专利名称：：红花桑寄生多糖的提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物多糖的提取方法，具体地说，涉及一种红花桑寄生(ScuirulaparasiticaL.)多糖的提取方法。
背景技术：
：红花桑寄生5"cMmz/"parawWcaL.是桑寄生科桑寄生亚科梨果寄生属半寄生性植物，为我国特有的植物，主要分布于我国广东、广西、云南及福建等南方地区。传统上红花桑寄生常作为桑寄生Ku/〃wc/z/we"w、(DC.)Danser的代用品入药，具补肝肾、祛风湿、降血压、安血养胎等功效，主治风湿、关节痛、高血压、坐骨神经痛、腰痛、产后乳少等症。桑寄生科植物一般含大量的黄酮类成分，我们在前期的研究中发现红花桑寄生总黄酮提取物对急性髓系白血病有较好的抑瘤效果，并可增敏临床重要抗肿瘤化疗药物多柔比星的疗效，机制研究表明其可能是一种良好的NF-kB抑制剂。然而，尚未见对红花桑寄生多糖及其功用的研究。植物多糖具有多方面的生物活性，能够调节机体免疫机能，具有抗病毒、抗菌、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功能，因而越来越受重视。近年来，大量的研究表明，中药多糖具有抗肿瘤作用，且毒副作用小，因而越来越成为抗肿瘤研究的热点。香菇多糖、当归多糖、猪茶多糖、云芝多糖等一批质量稳定、疗效确切、毒性和不良反应小的多糖类药物已作为抗肿瘤药物广泛用于临床。红花桑寄生的同科植物槲寄生在国外是一种研究较多的具有抗肿瘤作用的植物，在欧洲，自1920年就对槲寄生的抗肿瘤作用开始研究，其提取物具有多种抗癌效果，对乳腺癌、胃癌与结肠癌等常见肿瘤有一定治疗作用。英国和澳人利亚已分别开发出商品名为Iscador和Isord的槲寄生标准植物提取物用于癌症的临床治疗。已有的研究表明槲寄生提取物中的有效抗肿瘤成分可能主要是多糖、凝集素、毒肽、生物碱以及多酚类物质。棺物多糖的提取过程大多采用传统的先沉淀再去蛋白的方法。我们在研究中发现采用传统的方法来提取红花桑寄生多糖，需多次使用沉淀剂从溶液中沉淀多糖，耗费大暈的溶剂，且得率低，提取出的多醣类物质水溶性很差，不利于应用。本发明采用先去蛋白再沉淀多糖的提取方法，则只需使用一次沉淀剂来沉淀多糖，节省了大量溶剂；得率高，同时提高了多糖的水溶性，便于药物研究和实际应用。
发明内容本发明的目的在于提供一种先去蛋白再沉淀多糖的红花桑寄生多糖的提取方法。为实现本发明的目的采用的技术方案是将红花桑寄生枝叶粉碎后，用乙醇回流提取，过滤取滤渣，滤渣用热水浸提，经沉淀、干燥后得到红花桑寄生多糖提取物，其特征是经热水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法或酶法，或者是他们之间的任意两种方法，或者是三种方法联用去除蛋白，再使用透析袋进行透析除去小分子成分。采用本发明所述的红花桑寄生多糖提取方法，只需使用一次沉淀剂来沉淀多糖，节省了大量溶剂；提高了多糖的得率，同时提高了多糖的水溶性，便于药物研究和实际应用。所得到红花桑寄生多糖提取物，对小鼠肉瘤S180有较好的抑制效果，并与临床重要抗肿瘤化疗药物有显著的协同效果；该提取物也可显著延长荷肝癌腹水瘤H22小鼠的寿命。研究表明该提取物的抑瘤效果并没有剂量依赖性，而是有一最佳剂量，过高或过低的剂量均使得抑瘤效果下降。具体的提取方法包括以下步骤(1)采集红花桑寄生嫩枝和叶，水洗、晾干、6(TC烘干，粉碎机成粉末；(2)取粉末，加入乙醇回流提取，以去除其中的脂溶性成分，过滤取滤渣，挥干溶剂；(3)取挥干溶剂后的滤渣，进行热水浸泡提取，滤渣水二i:515，热水温度为8095'C浸泡提取，2小时后离心或抽滤去渣；取上清液，并于6(TC下减压浓縮处理；(4)重复步骤(3)三遍；合并3次上清液。(5)采用sevage法、TCA法、酶法或者这几种方法联用，重复三次，将上清液中的蛋白去除；(6)去蛋白后的上清液装入透析袋进行透析，流水透析2天，蒸馏水透析l天，去除小分子成分，得到多糖溶液；(7)在多糖溶液中加入沉淀剂，在低温下沉淀多糖，使沉淀剂在溶液中的浓度为65%85%(v/v)，离心收集沉淀，该沉淀物经醇类、酮类和乙醚依次洗涤后冷冻干燥即得本发明所说的红花桑寄生多糖。本发明所述的透析袋进行透析时，流水透析2天，蒸馏水透析l天；所说的透析袋的透析分子量为700014000D。本发明所述的沉淀剂，是指含有14个碳链的醇类溶剂，最优选的是乙醇。本发明所述的洗涤步骤中采用的洗涤剂依次为无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤。具体实施方式以下实施例用于对本发明作进一步阐述，但并不因此而限制本发明的范围。实施例1:取粉碎好的药材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽滤取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1:10，95"C热水中提取，每次2h,共提取3次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液于6(TC下减压浓缩至约1000ml体积，加入1/3体积的sevage(氯仿正丁醇=4:1)，振荡20min后，8000rpm离心15min，去除蛋白沉淀，取上清重复多次直到无蛋白为止。