专利名称:氰化物水解酶的制备的制作方法
本发明涉及氰化物水解酶的制备方法。
含有氰化物水解酶EC 4.2.1.66号(或者称为甲酰胺水解酶)的某种真菌，能够把氰化物降解为甲酰胺(见生物化学和生物物理学杂志151卷，468～474页，(1972年)以及植物病理学67卷，1001～1006页(1977年))，可参阅下述日本发酵技术杂志45卷，7期，630～636页(1967年);46卷，10期，807～813页(1968年);47卷，10期，639～643页和644～650页(1969年)以及48卷，5期，277～282页和253～290页(1970年)。一般认为这种真菌适用于微生物处理含氰废液(见欧洲专利61249号)，为适合此种目的，最好含氰化物水解酶的真菌长时间后仍然稳定，而且具有高活性。
根据本发明，提供一种制备氰化物水解酶的方法，包括步骤(A)在温度28～34℃，pH值4.5～7.5以及稀释率不大于0.11/小时的条件下，在含碳和适当无机营养物源的液体培养中连续培养需氧微生物菌株。同时，在发酵情况下，连续地把氰离子和/或氰化氢和/或产生氰离子和/或氰化氢的化合物供给当量浓度至少为15毫克分子的培养物(完全培养基中的氰离子和/或氰化氢供给培养物);步骤(B)从培养物回收含氰化物水解酶的细胞。
一种处理含氰化物材料以降解其中氰化物的方法，其中，该材料用氰化物水解酶或包含氰化物水解酶的组合物处理，特征为氰化物水解酶是由本发明方法制备。该方法也包括在本发明范围内。
在培养条件下，加到培养物的氰离子变成氰化氢。
虽然也可使用适宜的菌株，但最好的微生物菌株是真菌菌株。可用于本发明方法的真菌包括Stemphylium loti，如ATCC 11718;陆生小齿菌;如CBS 231.53;从加拿大农业部渥太华培养中心得到的念珠形镰刀菌，如3104，SA，49a号，也可是储存号CBS161.82;Helminthosporium Sorghicola，或称作Drechslera Sorghicola，如CBS 249.49;periconiacircinata，如CBS263.37;以及Glomerella tucamanensis，CBS 132.37(ATCC NO.指的是美国马里兰州20852，罗克维尔市12301 Park Lawn Drive美国标准菌库的登记号，CBS NO.指的是荷兰巴恩真菌菌种收藏中心的登记号)。还可使用其它真菌以及在文献中所介绍的产生酶的真菌，包括Collectotrichum graminicola，高梁胶尾孢菌，大斑病长蠕孢菌，玉蜀黍专蠕孢菌，碳色长蠕孢菌，维多利亚长蠕孢菌和H.Phomna。
较好的真菌菌株是镰刀菌，尤其是砖红镰刀菌株CMI 300533，1986年2月3日储存在英国Ferry Lane，Kew，Richmond，Surrey，Tw9 3AF，英联邦真菌研究所;并由此得到变种和突变体。较好的真菌菌株CMI 300533对小麦不致病原，具有下列形态特征培养基(1)，马铃薯蔗糖琼脂(PSA)250克洗净并切成小片的马铃薯放在15磅/吋2压力的蒸煮器中15分，煮成物用两层细棉布压榨，把2%葡萄糖和2%琼脂加到混浊的滤液，对培养基进行高压灭菌及分配。
培养基(2)，Czapek-Dox(改进的)琼脂(Oxoid)(CDA)“Oxoid”表示注册商标。
生长条件25℃，几星期。
生长率分别为4.0厘米/3天3.0厘米/3天。
生长特征柔毛状白色气中菌丝体的分散菌落。带灰玖瑰色PSA培养基的斑点由深红色趋向于黄色，在CDA上趋向有点浅色的，偶而产生深红色色素，这尤其在老化时。1～2星期后，气中菌丝体趋向于棕色并萎陷。然后菌落变得相当粘稠，如形成分生孢子座，在PSA上的颜色由淡红到棕色，在CDA上变成赭色。
不产生渗出液，并且形成的色素趋向于菌丝体颜色。
分生孢子小分生孢子不是由这种真菌产生的，而由单个侧向生长担子梗或带有短状担子梗的多分支分生孢子梗产生的。在较老的培养物中，分生孢子梗聚集成分生孢子座，特别在CDA上，分生孢子从镰刀形变为弯曲纺锤状背腹形。在较新培养物中有3～5个通常为5个隔膜，孢子大小为25～50μ×2.5μ～4.0μ。
基底细胞往往是有蒂的，尤其是较长的具有5个隔膜的孢子。膨胀细胞产生在菌丝体中，厚膜孢子往往产生在菌丝内，并以单个或成簇的发生。
