将7升乳品厂污水(3gCOD/l)加到3升已电刺激过的接种物上。然后按照实施例3、a.)段和b，)段进行接种，间歇发酵，与载体混合(AkvarosorbR)和进行循环。
结束循环后，再按实施例3、b.)段所述的操作步骤继续操作，但在进行适应时，连续8天用连续输入的乳品厂污水(3g/l的COD)和以下参数的电刺激处理类别 方波脉冲振幅 80v频率 20Hz间歇时间 15秒每天持续刺激时间 5小时，接着19小时间歇适应后第12天的平衡参数发酵装置中污水流入物的COD浓度 3g/l发酵装置中污水流出物的COD浓度 0.09g/l生物气体转化率 97%单位发酵装置容积的生物 1.31/l气体产量 发酵装置/天生物气体的甲烷含量 75%实施例5改进发酵液中B12辅酶产量方法在带有保温材料制作的密封盖的一个2500ml玻璃发酵缸中进行操作，间距为100mm的两根不锈钢电极(直径3mm)垂直伸入发酵缸中，注意电极应浸入发酵液液面以下170mm.
a.)将取自在玻璃发酵缸中按匈牙利专利说明书No.188，955(等效于美国专利说明书No.4，659，661)中的方法半连续发酵的、B12辅酶生产过程的母液2000ml，按实施例1，b.)段所述的操作步骤，半自动发酵5天。按照匈牙利专利说明书No.188，955，实施例2，a.)段中第二栏、第六节中的方法，每天测定母液活性组分含量(B12辅酶+因子Ⅲ)和甲醇分解率。母液中的活性组分含量达17.5mgB12辅酶/l发酵母液，亦即，每天排出10%母液，则活性组分的日产量等于1.75mgB12辅酶/l发酵母液。这种水平的活性组分产量每天消耗4.8g甲醇/l母液。甲醇分解率为0.2g甲醇/l发酵母液/小时。生产1mg/l母液/天的活性组分需要甲醇2.74g/l母液/天。
b.)从操作的第六天起，按前面的方法继续进行发酵(移出10%母液)，加入匈牙利专利No.188，955，第六页第一栏所述的一种介质，通过两个电极和安装在发酵装置上的发生器开始对发酵进行电刺激。
电刺激参数类别 方冲脉冲振幅 150v频率 30Hz间歇时间 20秒每天持续刺激时间 2×5小时2×7小时间歇然后完全不变地按匈牙利专利No.188，955、实施例1，b.)段所述的方法继续发酵并按上述的刺激法重复进行循环电刺激。在发酵期为5天的发酵过程中，甲醇分解率增至0.37g甲醇/l发酵母液/小时，亦即，该微生物在13小时内利用了每天所加入的4.8g/l甲醇。活性成分产量保持不变，即1.75mg/l发酵母液/天。
c.)再后按(b.段)所述进行发酵和刺激，但要把原日加入甲醇量-4.8g甲醇/l发酵液/天，与甲醇分解率成正比地增至8.8g甲醇/l发酵液/天，再继续发酵10天。在此10天发酵期内，发酵液的活性成分含量增加到32mgB12辅酶/l发酵液，从而提高了生产能力(生产能力与甲醇利用率的提高成正比)。
发酵结果列于表4。
表4无电 电 差率刺激 刺激 %B12辅酶产率(mg/l母液/天) 1.75 3.2 +83甲醇分解率(g甲醇/l母液/小时) 0.2 0.37 +85甲醇利用比率(g甲醇/mgB12辅酶/天) 2.75 2.75 0
权利要求
1.一种强化发酵方法，包括在发酵过程的任一步骤中对发酵介质使用电刺激。
2.按照权利要求1所要求的方法，它包括在接种物制备步骤和/或适应步骤和/或在发酵平稳(产生)阶段使用电刺激。
3.按照权利要求1所要求的方法，它包括在发酵过程的接种物制备步骤中使用电刺激。
4.按照权利要求1所要求的方法，它包括在发酵过程适应步骤中使用电刺激。
5.按照权利要求1所要求的方法，它包括在发酵过程的接种物制备和适应步骤中应用电刺激。
6.按照权利要求1所要求的方法，它包括在发酵过程的接种物制备、适应及平稳(产生)步骤中应用电刺激。
7.按照权利要求1～6中任一个所要求的方法，它包括在厌氧的、嗜温的、产甲烷的发酵过程中使用电刺激。