将去蛋白后的溶液装入透析袋透析，流水透析2天，蒸馏水透析l天。减压浓縮至1/2体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置24h进行沉淀，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻真空干燥得红花桑寄生多糖提取物3.67g。实施例2:取粉碎好的药材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽滤取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1:10，95"C热水中提取，每次2h，提取3次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液加入0.5%木瓜蛋白酶(w/v)，4(TC酶解5h后，加热到10(TC10min灭酶活，于6(TC下减压浓縮至约1000ml体积，加入1/3体积的sevage(氯仿正丁醇=4:1)，振荡20min后，8000rpm离心15min，重复3次。将去蛋白后的溶液装入透析袋透析，流水透析2天，蒸馏水透析1天。浓缩至1/2体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置24h进行沉淀，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻真空T燥得红花桑寄生多糖提取物4.87g。实施例3:取粉碎好的药材粉末180g,加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽滤取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1:10，95"C热水中提取，每次2h，共提取3次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液于60'C下减压浓縮至约1000ml体积，加入等体积30%三氯乙酸，振荡20min后，4。C下静置2h，8000rpm离心15min，去除蛋白沉淀。将去蛋白后的溶液装入透析袋透析，流水透析2天，蒸馏水透析l天。浓縮至l/2体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置24h进行沉淀，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻真空干燥得红花桑寄生多糖提取物3.42g。实施例4:取粉碎好的药材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽滤取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1:10，95。C热水中提取，每次2h，提取3次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液加入0.2%木瓜蛋白酶(w/v)，6(TC酶解2h后，加热到IO(TC10min火酶活，于60。C下减压浓缩至约1000ml体积，加入等体积30%三氯乙酸，振荡20min后，4'C下静置2h，8000rpm离心15min，去除蛋白沉淀。将去蛋白后的溶液装入透析袋透析，流水透析2天，蒸馏水透析l天。浓縮至l/2体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置24h进行沉淀，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻真空干燥得红花桑寄生多糖提取物4.32g。实施例5:按实施例4所述方法提取的红花桑寄生多糖提取物(以下简称SPS)腹腔注射对小鼠肉瘤S180的抑制作用。昆明种小鼠50只(雌雄各半，体重18士2g，由福建医科大学实验动物中心提供),S180腹水瘤株由福建医科大学药学院提供。取腹腔内传代7d的S180肉瘤小鼠，脱臼处死，在无菌条件下抽取腹腔内瘤细胞，并以生理盐水洗涤3次，2500rpm离心3min,用灭菌生理盐水调整瘤细胞浓度为5X107ml，接种于小鼠右腋皮下，每只小鼠接种0.2ml。于接种24h后随机分组，每组10只，分成生理盐水组、环磷酰胺组(CTX，20mg/kgd)、SPS低剂量组(50mg/kg.d)、SPS中剂量组100mg/kg.d)、SPS高剂量组(150mg/kg.d)。以上各组均每天腹腔注射给药0.01ml/g，连续给药10天，末次给药24h后，脱臼处死荷瘤小鼠，取肿瘤组织、脾脏、胸腺，去血污称重，计算抑瘤率、脾指数(mg脾重/10g体重)和胸腺指数(mg胸腺重/10g体重)。结果见表l。抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重X10(F。