专利名称：亲水正相色谱柱、填料及分离方法
技术领域：
本发明属于分析化学技术领域，特别涉及亲水正相色谱柱、填料及分离方法。
背景技术：
在药物分析与纯化，环境分析和部分农药残留物的分析中，亲水性较强的化合物的色谱分析一直是分析测试领域中的一个难题。特别是在药物代谢研究，核酸和多肽药物研究中，这一问题更显突出。
其中对于较易离子化的有机酸或有机碱，传统上多使用离子对的方法。即在流动相中加入大量离子对试剂，以实现所需要得到的分离。这种传统方法存在许多自身无法克服的缺点。主要是体系复杂，方法重现性差，平衡时间长等。更重要的是目前液相色谱与质谱联用已成为液相色谱发展的普遍趋势，而离子对方法则难以在液相色谱与质谱联用设备上使用。因此，近年来国际上一些厂家开始研制开发可与100％水溶液相匹配的反相色谱柱和可与高水性流动相相匹配的正相色谱柱，使相应的正相和反相色谱柱的适用范围得到明显扩展，从而在不使用离子对试剂条件也可以对亲水性较强的化合物进行液相色谱分析。
已报道的相关色谱材料和色谱柱主要可分为两类一类是可与100％水溶液匹配的反相色谱柱，又称AQ色谱柱；另一类是可与含水较高的流动相相匹配的正相色谱柱，又称Hilic色谱柱。至今已报道的HILIC柱包括无键合的硅胶柱，氨丙基键合硅胶柱，离子交换柱和γ羟基键合硅胶柱。但前三种色谱柱具有稳定性和重现性差，分离机理复杂(离子交换和极性吸附混合机理)等问题；而后一种与极性化合物的作用较弱，从而分离作用较差。因此开发新型官能团表面修饰的，有较好的重现性和稳定性，分离机理单一的HILIC色谱柱是很有意义的。
发明内容
根据现有技术的不足，本发明提供了亲水正相色谱柱、填料及分离方法。这种亲水官能团表面修饰的可承受高水含量流动相的新型正相(Hilic)色谱柱。此发明是用一个接近中性的、强极性亲水基团，对经处理过的低活性硅胶表面进行修饰以达到解决传统硅胶柱，氨基柱在高水性介质中不稳定，重现性差，分离机理复杂的问题。其特点包括在高水性流动相中有较好的稳定性和分离性能；独特的选择性；单一分离机制。
具体技术如下本发明的亲水正相色谱柱填料是，在硅胶材料上键合有酰胺基或脲基类官能团。
所用的硅胶材料为通常可采用球形多孔硅胶，球形多孔硅胶的粒径为1-50微米，平均孔径为5-30纳米。
酰胺基或脲基类官能团酰胺基或脲基的官能化硅烷；
可使用的官能化硅烷包括ROSi(CH3)2CH2CH2NHCONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CH2NHCONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CH2CONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CH2OCONHR’，(RO)2Si(CH3)CH2CH2CH2NHCONH2，(RO)3SiCH2CH2CH2NHCONH2，(RO)3SiCH2CH2CONH2，(RO)2Si(CH3)CH2CH2CONH2，(RO)3SiCH2CH2CH2OCONHR’；其中R可以是甲基、乙基、丙基等常见烷基，或苯基等简单的芳香基团；R’通常为甲基或乙基。也可使用长达6个亚甲基碳链的相似官能化硅烷。
本发明的填料是通过球形多孔硅胶与包含特定酰胺基或脲基的官能化硅烷直接反应制得。
本发明的酰胺基或脲基的官能化硅烷，如(RO)3SiCH2CH2CONH2。硅胶最好为高纯硅胶，金属杂质含量＜100ppm，以降低表面的非特征性吸附作用和提高键合覆盖率。键合覆盖率＞1.5mol/m2，最好高于2mol/m2。可使用氢氟酸或盐酸对表面处理，降低金属含量和增加硅羟基含量；或使用原硅酸脂对表面进行处理再水解，达到类似目的。键合覆盖率在1.5mol/m2到3.5mol/m2，最好高于2mol/m。键合度为0.1-3mmol/g。