8.按照权利要求1～6中任一个所要求的方法，它包括在厌氧的、嗜温的、产甲烷的发酵过程中使用电刺激，优选通过产乙酰微生物-产甲烷微生物(主要是产甲烷微生物)的微生物种群改进在腐烂条件下进行的污水处理过程。
9.按照权利要求3所要求的方法，它包括a.)将25～35%(v/v)的接种物和65～75%(v/v)的1～4gCOD/1的污水(按工作体积计算)加到间歇式发酵装置中，将系统搅匀，并将pH值调至6.5～7.5，然后b.)在厌氧条件下于中温温度范围内进行间歇发酵5～10天(最好是6～8天)，然后，c.)过5～10天(最好6～8天)以后，接着搅匀，移出65～75%(v/v)的发酵液，加入等量的浓度为1～4gCOD/l的污水，按a2.)段中所述的程序重复间歇式发酵，d.)在类似条件下再间歇发酵5～12天(最好6～10天)，但对发酵给予电刺激，e.)收集所得的已电刺激的接种物。
10.按照权利要求8所要求的方法，它包括a.)向一个有两根电极的密封发酵装置内加入从城市污水处理厂的最终清化装置中刚获得的污水(最好用循环电刺激进行预处理)并且于中温温度范围围持一个上行循环流动1～4天，然后b.)每天向形成的接种物中加入至少与其等体积的0.1～3.5gCOD/l的污水，开始循环电刺激，保持系统的强上行流动，将生成的生物气体输入贮气罐中并收集与流入污水等体积的流出液，以后c.)待处理污水的COD负荷逐渐增至浓度为3～40g COD/l，与此同时，保持循环电刺激5～30天，在此期间，高产甲烷微生物活性，适应特殊污水的生物物质发展，终止电刺激，如果需要，继续电刺激。d.)处理过的污水可排放或进一步纯化，产生的生物气体被输入贮气罐中并加以利用。
11.按照权利要求1～10中任一个所要求的方法，它包括使用一个30～40℃(最好31～33℃)的中温温度范围。
12.按照权利要求1～11中任一个所要求的方法，它包括使用由30～250v，5～50Hz频率以及间歇时间为5～50秒的直流方波脉冲所引起的电刺激。
13.按照权利要求1～12中任一个所要求的方法，它包括使用由80～150v、频率为20～40Hz及间歇时间为10～30秒的直流方波脉冲所引起的电刺激。
14.按照权利要求1～13中任一个所要求的方法，它包括使用5～12小时的循环电刺激，7～19小时的间歇。
15.按照权利要求1～14中任一个所要求的方法，它包括发酵过程中采用B12辅酶微生物种群。
16.按照权利要求15所要求的方法，它包括用振幅为100～220v，频率为20～50Hz，间歇时间为10～40秒的直流方波脉冲进行电刺激。
17.按照权利要求15所要求的方法，它包括用振幅为120～180v(最好140～160v)、频率为25～40Hz，间歇时间为15～30秒的直流方波脉冲进行电刺激。
18.按照权利要求15～17中任一个所要求的方法，它包括引起刺激4～6小时，接着间歇6～8小时。
全文摘要
本发明涉及强化发酵新工艺，特别是在腐烂条件下厌氧、嗜温、产甲烷微生物发酵，尤其是适合污水处理、接种物形成或提高含混合的产乙酰微生物-产甲烷微生物或仅含产甲烷微生物的微生物种群的厌氧淤渣的分解能力。本发明方法主要可用于环境控制，尤其是污水处理，但也可用于其它领域，如B12辅酶发酵和最好用混合的厌氧的、嗜温的、产甲烷的微生物种群在腐烂条件下所进行的其它发酵。在本发明方法中，系统受循环电刺激。电刺激方法的生物气体产量比无刺激方法高约70—80％。
文档编号C02F3/28GK1088615SQ9311484
公开日1994年6月29日 申请日期1993年10月14日 优先权日1992年10月15日
发明者L·泽暮勒, G·儒比, A·泽克利迪, K·D·萨拉, B·D·斯帝科, A·D·森帝玛, I·D·吉哈特 申请人:格德昂·理查德化学工厂股份公司