表l红花桑寄生多糖对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(x士s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可看出，三种剂量的红花桑寄生多糖提取物对小鼠S180均有较好的抑瘤效果，与生理盐水组比较，差异显著，抑瘤效果以100mg/kg.d的剂量最好，过高剂量反而导致抑瘤效果下降，这与文献中报道的植物多糖的免疫调节作用大多有最适剂量相符。三个剂量的SPS组与生理盐水组相比均能增加小鼠脾重量，只有SPSIOOmg/kg.d组差异显著(尸〈0.001)，红花桑寄生多糖对胸腺重量的增加影响不大，而阳性对照药CTX极显著地降低了脾指数和胸腺指数。实施例6按实施例4所述方法提取的红花桑寄生多糖提取物对环磷酰胺(CTX)的增效作用。材料及接种方法同实施例5，于接种24h隨机分组给药，分成生理_盐水组、CTX低剂量组(10mg/kg.d)、CTX中剂量组(20mg/kg.d)、CTX高剂量组(30mg/kg.d)、SPS(100mg/kg.d)+CTX低剂量组(10mg/kgd)、SPS(100mg/kg.d)+CTX中剂量组(20mg/kgd)、SPS(100mg/kg.d)+CTX高剂量组(30mg/kg.d)，以上各组均每天ip给药0.01ml/g,连续给药10d，末次给药后24h脱臼处死荷瘤小鼠，取瘤称质量，计算抑瘤率。比较单纯用CTX治疗组与加用多糖组间抑瘤率的差异，结果见表2。表2红花桑寄生多糖对CTX的增效作用(义士s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与生理盐水组比较*尸<0.001;与CTX比较at°<0.05;^尸<0.01由表2可看出，红花桑寄生多糖提取物显著地增强了环磷酰胺的抑瘤效果。实施例7按实施例2所述方法提取的红花桑寄生多糖提取物显著延长了荷H22肝癌腹水瘤小鼠的寿命。材料及来源同实施例5。无菌条件下抽取小鼠腹腔内传代7d的H22腹水细胞，计数后用生理盐水稀释，每只小鼠腹腔接种5X106个细胞，次曰开始尾静脉注射给药，连续7天。停止给药后计算小鼠生存天数。阴性对照药为生理盐水，阳性对照药为环磷酰胺，SPS分为高、中、低三个剂量组，结果见表3。生命延长率的计算公式为生命延长率=(给药组平均存活天数—对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数X1000/0表3红花桑寄生多糖对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(x土an=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与对照组比较*尸〈0.01从表3可看出，红花桑寄生多糖提取物显著地延长了荷瘤小鼠的生命，与对肉瘤S180的抑制结果相似，中剂量组100mg/kg.d这一剂量对荷H22肝癌腹水瘤的小鼠延寿效果最好，表明红花桑寄生多糖提取物的抗肿瘤效果有一最佳剂量，而不呈线性的量效关系。这一点与香菇多糖的抗肿瘤效应相似，表明红花桑寄生多糖提取物可能与香菇多糖有相似的抗肿瘤作用机制。权利要求1、红花桑寄生多糖的提取方法，是红花桑寄生枝叶经粉碎后，用乙醇回流萃取，过滤去处脂溶性成分，滤渣经热水浸提法，经沉淀、干燥后得到红花桑寄生多糖提取物，其特征是经热水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法、酶法或者这三种方法联用去除蛋白，再利用透析袋进行透析。2、根据权利要求1所述的红花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的透析袋进行透析时，流水透析2天，蒸馏水透析1天；所说的透析袋的透析分子量为700014000D。3、根据权利要求1所述的红花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的沉淀剂，是指含有14个碳链的醇类溶剂，最优选的是乙醇。4、根据权利要求1所述的红花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的洗涤歩骤中采用的洗涤剂依次为无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤。全文摘要本发明涉及一种植物多糖的提取方法，具体地说，涉及一种红花桑寄生多糖的提取方法。为实现本发明目的采用的技术方案是将红花桑寄生枝叶粉碎后，用乙醇提取后过滤取滤渣，滤渣用热水浸提，经去蛋白和小分子成分后得到红花桑寄生多糖，其特征是经热水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法、酶法或者这三种方法联用去除蛋白，再透析去除小分子成分。采用本发明所述的多糖提取方法，只需使用一次沉淀剂来沉淀多糖，节省了大量溶剂；同时提高了多糖的得率和水溶性。所得到红花桑寄生多糖提取物，对小鼠肉瘤S180有较好的抑制效果，并可显著延长荷肝癌腹水瘤H22小鼠的寿命，其抑瘤效果没有剂量依赖性。文档编号B01D61/00GK101250233SQ20081007081公开日2008年8月27日申请日期2008年3月27日优先权日2008年3月27日发明者肖义军,范延丽,陈元仲申请人:福建师范大学