其键合后硅胶材料的通用结构如图1所示从图1可以明确看到，键合的内孔表面5，被分离物质在上面通过吸附解析平衡实现分离；硅胶骨架6，保证整体的稳定性；孔通道7，使被分离物能够达到官能化的内表面.利用本发明的填料制备本发明的亲水正相色谱柱，色谱柱的结构示意图如图2所示将填料3填充柱管2内圆柱形金属或塑料柱管，两端外侧有内罗纹与管路相连，两端内侧有筛板4防止固体填料外漏，但可使液体通过；柱管内填充有本发明的填料，所得到的填料，经匀浆后，在高压下灌入柱管，然后放上筛板，拧紧柱头。便得到本发明中的新型亲水正相(HILIC)色谱柱。色谱柱管可以是通用的各类液相色谱柱管，柱管内径通常在1-100毫米，管长20-300毫米采用本发明的亲水正相色谱柱，可用于正相或反相液相色谱分离。但其应用为在含水流动相条件下的正相色谱分离。具体方法如下如图3所示1)将恒流液相泵，进样阀，色谱柱和检测器用不锈钢管或塑料管串联在一起，2)将待分离的样品进液孔(1)注入进样阀相连的样品管中，3)启动进样阀使样品管与输液泵和色谱柱相连接，4)流动相将样品带入色谱柱进行分离，5)每一个分离开的组分在通过检测器时被检测到并显示出来。
本发明的色谱柱可适用于等度或梯度分离，即流动相的组分比例在整个分离过程中可以保持恒定等度或按一定规律改变的梯度。流动相中可含有0-100％水。当含水时，其它成份应与水可互溶。常用的有机溶剂有(但不局限于)甲醇，乙腈，异丙醇，乙醇，四氢肤腩；流动相中可加入少量的0-100mmol/l可溶性酸、碱或其它缓冲盐。流动相pH范围应在1-10之间，最好在2-8之间以保证一定的色谱柱稳定性。使用温度范围大约在5-80℃，最好在20-50℃。被分离的特征化合物通常为(但不局限于)水溶性较强的有机化合物。如有机碱，有机酸，酰胺，璜酰胺，有机脲，璜酰脲，糖类，核酸，多肽，多酚类化合物等。流动相中可含有1-100mmol的可溶于流动相的酸，碱或盐作为填加剂；pH范围为1-10，最好在2-8。色谱柱的液相色谱仪；2)使用含有水和与水可互溶的有机溶剂为流动相。
本发明的特点是关键是使用了新型的酰胺基或脲基类官能团作为硅胶表面键合相，从而得到所期望的，较以非键合硅胶或氨基柱为主的传统Hilic色谱柱更优良的稳定性、重现性和单一分离机制。其特点是含有CONH2或CONHR(R为烷基)官能基，具有很强的极性和形成氢键的能力。并且为中性或极弱酸碱性的基团。用于在液相色谱上分离有机化合物的混合物。对极性化合物有很强吸附力和分离能力；可与含有O，N，P，S的有机物形成氢键。
图1填料示意图；图2色谱柱示意图；图3色谱柱分离方法示意图；图4实施例13的分离效果示意图；图5实施例14的分离效果示意图；图6实施例15的分离效果示意图。
具体实施例方式
实施例1硅胶制备将1240ml纯净水、26g浓硝酸、840g硅溶胶(7.1％)及37g尿素依次加入6000ml烧杯中，搅拌至尿素溶解。
在快速搅拌下加入100g甲醛，持续快搅15秒，室温25℃。
静置。10-15min，析出白色沉淀。
放置5-8小时，撇去上液，加纯净水搅拌，静置30分钟，撇去上液。
用丙酮洗涤，3遍，过滤。真空100℃，12小时烘干。镜检，呈4-5μm，球形，均匀。
高温烧制，300℃，3-4h；500℃，2-3h；800℃，2h；1000℃，3h。
烧完后得白色固体53克；在400毫升0.5M HF水溶液中加热至90℃4小时；过滤，200毫升纯水洗涤2次，200毫升丙酮洗涤3次；真空干燥8小时。镜检，呈5μm球形。孔径8nm，比表面198m2/g实施例2实施例1中制备得到的硅胶50克，加四乙氧基硅烷4克，三乙胺1克，甲苯200毫升；电动搅拌下加热110℃回流16小时；过滤，每次用100毫升甲苯洗涤3次，再每次用甲醇100毫升洗涤3次，甲醇与水的体积比为1∶1搅拌、再用甲苯洗涤3次，每次150毫升，甲醇洗涤3次，每次100毫升；在100℃真空干燥12小时；得白色球形固体粉末52克。C％＝0.2.
