用于提高分子或分子部分之间的反应效率，特别是结合效率的装置的制作方法

专利名称：用于提高分子或分子部分之间的反应效率，特别是结合效率的装置的制作方法
用于提高分子或分子部分之间的反应效率，特别是结合效率的装置
本发明致力于有针对性地提高能够相互结合的反应物之间的碰撞或碰撞概率，从而一方面提供结合产物的数量，另一方面大大缩短了反应时间。
本发明特别是旨在生物分析阵列中，比如在DNA/RNA、蛋白质或免疫微阵列中所需的混杂时间，同时由此能够实现可分析利用的荧光信号的增强。这将通过借助磁性微米或纳米微粒来搅动混杂溶液来实现，这些微粒以受控的方式运动穿过混杂溶液并将靶分子输送至各个点(Spots),即结合位置。因此，明显增加或扩大了各个点的作用范围，该作用范围在传统分析方法中受到扩散限制。
本发明具有其他优点，即它可以以简单的方式与已经存在的生物分析阵列系统相结合，它因此使得对已经存在的反应系统，特别是已经存在的生物分析系统的改型成为可能。
作为分子生物学的新工具，例如DNA微阵列在基因和基因缺陷的证实、基因表达分析及加深对基因功能的理解方面是真正的技术飞跃。
微生物阵列或生物芯片通常由一个用特殊的方法经过化学涂层的玻璃载物体，该载物体包含多至几千个^f敬小的具有不同功能的点，即所谓的点。在DNA微阵列或DNA芯片的情况下，这些点中的每一个都是由数目很多的唯一确定的DNA片段或基因的拷贝组成，这些拷贝用作"捕捉分子"或探针，它们用于相应的存在于待分析的试样中特定的DNA或mRNA分子，也就是靶。这些靶分子事先用荧光微粒标记，以便能够在成功地结合在相应的芯片探针上之后借助荧光扫描仪对它们进行检测。
特异性和灵敏度这两个因素在生物或微阵列分析中发挥着很大的
作用。特异性主要取决于芯片上的DNA探针的选取或序列次序以及进行耙和探针之间的对接过程或混杂的条件，即例如混杂緩冲剂的盐浓度和反应温度；而灵敏度主要取决于相应的靶的存在量、靶的荧光标记效率，在一定程度上也取决于DNA探针在芯片中的存在量，以及取决于耙和探针之间的结合效率。在传统的芯片试验中，在含水的环境中靶到探针的输送仅仅是通过 扩散来控制。实际上，包含荧光标记的靶分子的含水緩冲溶液被涂敷到
带有DNA探针的芯片上，然后在其上放置一个薄的玻片或盖玻片。这 样，在芯片和盖玻片之间形成流体薄膜，靶分子在该薄膜内通过自由扩 散而运动。
迄今为止，已经采用不同混合或泵送装置进行了不同尝试来提高在 可分析利用的信号，这些装置可划分为下面三组
-通过在一个为此设计的装置上振动和/或旋转芯片的机械混合； -借助一个外部流体系统在芯片上泵送和再循环混杂溶液； -流体在芯片本身上的混合。
下面描述提到的按照现有技术的方法的例子，以能够突出本发明的 区别特征。
声表面波在 一 种已在市场可获得的产品中被应用于使流体薄膜的 混匀，该产品名称为Adavalytix AG公司(Eugen - Saenger - Strasse 53.0, D-85649 Brunnthal , www.advalytix.de ) 的 SlideBooster , 型号为 SlideBooster SB400。
在期刊Lab Chip,2002,2,151 - 157中由R.H. Liu等人所著的Bubble -induced acoustic micromixing中介绍了流体的一种有效混匀方法。为 了实现混合效果而使用通过小气泡诱导的微声流，这些微声流是借助压 电式声波发生器来产生。为了提高效率，在混合室中设置微小的通过机 械方法制成的凹窝，气泡在这些凹窝上形成。混合室的这种改动是在生 物芯片的制造中的可观的额外耗费，且在重复使用性方面由于污染原因
是成问题的u