在我们的共同未决英国专利申请8604069号和8607595号中，介绍并要求保护由砖红镰刀菌CMI 300533的需氧培养的细胞制备氰化物水解酶的方法。
可使真菌以两种不同形式生长，即球状或粒状形式或成分散状，即真菌细胞是分散在生长培养基中的弥散丝条。为用于废液处理，重要的是真菌从与球状或粒状相反的分散状形式生长。由于营养物的扩散和气体通过粒状真菌，而阻止粒状生长时，使得培养无效。本发明方法中的培养步骤(A)的条件有助于分散状形式的生长。
在本方法培养步骤(A)中，真菌菌株可在碳或氧限量条件下适宜地生长，然而较好的条件是在碳和氧都限量的双重条件下，这样则生长得更好。培养基最好是一种限定的培养基，即一种除了碳源外只含天然盐而无任何未限定的有机物质，如酵母液。
任何适宜的碳源可用于本方法，但葡萄糖较好。好的氮源包括硫酸铵和氢氧化铵，好的磷源包括磷酸钾和磷酸。培养基的主要成分最好在其稳定状态下，以下列浓度范围供应本方法的培养基H3PO410～20毫克分子K2SO4800～1400ppmMgSO4·7HO 700～1200ppm葡萄糖·1H2O 10，000～40，000ppm(NH4)2SO4500～3000ppm微量营养物 0.1ppm～20ppm在稳定状态下，供给培养物的一种非常适宜的培养基具有下述组分1.1M H3PO4320毫升/20升微量金属/生物素 10毫升/20升K2SO420克/20升MgSO4·7H2O 18克/20升葡萄糖·1H2O 223克/20升(NH4)2SO450克/20升微量金属/生物素(每升)FeCl3·6H2O 9.6克CuSO4·5H2O 3.6克MnSO4·4H2O 30.0克ZnSO4·7H2O 38.0克生物素 0.52克氰离子或氰化氢在本发明整个培养过程中，分别地或与其它营养物一起供给培养物。最好把氰化钠或氰化钾之类的碱金属氰化物加到用于本发明的培养基，在开始培养阶段，氰化物从低浓度开始，以渐增浓度加入，培养物中真菌细胞的允许量也随之增加。最后，在稳定状态培养期间，供给培养的完全培养基中，氰化物至少以15毫克分子浓度供给，即液体的总量给培养物，最好为2～10(尤其4～6)毫摩尔/克干重细胞。我们发现在培养物稳定状态时，供给培养物的培养基中较高浓度氰离子，能增加细胞中氰化物水解酶的活性，酶的活性程度随着氰离子浓度的增加而线性增加。例如酶活性单位即每分钟每毫升培养物产生甲酰胺的微摩尔数，在氰化物容量低(5毫克分子)时为55单位，而氰化物容量高(20毫克分子)时为220单位。
用于本方法培养步骤(A)的最佳条件如下对于最高的酶活性，稀释率在0.05～0.1/小时;pH值5.0～6.0，尤其为5.5;温度在28～32℃，尤其为30～32℃。
在培养阶段，培养物连续从进行培养的发酵桶排出，含氰化物水解酶的细胞用任意的适宜方法，最好采用过滤和排出的培养物分离。接着干燥所分离的细胞，并进一步处理，如热压产生任意适宜形式如粒状或粉末状的含氰化物水解酶细胞材料。同时，酶可与细胞分离并用于无细胞形式，一般这是不必要的，酶通常不与含酶细胞分离。含氰化物水解酶的真菌菌丝体可能是固定的，如欧洲专利61249号中所述，但是，这种提纯一般是不进行的。
由本发明方法制备的氰化物水解酶材料很适于处理含氰化物废液，例如用欧洲专利61249号的方法。制备的酶具有高度的贮存期稳定性(例如半衰期多至130天)及高活性。在限氧或限氧和限碳的双重条件下，进行本方法的培养时，产生有特别高稳定性的含酶材料。当温度在30～32℃下进行本方法的培养时，产生有特别高活性的含酶材料。
下述实施例说明本发明。
实施例1在限制葡萄糖，即在限定的培养基中，有氢化氰(HCN)存在下，连续培养镰刀菌株CMI 300533，以提高氰化物水解酶活性。在不同的培养温度，pH值5.5及稀释率0.10/小时的条件下建立稳定状态，其结果列于表1。说明在30～32℃时，酶的活性最高，低于该温度时，活性减半。34℃时生长，导致培养的失败。酶活性单位是在pH值8.5，每分钟从100毫克分子氰化钠产生微摩尔的甲酰胺。