实施例3实施例1中制备得到的硅胶50克，加四乙氧基硅烷2克，甲基三乙甲氧基硅烷2克，三乙胺1克，甲苯200毫升；电动搅拌下加热110℃回流16小时；过滤，每次用100毫升甲苯洗涤3次，再每次用甲醇100毫升洗涤3次，甲醇与水的体积比为1∶1搅拌、再用甲苯洗涤3次，每次150毫升，甲醇洗涤3次，每次100毫升；；在100℃真空干燥12小时；得白色球形固体粉末51克。C％＝1.1.
实施例4实施例2中制备得到的白色固体20克，加EtOSi(CH3)2CH2CH2CONH210克，三乙胺1克，甲苯100毫升；电动搅拌下加热110℃回流18小时；过滤，每次用100毫升甲苯洗涤3次，再每次用甲醇100毫升洗涤3次，甲醇与水的体积比为1∶1搅拌、再用甲苯洗涤3次，每次150毫升，甲醇洗涤3次，每次100毫升；在100℃真空干燥10小时；得白色球形固体粉末22克。C％＝3.2，N％＝0.8。(0.5mmol/g)。
实施例5实施例3中制备得到的白色固体20克，加EtOSi(CH3)2CH2CH2NHCONH210克，三乙胺1克，甲苯100毫升；后期工艺与实施例4相同；得白色球形固体粉末20克。C％＝4.8，N％＝1.8。(0.6mmol/g)实施例6实施例2中制备得到的白色固体20克，加(EtO)3SiCH2CH2CH2NHCONH220克，三乙胺1克，甲苯100毫升；后期工艺与实施例1相同；得白色球形固体粉末21克。C％＝3.8，N％＝1.9。(0.8mmol/g)实施例7实施例1中制备得到的白色固体20克，加(PhO)3SiCH2CH2CONH220克，三乙胺1克，甲苯100毫升；后期工艺与实施例4相同；得白色球形固体粉末22克。C％＝1.8，N％＝0.6。(0.4mmol/g)实施例8球型硅胶30克(30nm平均孔径，5μm平均粒径)，加EtOSi(CH3)2CH2CH2CONH28克，三乙胺1克，甲苯200毫升；电动搅拌下加热110℃回流18小时；后期工艺与实施例4相同；得白色球形固体粉末29克。C％＝1.4，N％＝0.4。(0.2mmol/g)实施例9无定型硅胶600克(6nm平均孔径，50μm平均粒径)，加500克(EtO)3SiCH2CH2CH2NHCONH2，三乙胺50克，甲苯2000毫升；电动搅拌下加热110℃回流18小时；过滤，甲苯1000毫升洗涤3次，甲醇1000毫升洗涤3次，甲醇与水的体积比为1∶1搅拌、甲苯1500毫升洗涤3次，甲醇1000毫升洗涤3次；真空干燥100℃，10小时；得白色球形固体粉末630克。C％＝7.8，N％＝4.3。(1.5mmol/g)实施例10实施例5中所得到的白色固体3克，甲醇30毫升，搅拌制得浆液。在500公斤/平方厘米压力下，使用甲醇灌装进1支4.6毫米(内径)×250毫米(长度)色谱柱。
实施例11实施例9中所得到的白色固体340克，甲醇1000毫升，搅拌制得浆液。在100公斤/平方厘米压力下，使用甲醇灌装进1支50毫米(内径)×250毫米(长度)色谱柱。
实施例12实施例5中所得到的白色固体0.5克，甲醇10毫升，搅拌制得浆液。在300公斤/平方厘米压力下，使用甲醇灌装进1支2.1毫米(内径)×50毫米(长度)色谱柱。
实施例13实施例10中所得到的色谱柱，使用岛津10A液相色谱系统，在下列条件下，对一系列硝基苯胺类化合物分离得到如附图4所示的4个色谱峰，分别是硝基苯8，邻硝基苯胺9，间硝基苯胺10和对硝基苯胺11。以对硝基苯胺测试柱效塔板数为21225，拖尾因子为1.10。
测试条件样品 硝基苯胺类化合物流动相91.8％氯丁烷；8％甲醇；0.2％水流速 1.0mL/min温度 35℃检测 UV 254nm结果(对硝基苯胺)
实施例14用岛津10A液相色谱仪，实例10中所制得的色谱柱，对脲嘧啶和乙酰基脲嘧啶混合物进行分离。在下列条件得到如图5的分离结果乙酰胞嘧啶12；胞嘧啶13；以胞嘧啶测试理论塔板数为12030；保留指数K’＝1.2；与乙酰胞嘧啶之间分离度α(胞嘧啶/N-乙酰胞嘧啶)为1.5。
色谱柱HILIC，5um，4.6×150mm流动相10mmol磷酸二氢钠(pH7.0)/乙腈＝35/65温度45℃检测UV 254nm样品胞嘧啶/乙酰胞嘧啶实施例15用岛津10A液相色谱仪，实例10中所制得的色谱柱，分析井岗霉素纯度。所用条件为色谱柱4.6×250mm，5um；流动相乙腈/水梯度85/15-40/60％，30分钟；温度25℃；检测UV 210nm。被测物质井岗霉素与杂质间得到有效分离。以峰面积进行归一化计算得井岗霉素纯度76％，色谱图见图6，可见峰为井岗霉素14。