此外，文献WO 94/28396描述了一种生物传感器的混合装置，在该 装置中，借助搅拌器，通过来自外部的机械波在混合室内产生试样的均 质化。在这里，在测量信号的过程中由搅拌器进行与传感器的表面垂直 的相互运动。
另一篇专利文献，GB 876 070非常一般地描述了借助旋转的栅来使 流体混匀。
WO 00/09991A1描述了待检流体在传感装置中接近界面的混合。在 此，混匀是借助珠的运动或借助活动网来实现，其中，在第一种情况下， 珠在流体中在两个电》兹铁之间交替地被向上和向下拉动。EP 0 240 862 Al特别描述了包含活动的磁性微粒的悬浮液的流体 薄层的混匀装置。该装置同样包括磁系统。在那描述的布置提供了一条 用于容纳含有永久磁性微粒的流体薄膜的缝隙。
在另一个专利，即WO 97/02357 Al中考虑了一种应用于DNA芯片 的混合装置。在那里提到了通过电磁铁的交流电流产生的利用声波的混 合和利用》兹场的混合。
US 6， 806， 050 B2公开了一种电磁芯片或生物芯片，该芯片包括 —个由可单独馈电的微型电磁单元组成的矩阵，且在该芯片的表面上固 定有特殊分子。通过这些磁单元，被束绰在小的磁微粒上的分子基本上 在生物芯片的平面上运动，并以这种方式实现了化合物数量的增加。
按照本发明新开发的装置是基于这样的构思，即通过将磁性微米或 納米微粒混入混杂溶液中来扩大单个结合位置，也就是说例如DNA点 的作用范围，这些微粒借助外部产生的磁场而运动，同时例如DNA靶 能够明显有针对性地向各点的探针移近。DNA靶是由磁性微粒或借助磁 性微粒在微流中 一起被引导并以这种方式被输送u
本发明的主题是一种按照权利要求1前序部分所述的装置，其用于 提高两种能够相互结合的反应物，优选是分析仪分子或分子部分与分析 物分子或分子部分之间的接触频率或次数，特别是用于在生物分析阵列 中提高结合效率并缩短证实所需的结合时间，该装置具有在该权利要求 的特征部分中所提到的特征。
特别是微米级或毫米级的电磁线圈的矩阵状的布置与仅一个对置 的中央电磁线圉的结合使得磁性微粒可以在反应流体内，特别是混杂流 体薄膜内有针对性的精确运动，并因此，具体地说，可以使靶DNA受 控地移向固定在DNA生物芯片上的探针。
微米级或毫米级线圈的特殊布置和磁化电流供给"图案"防止了磁 性微粒积聚，因此与迄今为止已知的上面提到的基于磁性微粒运动的混 合装置相比是一个重要的优势。此外，使用磁场实现了与湿度和温度受 到控制的试样室的简单结合，从而实现了高的系统集成度。
带有或没有磁芯的毫米级电磁线團例如在DNA芯片和在DNA芯片 上方的仅一个电磁线圈下方呈矩阵状或阵列状布置，这样的布置方式使 得磁性微粒完全有针对性的运动成为可能。
因此，在芯片上方的单独电石兹线圈用于4吏石兹性^f鼓粒向上运动。当该线圈通过切断电流而不再具有,兹性时，f兹性纟敬粒重新下降。在与上升相
同的轨迹中下降是通过如下方式进行阻止位于芯片下方的微型磁体矩 阵的微型电磁线圏呈波浪状地被磁化，磁性微粒因此在它们下降期间向 旁边移动，由此最后在反应流体中感应出一种斜流，通过该斜流，耙分 子被移动得更多，并因此被更多地供给至探针分子。
因此，借助按照本发明设计的结构，微粒分别沿横向朝着相应接通 的微型磁体矩阵中心的方向被移动。通过改变各相邻的微型电磁线圈和 布置在芯片上方的电磁线图的脉冲的持续时间和相对强度，可以随意地 规划灵活的运动图案，以便实现在混杂流体薄膜中溶解的靶分子的有针 对性的横向和竖直输送。
与在开头提到的按照现有技术的装置(其致力于不定向或者最多在 一个方向上进行的流体薄膜混匀)相反，按照本发明设计的装置允许所 使用的微磁性微粒事先规划地、完全有针对性地运动。与提到的专利公 开文献相反，借助本发明的装置可以防止特别是磁性微粒结块和积聚。
