专利名称：甲烷氧化菌的一种培养方法
技术领域：
本发明涉及微生物的培养方法，特别是涉及甲垸氧化菌的一种快速、高密度的培 养方法。
背景技术：
甲垸氧化菌是自然界中一类特殊的微生物，它以甲烷为唯一碳源及能源。虽然某 些甲垸氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲垸氧化菌都不能以多碳化合物作为碳 源进行生长。
甲垸氧化菌不但在全球甲垸温室气体控制方面起到重要作用，而且在水陆生态环 境的元素循环中也发挥着不可忽视的作用。甲垸氧化菌以其多样的催化功能，在大宗 化学品生产、新功能酶开发、瓦斯气体的安全预警和应急技术开发以及环境污染物的 生物修复方面都具有极大的应用潜力。
甲垸氧化菌利用甲烷的第一步是在甲垸单加氧酶(Methane monooxygenase，應0) 的作用下将甲垸直接转化为甲醇。甲垸单加氧酶是生物体系中唯一能够在常温常压下 选择性氧化甲垸生成甲醇的酶系，具有转化效率高，选择性好的优点(Richard S. Hanson, Thomas E. Hanxon. Methanotrophic Bacteria. Microbiological Reviews. 1996 (60) :439-471)。利用含麗O的甲烷氧化菌不仅可以将甲垸部分氧化成中间代谢 产物甲醇，进一步转化成二氧化碳，还可以催化C1-C20烷烃化合物羟基化和C2-C10烯 烃化合物的环氧化。甲烷氧化菌的丽0还具有氧化三氯甲烷、三氯乙烯、二氯甲烷等 卤代烃类化合物的特性，在难降解的有机化合物的污染治理方面应用前景广阔。目前， 国外在利用甲烷氧化菌治理三氯乙烯的污染方面进行了应用研究(Laurence H. Smith ， Peter K. Kitanidis ， Perry L. M cCarty. Numerical Modeling and Uncertianties in Rate Coefficients for Methane Utilization and TCE Cometabolism by a Methane-Oxidizing Mixed Cuture. Biotechnol Bioeng 1997 (53): 320 - 331.)。此外，由于甲烷氧化菌可以代谢利用甲垸，对于煤矿和气田的瓦斯气 体泄漏的处理也具有重要的应用价值。由于甲烷单加氧酶氧化甲烷生成甲醇的过程需 要NADH，因此该酶价格昂贵，此外该酶的体外再生技术不成熟，纯化过程复杂，稳定 性差，因此利用含腿O的甲烷氧化菌进行整细胞催化成为上述工业应用的主要途径。 一般情况下，由于甲烷在水溶液中的溶解度低，甲烷氧化菌利用甲垸的效率低，导致
甲烷氧化菌生长速率慢、所得细胞浓度低，并且纯培养的甲烷氧化菌通常增长缓慢， 因此细胞密度低成为限制甲垸氧化菌及其混合菌工业化应用的瓶颈问题。强化气液传 质是建立甲垸氧化菌快速高密度培养及其应用体系的关键技术之一。因此，强化气液 传质，提高气液传质速率是实现甲烷氧化菌及其混合菌高密度细胞培养首先需要解决 的问题。传统的解决办法是增加气速和搅拌速率，但增加气速和搅拌速率， 一方面将 导致大量泡沫生成，从而降低反应器的使用效率；另一方面，气速和搅拌速率的增加， 必然会增大动力消耗，增加操作成本。与培养一般好氧微生物细胞不同，在甲垸氧化 菌的细胞培养过程中，不仅需要空气或氧气，而且需要甲烷气体。此外，当甲垸与空 气或氧气的混合比例超过一定范围时还会有爆炸的危险；增大气流速度必然会使气体 大量循环，导致工艺复杂，动力消耗增加。因此迫切需要一种甲垸氧化混合菌的快速、 高密度培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲烷氧化菌较快速、高密度的培养方法。 为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案 一种甲垸氧化菌的快速、高密
度培养方法，是在常规培养甲烷氧化菌的液体培养基中添加正十六垸，形成两相培养
体系，其它培养条件与常规培养方法相同。
用上述方法对甲垸氧化菌进行培养时，只需将正十六烷直接加入常规培养甲烷氧
化菌的液体培养基中即可。正十六垸的添加量与培养容器的形状及培养方法有关，其
在培养基中的体积百分含量优选为0. 1-20%。
为获得更高的培养效率，所述正十六垸优选为经甲垸饱和的正十六烷。 所述对正十六烷用甲烷进行饱和的方法，是将正十六烷置于充满甲垸和空气的密
闭器皿中进行振荡，使甲垸和氧分子尽可能地溶解于正十六垸中。
此外，还可在上述甲烷氧化菌的培养过程中，向所述液体培养基中通入甲垸和氧