本发明公开和提出的及亲水正相色谱柱、填料及分离方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料、工艺参数等环节实现。本发明及亲水正相色谱柱、填料及分离方法已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的及亲水正相色谱柱、填料及分离方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
权利要求
1.一种亲水正相色谱柱填料，其特征是在硅胶材料上键合有酰胺基或脲基类官能团。
2.如权利要求1所述的亲水正相色谱柱填料，其特征是所述的硅胶材料为通常可采用球形多孔硅胶，球形多孔硅胶的粒径为1-50微米，平均孔径为5-30纳米。
3.如权利要求1所述的亲水正相色谱柱填料，其特征是所述的酰胺基或脲基类官能团酰胺基或脲基的官能化硅烷。
4.如权利要求3所述的亲水正相色谱柱填料，其特征是所述的官能化硅烷包括ROSi(CH3)2CH2CH2NHCONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CH2NHCONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CH2CONH2，ROSi(CH3)2CH2CH2CH2OCONHR’，(RO)2Si(CH3)CH2CH2CH2NHCONH2，(RO)3SiCH2CH2CH2NHCONH2，(RO)3SiCH2CH2CONH2，(RO)2Si(CH3)CH2CH2CONH2，(RO)3SiCH2CH2CH2OCONHR’；其中R可以是甲基、乙基、丙基等常见烷基，或苯基等简单的芳香基团；R’通常为甲基或乙基。也可使用长达6个亚甲基碳链的相似官能化硅烷。
5.如权利要求2所述的亲水正相色谱柱填料，其特征是所述的硅胶为高纯硅胶，金属杂质含量＜100ppm，以降低表面的非特征性吸附作用和提高键合覆盖率。键合覆盖率1.5mol/m2到3.5mol/m2。
6.如权利要求1所述的填料所制备的亲水正相色谱柱，其特征是在柱管2内填充填料3，柱管两端外侧有内罗纹与管路相连，两端内侧有筛板4防止固体填料外漏。
7.如权利要求6所述的填料所制备亲水正相色谱柱，其特征是所述的色谱柱柱管内径通常在1-100毫米，管长20-300毫米。
8.采用权利要求6所述的亲水正相色谱柱的色谱分离方法，其特征使步骤如下1)恒流液相泵，进样阀，色谱柱和检测器用不锈钢管或塑料管串联在一起，2)将待分离的样品经进液孔(1)注入与进样阀相连的样品管中，3)启动进样阀使样品管与输液泵和色谱柱相连接，4)流动相将样品带入色谱柱进行分离，5)每一个分离开的组分在通过检测器时被检测到并显示出来。
9.如权利要求9所述的亲水正相色谱柱的色谱分离方法，其特征是所述的流动相中含有0-100％水，0-100mmol/l可溶性酸、碱或其它缓冲盐；当含水时，其它成份应与水可互溶；pH范围为1-10，温度范围在5-80℃。
10.如权利要求9所述的亲水正相色谱柱的色谱分离方法，其特征是所述的流动相pH范围为2-8，温度范围在20-50℃，流动相中可含有1-100mmol的可溶于流动相的酸，碱或盐作为填加剂。
全文摘要
本发明涉及亲水正相色谱柱、填料及分离方法。本发明的亲水正相色谱柱填料是，在硅胶材料上键合有酰胺基或脲基类官能团。色谱柱是将填料填充柱管内圆柱形金属或塑料柱管，两端外侧有内螺纹与管路相连，两端内侧有筛板防止固体填料外漏，但可使液体通过；本发明的特点是关键是使用了新型的酰胺基或脲基类官能团作为硅胶表面键合相，从而得到所期望的，较以非键合硅胶或氨基柱为主的传统Hilic色谱柱更优良的稳定性、重现性和单一分离机制。其特点是含有CONH
文档编号B01J20/281GK1943848SQ20061001558
公开日2007年4月11日 申请日期2006年9月5日 优先权日2006年9月5日
发明者汪群杰 申请人:天津博纳固体材料科技有限公司