此外，本发明提供这样的优点，即它能够毫无问题地已经建立的、 存在的生物分析阵列相结合，以及将电磁线圈集成到相应的载体上时可 以精确地调节在与生物芯片的界面上的温度，这是通过一个此后还要阐 述的集成的冷却/加热循环来实现。
按照本发明的装置因此而不同于特别是这样一种装置，该装置仅仅 是针对在一个集成的微流控生物芯片中的可能的方法步骤，且不适合于 已经存在的DNA微阵列的改造。
为了证明本发明的装置的工作原理，针对同种DNA生物芯片，在 通过本发明的装置的支持下和与之并行地以传统的方式分别进行了混 杂试验。在这里，确保了在每个试验中的温度状况(65°C)、混杂时间 (25分钟)及评价方法都不变；结果表明，在全部试验中，在使用本发
明的装置的情况下得到了 一个与在传统混杂情况下的相应结果相比大 约为150%的平均信号增益，信号增益- ((装置信号-参考信号)/ 参考信号x100)。
根据本发明的一种有利的实施形式，设有一个按照权利要求2所述 的一方面用于微型电磁线圈而另一方面用于单独电磁线圈的触发装置， 借助该触发装置，每个单个微型电磁线圏是可单独触发的，且每个与时 间相关的磁化图案是可打印在磁体矩阵面上的。特别是为了无干扰的光学检查，按照权利要求3，本发明的装置的 单独电磁线圈的一种无磁芯从而具有敞开的中央孔的实施形式是有利 的，因此可以自由地观察反应事件，特别是观察生物分析芯片或阵列
权利要求4的特征是用于提高微型电磁线圈在电磁线圈矩阵中的布 置效率。
此外，特別是考虑到需要准确保持的稳定的环境条件，按照权利要 求5所述的分析装置布置在一种空调室内是优选的。
权利要求6涉及一种本发明的装置的部件的具体布置。
最后，权利要求7的内容是一种装置的优选变形实施形式，其带有 用于反应容器，特别是用于生物分析阵列-微芯片的容纳腔室。
借助附图对本发明进行详细说明


图1是示出了本发明的装置的主要部件的原理布置图，图2示意地 示出了在载物体上的磁化期间的过程，图3示意地示出了新装置的控制 装置，图4示出了新装置的一个实际的实施形式的例子，图5示意地示 出了磁性微粒在试样流体内经过的路线图；图6a比较地示出了一个在 使用新装置时信号增益的图，而图6b示出了一个表示同样与现有技术 相比、依赖于混杂时间的信号增益。
图1的斜投影视图示出了本发明的装置1的原理结构，该装置用于 磁感应地加强两种反应物，特别是结合物，例如靶分子和探针分子之间 的接触。
在由玻璃制成的载物体4上，在盖玻片5的下方设置生物分析阵列 6或生物芯片6，该生物分析阵列带有均匀涂敷的含有探针分子的细小 点。含有靶分子和为搅拌流体而设计的微型磁性微粒的反应流体，特别 是混杂流体位于载物体4和盖玻片5之间。
在图1中，在该装置的上方设有在这里为扁环状或环形的无磁芯从 而具有敞开的中央孔的单独电磁线圈3,由于该孔，使得对在载物体4 上或在盖玻片5下方的反应的观察畅通无阻。
在生物芯片6及其附近区域的下方，在载物体4的下方，优选是在 一个六角形矩阵20中布置大量的可单独供给磁化电流的微型电磁线圏 2,这些电磁线圈带有线圈铁芯21 。
图2的示意图示出了在附图标记含义保持不变的情况下，反应流 体70是如何位于带有含有生物芯片6的探针分子63的点的载物体4之间，以及在其中，由前面提到的电磁铁2或20, 3及其它们可变的磁场
加载，在这里用圓形画出的磁性微粒75是如何大致地朝着用箭头表示 的运动方向运动，加载有用小星星表示的荧光材料72的耙分子73是如 何与固定的探针分子63接触并在那里比例如能够通过扩散达到的明显 更加频繁地结合。
在附图标记含义保持不变的情况下，在图3中非常概要地示出的控 制装置8用于单独地向微型磁体矩阵20的微型电磁线圈2提供可变的 磁化电流，以及用于同样可变地向单独电f兹线圏3供电。
中央控制单元(PC-控制器)81与一个例如为D/A卡82的控制单 元连接，该D/A卡一方面与微型电磁线圈矩阵20的供电单元(电源1 ) 83连接，而另一方面与单独电磁线圏3的供电单元(电源2 ) 84连接。
供电单元(电源1 ) 83与一个本身直接与D/A卡82连接的继电器 矩阵单元85连接，从该继电器矩阵单元开始，磁体矩阵20的与其连接 的每个单个微型电磁线圏2随时间变化可变的单独供电是按照一个由中 央控制单元81提供的程序来实现。
此外，还设计了对试样温度的控制。该控制是借助一个直接与中央 控制单元81连接的温度控制单元(温度控制器)86来实现，该温度控
器设置在试样区域内或设置在磁^:, ;。2 3的附近。 ^ 在附图标记含义保持不变的情况下，图4分别以在侧剖视图和俯剖
视图中示出了部件在新的改进分析装置1中的实际配置。在这里示出了
一个遮盖组件II和一个基块组件I ,在它们之间布置在此没有示出的带
有需要进行的反应的载物体。
如图4a可见，基块组件包括一个被冷却/加热介质通道22， 22'穿过
的铝块21,在该铝块中在中心处设置带有微型电磁线圈2的电磁线图矩
阵20。在该矩阵20下方设置另一个同样被冷却/加热介质通道225穿过
的小的铝块25。
图4b说明了冷却/加热介质通道22, 22，在平面图中的走向，在图 4b中用箭头表示流入和流出。由于在块21中制作通道而引起的孔用塞 子封闭。
铝块21向上用薄膜23遮盖，在边缘側环绕的橡胶环26, 27位于 该薄膜上，在橡胶环内有一个用于放置试样的空间230。在图4c中示出的遮盖组件II包括一个向上受限制的铝块31 (在这 里包括一个在中心处具有孔34的不锈钢遮盖面35),该铝块同样被冷 却/加热介质通道32穿过，且在该铝块中安置环形的单独电磁线圈3。
铝块31净皮一个中心孔34，穿过，通过该孔可自由地，见察试样，且该 铝块31向上用一个玻璃片33封闭。
温度控制是借助热敏元件300来实现，这些热敏元件将实际温度数 据递送至已在上面提到的温度控制单元。
图4d以俯视图使得总览冷却/加热介质通道32在遮盖单元的铝块 31中的走向成为可 食巨。
在附图标记含义保持不变的情况下，图5示意地示出了微型磁性微 粒75在位于栽物体4或生物芯片6与盖玻片5之间的流体薄膜70中的 路线或运动走向。在激活上方的单独电磁线圈3时，单个磁性微粒75 沿着轨迹A大致垂直向上地被拉动，通过一个稍微位于上升轨迹A之外 的现在被磁化的微型电磁线圈2的磁场，通过切断单独电磁线圈3 实现的下降时，该磁性微粒75被偏转向側旁，然后大致遵循轨迹B，等 等。
图6a和6b示出了利用本发明的装置所达到的作为混杂之后磁性微 粒的浓度的函数的信号增益
图6a的纵坐标表示荧光信号的强度，而横坐标表示磁性微粒 M-PVA 13珠(5 - 8pm ) ( Chemagen AG, Aronold-Sommerfeld-Ring 2 ， D-52499 Baesweiler)的浓度(单位:赫1)。
用方形符号表示的信号值是利用所描述的装置而得到的，用叉形符 号表示的信号值是以传统方式得到的。其示出了高的平均信号增益。此 外，图6a在左栏下方示出了 DNA探针屎肠球菌(Ec. Faecium) 2的参 考信号作为小叉。相应的平均值记录在右栏中作为小红叉。在中间栏中 表示的是在使用新装置的情况下，在四种不同的珠浓度下的探针屎肠球 菌2的信号。每一个在这里所示的数据点(小方形)对应于一个试验， 在这里可通过在每个试验中分别评价探针屎肠球菌2的6个重复来得到 误差柱图。混杂时间在相应的试验中为25分钟。
结果表明，在全部试验中，对于这种探针，在使用新装置的情况下 得到了一个与按传统方式实施的混杂相比大约为150%的平均信号增 益。该计算是通过在不同的珠浓度下DNA探针屎肠球菌2的信号算
10术平均值来进行的。
在附图标记含义保持不变的情况下，图6b同样对照地示出了作为 混杂时间的函数的在使用本发明的装置而得到的荧光信号的强度I和以 迄今为止已知的方式获得的信号强度。
在这里，横坐标表示混杂时间(单位分钟)，且微型磁性微粒或 者珠，M-PVA13珠(5-8,)的浓度以1.8吗/Vl保持恒定。
在使用本发明的装置的情况下，在五分钟之后就已显示出非常大的 信号增益。
(1) Advaltix AG, Eugen-Saenger-St聽e 53.0, D國85649 B醒thal, www.advalytix.de, SlideBooster SB400
(2 )R. H. Liu等,Bubble — induced acoustic micromixing， Lab Chip, 2002, 2, 151-157
(3 ) WO 94/28396
(4 ) GB 876, 070 A
(5) WO 00/09991 Al
(6) EP 0 240 862 Al
(7) WO 97/02357 Al
(8 ) US 6, 806, 050 B权利要求
1.一种装置，其用于提高两种能够相互结合的反应物之间，优选是分析仪分子或分子部分与分析物分子或分子部分之间的接触频率或次数，特别是用于在例如为DNA/RNA，蛋白质或免疫微阵列的生物分析阵列中提高结合效率并缩短证实所需的结合时间，该装置具有借助由外部产生的磁场无接触地在流体反应介质中，特别是在包围生物分子阵列的流体中有针对性地被置于运动中的微米或纳米微粒(75)，所述磁场是通过设置在反应体积或反应流体薄膜两侧的能够被提供可变电流的电磁铁(3，2，20)实现，所述微米或纳米微粒是顺磁性、超顺磁性或铁磁性的，是球形或不规则形状，及必要时涂敷有反应物之一，其特征在于，在反应容器或者反应流体薄膜，特别是带有遮盖反应物(73)和反应流体(70)及优选遮盖微型生物分析阵列(6)的透明的盖玻片(5)的载物体(4)的一侧，在紧邻处设置二维的包括多个微型或毫米级电磁线圈(2)的扁平矩阵(20)或阵列，这些电磁线圈分别根据期望的可随时间变化而改变的磁化图案或场强图案，单独地被提供强度被预给定并随时间改变的磁化电流和/或电压，这些电磁线圈必要时带有或没有用于增强磁场的芯(21)；在反应容器的，特别是带有微型生物分析阵列(6)的载物体(4)的另一侧，在其紧邻处只设置一个同样被提供可变磁化电流的电磁线圈(3)，该电磁线圈的磁场穿过整个反应容器或其主要部分，特别是整个(微型)生物分析阵列(6)。
2. 如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述装置具有带有中 央控制单元(81)的电磁铁触发装置(8)，借助该触发装置，能够分 别单独且与其他微型电磁线圈相独立地向单独电磁线圈(3)和电磁线 圈矩阵的或电磁线圈阵列(20)的每个微型电磁线圈(2)提供特别是 在电流类型方面例如为DC或AC的，具有任意的频率、波形、振幅和/ 或相移的可变的^f兹化电流，从而根据分别选取的程序在位置上、在所有 三个空间方向上不同地能够感应出磁性;微粒(75)在反应流体薄膜的反 应流体中或在包围(微型)生物分析阵列或生物芯片(6)的流体中的位 置可变的运动，该运动分别具有期望的运动方向、运动l九迹和运动速度。
3. 如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述单独电磁线 圈(3)被设计成环形且没有磁芯，以使得对反应容器，特别是(微型)生物分析阵列或微型生物芯片(6)的观察畅通无阻。
4. 如权利要求1至3中任一项所迷的装置，其特征在于，所述微 型电磁线圈矩阵(20)的微型电磁线圈(2)被设计成相互之间具有尽 可能小的间隙且分别具有圆形、方形或六边形的橫截面，且这些微型电 磁线圈被布置在一个方形矩阵或蜂窝状的六角形矩阵(20)中。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的装置，其特征在于，所述装 置全部布置在腔室内，在该腔室内，包围反应物容器，特别是(微型) 生物分析阵列(6)的气体的湿度，以及优选该气体的温度可控制和可 调节的，在必要时，压力也是可控制和可调节的。
6. 如权利要求至5中任一项所述的装置，其特征在于，-所述单独电磁线图(3)布置在由导热良好的材料，特别是铝制成 的块(31)中，在该块中设有冷却或加热流体能够流过的流体介质通道 (32, 32，)，其中一通道在该单独电磁线圈(3)的临近反应容器，特 别是(微型)生物分析阵列(6)的表面的近区内，在外边围绕着该单 独电磁线圈(3)，而另一通道优选是分开地布置在该单独电磁线圈(3) 上方且位于其内边缘的近区内，-在必要时，微型电磁线圏矩阵(20)也布置在铝块或铝台(21) 中，且在侧旁的周围被冷却或加热流体能够流过的流体介质通道(22， 22，)包围，以及-在必要时，附加地在微型电磁线圈矩阵(20)的下方，在一个分 开的金属块(25)中设置冷却通道系统(225 )。
7. 如权利要求6所迷的装置，其特征在于，-带有单独电磁线圈(3 )的所迷金属块，特别是铝块(31 )朝着反 应容器，特别是朝着生物分析阵列(6)或微型生物芯片的方向用玻片 (33)封闭，-必要时，带有微型电磁线圈矩阵(20)的所述金属块，特别是铝 块(21)是用铝质盖膜或塑料盖膜(23)封闭。-必要时，两个金属块，特别是铝块(21, 31)借助于至少一个位 于上述的玻片(23)和盖膜(23)之间的靠近边缘设置的封闭的橡胶环 形元件(26, 27)相互之间隔开，并形成与环境及其影响隔绝的试样腔 室(230)。
全文摘要
本发明涉及一种装置，其用于提高两种能够结合的反应物，优选是分析仪分子和分析物分子之间的接触频率，特别是用于提高在借助微米或纳米微粒(75)的生物分析阵列中的结合效率，这些微粒通过设在反应流体薄膜两侧的能够可变地馈电的电磁铁(3，2，20)产生的磁场而在反应介质中有针对性地被置于运动中。该装置的特征在于，在反应流体薄膜，特别是带有反应物(63)、带有包含反应物(73)的反应流体(70)及优选带有一个遮盖微型生物分析阵列的盖玻片(5)的载物体(4)的一侧，在附近设置一个二维的包括数个微米级或毫米级电磁线圈(2)的矩阵(20)，这些电磁线圈分别根据一个期望的随时间变化而改变的磁化图案，单独地被提供强度随时间改变的磁化电流和/或电压；在反应容器，特别是带有(微型)生物分析阵列(6)的载物体(4)的另一侧，在其附近只设置一个同样被提供可变磁化电流的电磁线圈(3)，该电磁线圈的磁场穿过整个反应容器，特别是微型生物分析阵列(6)。
文档编号B01F13/08GK101541410SQ200780013319
公开日2009年9月23日 申请日期2007年4月11日 优先权日2006年4月13日
发明者C·诺哈默, J·肖特, M·埃格林, M·曼斯费尔德, R·希尔, R·皮克勒 申请人:奥地利研究中心有限责任公司;特克内特资产技术管理有限责任公司