气，气体通入量为10-20mL/升培养基，其中，甲烷和氧气的体积比范围为1:0.5-1.5。 用上述方法培养得到的甲垸氧化菌也属于本发明的保护范围。 本发明公开了一种甲烷氧化菌的培养方法。该方法是在甲烷氧化菌常规培养方法 的基础上，在培养基中添加正十六垸。在用本发明的方法对甲烷氧化菌进行振荡培养 的过程中，正十六垸受到机械力的剪切作用形成微小的分散液滴，这些液滴可以提高 甲烷的溶解度，而且由于其与菌体细胞的亲和性，细胞可以在水相和有机相之间穿梭， 强化了微生物利用甲烷的速度。与常规培养方法相比，本发明的方法可以极大程度地 提高甲垸氧化菌的生长速度和细胞密度，且培养方法简单，具有较高的工业化应用可 行性。基于上述优点，本发明将在甲垸氧化菌的培养及其工业应用(如生物催化、瓦
斯气体治理、垃圾填埋场甲浣气的降解和/或生物修复等)中发挥巨大作用，应用前 景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为甲垸氧化菌的液体培养装置示意图
图2为正十六烷对甲烷氧化菌K力j^o^V7〃s. fric力o砂on'鹏R (CGMCC NO. 1894) 生长速度影响的比较实验中lmL培养菌液中菌体湿重的测定结果
图3为正十六烷对甲垸氧化菌#ez^^o '"〃s. tn'c力o印ori柳R (CGMCC NO. 1894) 生长速度影响的比较实验中lmL培养菌液中的菌体重悬后的OD,值测定结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度如无特别说
明均为质量/体积(w/v)百分比浓度或体积/体积(v/v)百分比浓度，所有培养基中
的溶剂均为去离子水。
NMS(Higgens nitrate minimal salt)液体培养基配方每升培养基中含有NaN03 0. 85克，KH2P04 0. 53克，Na異2. 17克，K2S04 0. 17克，MgS04 *7H20 0. 037克，CaCl2 '2H20 0.007克，微量元素贮存液2毫升，lmmol/L H2S04 0 . 5毫升，FeS04 7H20 11.2毫克， CuS04*5H20 2.5毫克(固体培养基再添加1.5%的琼脂)，pH 7.0。
微量元素贮存液的配方为每升溶液中含有ZnS04 7H20 0. 2042克，MnS04 4H20 0. 223克，H肌O. 062克，Na2Mo04 2H20 0 , 048克，CoCl2 6H20 0 . 048克，KI 0. 083克。 LB液体培养基配方每升溶液中含有酵母粉5克，胰蛋白胨10克，氯化钠5克(固 体培养基还需添加l. 5%的琼脂)。
实施例1、本发明的甲垸氧化菌培养方法与甲烷氧化菌常规培养方法的比较 以甲烷氧化菌let力j^o^'/ws. fWc力o印oriw迈R (CGMCC NO. 1894，该菌已于2006 年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC， 地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号，保藏号为CGMCCNO. 1894)为例，比 较本发明培养方法与甲垸氧化菌常规培养方法的培养效果，具体过程如下
1、甲烷氧化菌ifez^^ow'加s. z^ 'c力05/ ariM R (CGMCC N0. 1894)的常规培养 用常规方法对甲烷氧化菌iJfe^^ow'/2^. trj'c力o印oriM7 R CGMCC N0. 1894进行
培养，具体方法包括以下步骤
1)在100mL带有挡板的密闭玻璃培养瓶(因需密封，在常规发酵培养瓶的瓶口
添加带进气口的盖，中科院微生物所制备)中分装30raL讓S液体培养基，121'C高压
灭菌15分钟，冷却；
2) 接入1. 2mL 0D,值为0. 312的甲烷氧化菌J/ef/y^osi; ^. m'c力o印arj'咖R CGMCC NO. 1894菌悬液，即接种量为4% (V/V)，加盖橡胶塞，密封；
3) 用已灭菌的医用注射器抽取瓶内空气30mL，然后用已灭菌的滤膜孔径为0.2 um的气体过滤器(Sartorius, Midisart 2000)向瓶中注入相同体积的甲烷，使瓶 中空气与甲烷的体积比约为1: 1，实验装置如图l所示；
4) 在3(TC、 170rpm下振荡培养，每24 h重新充入混合气体(空气甲垸=1:1， V/V)，并在相同条件下继续培养。
2、利用正十六垸对甲垸氧化菌#"力/"^'72^. tric/w印ori湖R (CGMCC NO. 1894) 进行培养
取100mL带有挡板的密闭玻璃培养瓶4个，分装30mL丽S液体培养基，再分别 添加0. 3raL、 0. 75mL、 1. 5mL和3. 。mL正十六烷(体积百分含量分别为1.0%、 2. 5%、 5.0%、 10%) ， 12rC高压灭菌15分钟，冷却，然后，用与上述步骤1中相同的培 养方法进行培养。同时，以用步骤l中未添加正十六烷的常规培养方法培养的甲垸氧 化菌为对照。培养4天后，实验组和对照组的水相菌液各取lmL，充分离心后，称取 湿重，菌体湿重的统计结果如图2所示，对照组的菌体湿重为2. 13g/L， 1.0%、 2.5 %、 5.0%和10%正十六烷添加组的菌体湿重分别为6. 31g/L、 8. 25g/L、 10. 73g/L和 12.07g/L。
为了排除正十六垸对光密度的影响，上述不同实验组的菌液各取lmL，离心，弃 上清，用lmL去离子水重悬后测600nm处的光密度值，OD,值测定结果如图3所示， 对照组的OD,值为0. 314， 1.0%、 2.5%、 5.0%和10%正十六烷添加组的OD,值分 别为0.928、 1.213、 1. 578和1.776。由上述实验结果可以看出，实验组的菌体湿重 和OD,值均显著高于对照组的，表明本发明的培养方法可显著提高甲烷氧化菌的牛长 速率，从而可实现甲烷氧化菌的快速、高密度培养。
实施例2、甲垸氧化菌的培养
用本发明的方法对甲垸氧化菌ifet力^c^r'77M frj'c力as/ c^j'湖OB3b(ATCC 55314) 进行培养，具体方法如下
1)正十六烷的甲烷溶剂饱和处理
在100mL带有挡板的密闭玻璃培养瓶中装入20mL正十六烷，12rC高压灭菌15分钟 后，用已灭菌的滤膜孔径为O. 2 p m的气体过滤器向瓶中注入40mL甲垸，在3(TC、 150卬m 下振荡12小时(每3小时通过0.2iim的气体过滤器补充甲垸)，得到经甲烷饱和的正十
2)利用经甲垸饱和的正十六垸对甲烷氧化菌进行培养
在lOOmL带有挡板的密闭玻璃培养瓶中分装30mL丽S液体培养基，再加入3mL 经甲垸饱和的正十六垸，12rC高压灭菌15分钟，冷却，再用与实施例l中甲垸氧化 菌常规培养方法中相同的培养条件进行培养。同时，以用实施例1中常规培养方法培 养的甲烷氧化菌为对照。培养结束后，用与实施例l中相同的方法测定实验组和对照 组的菌体湿重和OD,值，结果实验组的菌体湿重和OD,值均显著高于对照组的，表明 本发明的培养方法可显著提高甲垸氧化菌的生长速率，从而可实现甲烷氧化菌的快 速、高密度培养。
权利要求
1、一种甲烷氧化菌的培养方法，是在常规培养甲烷氧化菌的液体培养基中添加正十六烷。
2、 根据权利要求l所述的培养方法，其特征在于所述正十六烷在液体培养基 中的体积百分含量为0. 1-20%。
3、 根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于所述正十六烷为经甲烷饱和的或添加培养基后通入甲烷和氧气进行培养。
4、 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述经甲垸饱和的正十六垸是将正十六烷置于充满甲烷的密闭器皿中进行振荡得到的。
5、 根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于在培养过程中，向所述液体培养基中通入甲烷和氧气，气体通入量为10-20mL/升培养基，其中，甲烷和氧气 的体积比范围为1:0. 5-1.5。
6、 用权利要求l-5任一项所述方法培养得到的甲烷氧化菌。
7、 权利要求6所述的甲垸氧化菌在进行生物催化、瓦斯气体治理、垃圾填埋场甲 烷气的降解和/或生物修复中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种甲烷氧化菌的培养方法。该方法是在甲烷氧化混合菌常规培养方法的基础上，在培养基中添加正十六烷。在用本发明的方法对甲烷氧化菌进行振荡培养的过程中，正十六烷受到机械力的剪切作用形成微小的分散液滴，这些液滴可以提高甲烷的溶解度，而且由于其与菌体细胞的亲和性，细胞可以在水相和有机相之间穿梭，强化了微生物利用甲烷的速度。与常规培养方法相比，本发明方法可以极大程度的提高甲烷氧化菌的生长速度和细胞密度，且培养方法简单，具有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌的培养及其工业应用中发挥巨大作用，应用前景广阔。
文档编号B01D53/84GK101096652SQ20071010015
公开日2008年1月2日 申请日期2007年6月5日 优先权日2007年6月5日
发明者昊 吴, 皓 江, 缑仲轩, 邢新会, 冰 韩 申请人:清华大学