表1温度对活性的影响PH 样品活性 稀释率 温度 〔CN〕(单位/毫克干重) (1/小时) (℃) (毫克分子)5.5 59.3 0.05 30.0 15.45.5 27.5 0.05 28.0 14.45.5 27.1 0.05 27.0 15.25.5 25.5 0.05 25.0 13.25.5 22.7 0.05 25.0 14.75.5 52.4 0.05 30.0 14.05.5 52.3 0.05 32.0 14.8实施例2在限制葡萄糖，即限定的培养基中，有氢化氰的情况下，连续培养镰刀菌株CMI 300533，提高氰化物水解酶的量。在PH(5.5)，温度(30℃)及稀释率(0.10/小时)保持不变的不同氧合率的条件下建立稳定状态。冷冻干燥所得到的酶，在4℃下贮存在硅胶上，通过超限时间测定制剂的等分试样，控制酶制剂的稳定性，其结果列于表2，说明当培养物在双重限定氧和碳情况下生长时，增加贮存酶的稳定性。
表2氧合作用 第一次半衰期有氧的 21天轻度缺氧 63天严重缺氧 90天实施例3
在限制葡萄糖，即限定的培养基中，连续培养镰刀菌株CMI 300533，测定氰化物水解酶的诱导轮廓。在PH(5.5)温度(30℃)及稀释率(0.10/小时)保持不变的不同流入浓度的氢化氰的条件下建立稳定状态。
限图表示得到的活性程度和液体培养基中多至(至少)24毫克分子的氰化物浓度之间的线性响应。图中，纵座标为以毫克分子为单位标定的氰化物浓度，横座标为总活性(如上述定义)。
实施例4在6000升容积的发酵罐中，用限定的含葡萄糖作为碳源的培养基，连续地培养镰刀菌株CMI 300533，葡萄糖浓度是限制生长的。pH在5.0～5.8，稀释率0.08～0.1/小时，温度在30～32℃。浓度61.5～73.5毫克分子的氰化钠加入营养液。培养物通过减少通气率来受氧气压力支配导致产生至多0.081克乙醇/升的培养液。超过140小时产生的生物量在12.2～14.3克/升，氰化物水解酶活性为每分钟每毫克干重(在pH8.5和20℃下用120毫克分子氰化物溶液测定)产生81.0～122.4微摩尔甲酰胺。
权利要求
1.一种制备氰化物水解酶的方法，包括步骤(A)在温度28～34℃，pH4.5～7.5以及稀释率不大于0.11/小时的条件下，在含碳和适当无机营养物源的液体培养中，连续培养需氧微生物菌株。同时，在发酵情况下，连续地把氰离子和/或氰化氢和/或产生氰离子和/或氰化氢的化合物供给当量浓度至少为15毫克分子的培养物(完全培养基中的氰离子和/或氰化氢供给培养物)，步骤(B)从培养物回收含氰化物水解酶的细胞。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于微生物菌株是镰刀菌属的菌株。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于菌株是砖红镰刀菌株CMI 300533或由此得到的变种和突变体。
4.根据上述任一项权利要求
的方法，其特征在于培养步骤(A)在碳或氧限量，或碳和氧都限量的双重条件下，培养微生物菌株。
5.根据上述任一项权利要求
的方法，其特征在于碳源是葡萄糖。
6.根据上述任一项权利要求
的方法，其特征在于氰离子和/或氰化氢源以完全培养基当量浓度为2～10毫摩尔/克干重细胞供给培养物。
7.根据权利要求
6所述的方法，其特征在于氰离子和/或氰化氢源以完全培养基当量浓度为4～6毫摩尔/克干重细胞量供给培养物。
8.根据上述任一项权利要求
的方法，其特征在于pH范围在5.0～6.0。
9.根据上述任一项权利要求
的方法，其特征在于温度范围在30～32℃。
10.一种处理含氰化物材料以降解其中氰化物的方法，其中，该材料用氰化物水解酶或包含氰化物水解酶的组合物处理，其特征在于用本发明方法制备氰化物水解酶。
专利摘要
一种制备氰化物水解酶的方法，包括在特定的温度、pH值和稀释率的条件下连续培养微生物菌株，同时，在发酵情况下，连续地把氰离子和/或氰化氢和/或产生氰离子和/或氰化氢的化合物供给培养物。微生物最好是镰刀菌株，特别是砖红镰刀菌CMI 300533。
文档编号C12R1/77GK87100788SQ87100788
公开日1987年9月16日 申请日期1987年2月19日
发明者肯尼思·雷蒙德·理查森, 彼得·莫里斯·克拉克 申请人:帝国化学工业公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan