专利名称：用于检测分子相互作用的装置和方法
技术领域：
本发明涉及用于检测靶和探针分子之间的特异性相互作用的装置和方法。
背景技术：
生物医学测试通常是基于对以已知量和位置存在的分子(分子探针)和被检测的 未知分子(分子靶分子)之间的相互作用的检测。在现代的测试中，探针是以支持物上的 物质文库、即所谓的微阵列或芯片的形式排布，以便可以以平行的方式同时用各种不同的 探针对样品进行分析(参见例如J. Lockhart，E. A. Winzeler，基因组学、基因表达和DNA阵 列；Nature 2000，405，827-836)。这里所说的探针通常固定化在适合的基体上，例如在WO 00/12575中描述的那样(参见例如US 5，412，087和WO 98/36827)，或者以预定的方式合 成生产(参见例如US 5，143，854)用于微阵列的制备。基团标记的DNA或RNA分子形式的靶分子与微阵列的核酸探针之间那样的结合， 其先决条件是靶分子和探针分子都以单链核酸的形式存在。有效的、特异性的杂交只可 能发生在这样的分子之间。单链核酸靶分子和核酸探针分子一般可以通过热变性，并优 化选择参数例如温度、离子强度和螺旋去稳定化分子的浓度的方式获得。因此，确信的是 只有事实上完全互补即彼此对应的序列的探针才能保持与靶序列的配对(A.A.Leitch， Τ. Schwarzacher, D. Jackson, I. J.Leitch,1994, In vitro Hybridisierung，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg/Berlin/Oxford) 0在生物学测试方法中使用微阵列的一个典型例子是在生物医学诊断中检测样品 中的微生物。在此是利用了这样一个事实，即核糖体RNA(rRNA)的基因是广泛分布的，并 具有对相应的种来说是特征性的序列部分。这些种特征性的序列被施加在单链DNA寡核苷 酸形式的微阵列上。首先从被检测的样品中分离出被检测的靶分子，并用标记物例如荧光 标记物标记。然后将标记的靶DNA分子与固定在微阵列上的探针在溶液中保温，通过相应 的清洗步骤除去非特异性发生的相互作用，并利用荧光光学评估的方式检测特异性相互作 用。通过这种方式，可能通过一个单一测试在一个样品中同时检测例如几个微生物。在这 种测试方法中，可以检测到的微生物的数量理论上只依赖于已经施加在微阵列上的特异性 探针的数量。在分别在固相表面上的微阵列和探针阵列的帮助下检测分子相互作用的各种方 法和技术体系已经被描述，其中有些是可以商购的。用于检测分子相互作用的经典系统是基于荧光团标记的光谱激发的靶分子的荧 光强度的比较。荧光是特定分子当受到特定波长的光激发时发射出它们自己的光的能力。 此时，相继发生了特征性的吸收和发射行为。在分析中，荧光信号增加的比率被假定为官能 化表面上标记的分子密度由于例如增加了靶和探针分子之间的分子相互作用的效率而增加。具体来说，荧光信号的定量检测是通过修改的荧光显微镜方法来进行的。在这种 情况下，通过滤光片或堇青石将具有吸收波长的光和具有发射波长的光分离开来，通过光 学元件例如物镜和透镜将测量到的信号成像在适当的检测器，例如二维CCD阵列上。一般 来说，分析是通过数字成像方法来进行的。目前为止，公知的技术解决方案根据它们所用的光学机构和元件而不同。问题和 限制因素可能来自于信号噪音(背景)，它基本上是由例如所用染料的去色和淬灭效应，介 质、装配元件和光学元件自身荧光，以及光学机构中的散射、反射和二级光源所决定的。这导致了对发展高灵敏度的、用于探针阵列的定性和定量比较的荧光检测器的极 大的技术努力。具体而言，对于中或高通量筛选来说，需要表现出某种程度自动化的特别适 合的检测系统。对于用于读出分子阵列的最适化标准^5Pifluorescence机构来说，已知的有基于 CXD的检测器，它在暗视野中通过入射光或透射光来执行荧光团的激发，以鉴别例如散射和 反射这样的光学效应(参见例如C. E. Hooper等，在生命科学中使用增强式CCD相机进行定 量光子成像，Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990)，p. 337-344)。 在这里，阵列的成像或者通过曝光或者通过使用较高分辨率的光学器件进行光栅化来完 成。多谱光源的使用允许相对容易地获得不同的荧光团，这可以通过使用不同的激发滤光 片(组合)来进行。但是，缺点是阵列的自身荧光和例如照明均勻性这样的与系统相关的 光学效应要求复杂的照明光学装置和滤镜系统。另外的定量检测荧光信号的方法是基于荧光共聚焦显微镜。例如在US 5，304，810 中描述的共聚焦扫描系统是基于通过两个针孔沿着光轴选择荧光信号。这就要求对样品进 行大量的调整尝试，或建立起有效的自动聚焦系统。这样的系统在技术方案层面上是高度 复杂的。所需的元件例如激光器、针孔、任选冷却的检测器如PMT、雪崩二极管、或CCD、复杂 并高度精确的机械平移元件和光学装置必须通过大量的努力来进行最适化和整合(参见 例如US 5，459，325 ；US 5，192，980 ；US5, 834，758)。小型化的程度和价格受到元件的多样 性和功能性的限制。目前，基于探针阵列的分析通常读出的是荧光数值(参见例如A. Marshall和 J. Hodgson, DNA 芯片可能性的排列，Nature Biotechnology, 16，1998，27-31 ；G. Ramsay, DNA芯片技术状态，Nature Biotechnology, 16, Jan. 1998，40-44)。然而，上述检测装置和 方法的缺点是高的信号背景导致的有限的精确性，有时相当多的技术尝试，以及与检测方 法相关的高花费。具体来说，已知有多种共聚焦系统，适合于检测以阵列形式安装在流体室中 的小规模集成物质文库(参见例如US 5, 324,633, US 6，027，880、US 5，585，639、WO 00/12759)。然而，上述的方法和系统只能以非常有限的方式被改造用于检测特别是安装在流 体系统中的大规模集成分子阵列，特别是由于其中发生的散射、反射和光学象差。此外，在 这样的大规模集成阵列中，对空间分辨率有极大的要求，但是到目前为止，这在技术上还不 能实现。因此，存在着对高度集成的阵列的需求，其中探针和靶之间的相互作用可以以极
5高的精确性并用相对而言很小的技术努力来定性和/或定量地检测。替代元件的选择性和获得性的增加促进了替代成像技术的建立，例如荧光偏振和 时间分辨的荧光用于与固体结合的分析。通过以偏振的方式激发的荧光团扭曲偏振轴的效 应被用于以微量滴定形式定量。此外，也有方法建立了廉价的具有高通量的系统(HTS系 统)，使用了相应修饰的聚合物箔作为偏振滤光片(参见I. Gryczcynski等.，可目测的偏 振感测，Anal. Chem. 1999，71，1241-1251)。最近的进展使用了无机材料的荧光，例如镧系元素(M. Kwiatowski等，螯合物 标记的寡核苷酸的固相合成在三色连接酶介导的基因分析中的应用，Nucleic Acids Research, 1994，22，13)和量子点(Μ. P. Bruchez等，半导体纳米晶体作为荧光生物标记物， Science 1998，281，2013)。表现出长的发射时间、范围在微秒级的染料，象镧系元素螯合 物，需要将染料转化到流动相中，所以原位分辨检测是不可能的。在国际专利申请WO 00/72018中描述了用于检测用金珠标记的样品的光学机构 以及通过银放大效应使它们可视化的机构。然而这里描述的机构只适合于静态测量中的检 测。在静态测量中，将靶与布置在探针阵列上的探针相互作用，在反应开始后，在那些发生 了相互作用的阵列元件上形成了沉淀，然后记录下图象，并根据沉淀形成的程度指派测量 的灰度值浓度。在WO 02/02810中提供了通过探针和靶在探针阵列上的分子相互作用在样品中 定性和/或定量检测靶的方法，其中阵列元件上沉淀形成的时间依赖性行为以信号强度的 形式被检测，即执行动力学测量。在描述沉淀的形成作为时间的函数的曲线的基础上，给每 个阵列元件指派定量阵列元件上探针和靶之间相互作用的值，从而也就是结合的靶的量。这样的动力学测量需要在例如特定的温度条件下或在过程的特定阶段中记录图 象系列，例如在记录的时间中在存在特定溶液的情况下。这需要高度集成的阵列中每个元 件的复杂的合作，特别是在基因分型领域中应用时。此外，在许多生物医学诊断测试中存在这样的问题，即最初存在的靶分子的量不 足以被检测到，因此通常在实际测试步骤开始之前，首先必须从样品中扩增靶分子。一般来 说，DNA分子的扩增是通过聚合酶链反应(PCR)来进行的。对于RNA的扩增来说，必须通过 反转录将RNA分子转化为相应的互补DNA(cDNA)。然后也可以通过PCR扩增该cDNA。PCR 是标准的实验室方法(例如在Sambrook等(2001)分子克隆实验室指南，第三版，Cold Spring Harbor，N. Y.，Cold Spring Harbor Laboratory Press 中)0通过PCR扩增DNA相对较快，通过微型化方法在小体积中允许高样品通量，并且能 有效地进行自动化操作。但是，只通过扩增来表征核酸是不可能的。在扩增之后对PCR产物进行表征还需 要使用一些分析方法，例如核酸序列测定、杂交、和/或电泳分离和分离方法。一般来说，用于扩增和检测核酸的装置和方法应该被设计成需要尽可能少的实验 人员的介入。允许对核酸进行扩增和检测，并且在该过程中实验人员只需要最少介入的方 法的优点是显而易见的。一方面，可以避免污染。另一方面，这种方法的可重复性相当高， 因为它们可以达到自动化。考虑到诊断方法的合法性，这也是极端重要的。目前，有多种方法可以扩增和检测核酸，其中首先通过PCR扩增靶物质，然后通过 与探针阵列进行杂交确定靶序列的身份或遗传状态。一般来说，在杂交范围内，为了获得足够用于定性和定量检测所需的处理量，被检测的核酸分子或靶分子的扩增是必需的。核酸的PCR扩增和它们的杂交检测都受几个基本性问题的影响。这也同样适用于 将核酸的PCR扩增和它们的杂交检测相结合的方法。在将PCR扩增和它的杂交检测相结合的方法中，如果在被检测的核酸或被检测的 靶分子中插入可检测的标记物，例如以荧光标记的引物的形式，通常在实际检测前要执行 清洗步骤。这样的清洗步骤用于除去未转化的引物，与扩增的产物相比这些未转化的引物 的量大得多，以及用于除去带有荧光标记物的这些核苷酸，它们不参加检测反应或不与阵 列上的核酸探针特异性杂交。通过这种方式，预计可以减少这些分子引起的高水平信号背 景。但是，这样一个额外步骤显著地减慢了检测方法。此外，那些与微阵列上的核酸探针特 异性杂交的被检测的核酸的检测信号也显著地降低了。后者主要是由于这样的事实，即通 过杂交结合的靶和溶解的靶之间的平衡在清洗步骤之后不再存在。已经与阵列上的核酸探 针杂交的核酸通过清洗而从结合位点上解离开来，因而与溶解的分子一起被洗掉。即便溶 解的分子的清洗或漂洗步骤被执行得比已经杂交的核酸的解离更快，也仅仅留下可检测 到的信号。因此，存在对高度集成的阵列的需求，其中探针和靶之间的相互作用可以以极高 的精确性和相对而言很小的技术努力来定性和/或定量地检测。此外，存在着对装置的需要，该装置允许在一个反应空间中执行PCR和分析反应， 例如杂交反应。因此，摆在本发明面前的问题是克服上面提到的本技术领域内的问题，特别是由 于分析方法和测试系统之间缺少相容性而引起的问题。具体来说，摆在本发明面前的问题是分别提供方法和装置，其中探针和靶之间在 探针阵列上的相互作用可以以极高的精确性和高灵敏度以及以易于使用和成本效率高的 方式来定性和/或定量地检测。摆在本发明面前的另一个问题是分别提供方法和装置，用于核酸的扩增和定性定 量检测，其中实验人员在检测步骤中的介入可以被最小化。摆在本发明面前的另一个问题是分别提供方法和装置，用于核酸的定性和定量检 测，其中不损害靶分子和阵列上的探针分子之间的相互作用就能确保微阵列上相互作用检 测中的高信噪比。摆在本发明面前的另一个问题是分别提供方法和装置，通过它们可以在检测中获 得高的动力学分辨率，即能够确保在强的信号残留中检测弱的探针/靶相互作用。摆在本发明面前的另一个问题是分别提供方法和装置，它们允许以高通量速度 几乎同时对核酸进行扩增和表征。这些以及其它摆在本发明面前的问题通过提供在发明权利要求中描述的实施方 案得到了解决。
发明内容
本发明提供了定性和/或定量检测探针分子和靶分子之间的分子相互作用的方 法，其中溶液的替换和/或除去，即具体来说是清洗或漂洗步骤可以被省略。具体来说，本发明的这样的方法包含下列步骤
a)将含有靶分子的样品放入带有微阵列的反应室中，其中微阵列含有底材，其上 探针分子被固定在阵列元件上；b)检测靶分子和固定在底材上的探针分子之间的相互作用，其中在将含有靶分子的样品放入反应室之后以及检测步骤之前或之中不进行反 应室中溶液的替换和/或不从反应室中除去溶液。此外，在本发明的范围内提供了适合于实行这些方法的装置。具体来说，在本发明的范围内提供了用于定性和/或定量检测探针和靶分子之间 的分子相互作用的装置，包括a)具有底材的微阵列，其上探针分子被固定在阵列元件上，其中微阵列被安排在 装置的第一个表面上；以及b)反应室，它在上面排列了微阵列的第一个表面和第二个表面之间形成，其中微阵列和第二个表面之间的距离是可变的。具体来说，微阵列与第二个表面之间距离的可变性通常形成了本发明装置的检测 平面，允许由不与微阵列的探针分子具有特异亲和性，因而不与它们相互作用的标记的靶 分子引起的信号背景得以显著减小或完全避免。此外，本发明提供了用于定性和/或定量检测探针和靶分子之间的分子相互作用 的方法，包括下列步骤a将含有靶分子的样品溶液放入上述的本发明装置的反应室中；以及b检测靶分子和固定在底材上的探针分子之间的相互作用。本发明用于检测靶分子的方法和装置的设计方式使得在执行检测方法和任选靶 分子的扩增过程中，反应室中需要尽可能少的实验人员的介入。这样提供的主要优点是避 免了污染。此外，与常规方法相比，本发明的方法的可重复性也显著提高了，因为本发明的 方法由于对外部介入进行了最小化从而更便于自动化。根据诊断方法的要求，上述的优点 发挥了重要作用。此外，为了描述本发明，使用了下面的定义在本发明的范围内，探针或探针分子或分子探针被理解为是指这样的分子，它们 由于特定的特征性结合行为或特定的反应性而被用于检测其它分子。每种能够与固体表面 结合并具有特异亲和性的分子都可以用作布置在阵列上的探针。在优选实施方案中，它们 是生物聚合物，特别是肽、蛋白、抗原、抗体、碳水化合物、核酸等类别的生物聚合物和/或 其类似物，和/或上述生物聚合物的混合聚合物。在特别优选情况下，探针是核酸和/或核 酸类似物。具体来说，具有确定的已知的序列，被用于杂交方法中检测靶分子的核酸分子被 称为探针。DNA和RNA分子都可以用作核酸。例如，核酸探针或寡核苷酸探针可以是具有 10到100个碱基长度的寡核苷酸，优选情况下具有15到50个碱基长度，更优选情况下具 有20到30个碱基长度。本发明中，典型情况下探针是单链的核酸分子或核酸类似物分子， 优选为具有至少一个与靶分子的序列区域互补的序列区域的单链DNA分子或RNA分子。根 据检测方法和使用的不同，探针可以被固定在固相支持底材上，例如以微阵列的形式。此 外，根据检测方法的不同，它们可以被放射性或非放射性标记，以便它们可以通过本技术领 域中常规的检测方法被检测。
在本发明的范围内，靶或靶分子被理解为是指通过分子探针被检测的分子。在本 发明的优选实施方案中，被检测的靶是核酸。然而，本发明的探针阵列也可以以类似的方式 用于检测肽/探针相互作用、蛋白/探针相互作用、碳水化合物/探针相互作用、抗体/探 针相互作用等。在本发明的范围内，如果靶是通过与布置在探针阵列上的探针进行杂交而检测的 核酸或核酸分子，该靶分子通常含有40到10000个碱基长度的序列，优选情况下含有60到 2000个碱基长度的序列，更优选情况下含有60到1000个碱基长度的序列，特别优选情况下 含有60到500个碱基长度的序列，最优选情况下含有60到150个碱基长度的序列。任选 地，它们的序列也可以含有引物的序列以及由引物确定的模板的序列区域。具体来说，靶分 子可以是单链的或双链的核酸分子，其一条或两条链被放射性或非放射性标记，以便它们 可以通过本技术领域中常规的检测方法被检测。根据本发明，靶序列是指通过与探针杂交而被检测的靶序列区域。根据本发明，它 也称作被探针寻址的该区域。在本发明的范围内，物质文库被理解为是指大量不同的探针分子，优选至少2到 1000000个不同的分子，特别优选至少10到10000个不同的分子，最优选100到1000个不 同的分子。在具体的实施方案中，物质文库也可以只包含至少50个或以下或至少30000个 不同的分子。在优选情况下，物质文库以阵列的形式布置在本发明装置的反应室内的支持 物上。在本发明的范围内，探针阵列被理解为是指分子探针或物质文库在支持物上的 布局，其中每个探针的位置是单独确定的。优选情况下，阵列包含了被称为阵列元件的确定 的位点或预定的区域，它们以特定的方式被特别优选地布置，其中每个阵列元件通常只包 含一种探针。这里，分子或探针在支持物上的布局可以通过共价的或非共价的相互作用而产 生。这里，探针被布置在支持物朝向反应室的一面上。布局中，即阵列中的位置通常被称为
点ο在本发明的范围内，阵列元件、或预定区域、或点、或阵列点被理解为是指表面上 被确定要安置分子探针的区域；所有被占据的阵列元件的总和构成了探针阵列。在本发明的范围内，支持元件、或支持物、或物质文库支持物或底材被理解是指其 上安装了探针阵列的固体。支持物，通常也被称为底材或基体，可以是指例如物体支持物、 或晶片或陶瓷材料。在具体的实施方案中，探针也可以直接固定在第一表面上，优选在第一 表面的分区上。布置在底材或检测表面上的阵列布局中的全体分子、或布置在底材或检测表面的 阵列布局中和支持物或底材上的全体物质文库通常被称为“芯片”、“微阵列”、“DNA芯片”、 “探针阵列”等。在本发明的范围内，检测平面被理解为是指本发明的装置的第二个表面。在优选 情况下，布置在微阵列上的探针在检测探针和靶的相互作用的过程中基本上位于检测平面 中，这实际上是由于微阵列和第二表面之间的距离被减小到几乎为零。在本发明的范围内，室体被理解为是指形成反应室的固体。物质文库支持物或芯 片通常是室体的一部分，其中物质文库支持物可以由与室体的其它部分不同的材料制成。
在本发明的范围内，反应室或反应空间被理解为是指在微阵列和第二表面或检测 平面之间形成的空间，在优选情况下被设计为可变的微隙。反应空间的侧面被侧壁所限制， 这可以通过例如弹性密封垫来进行。固定在微阵列上的探针位于面向反应室内部的一侧 上。反应室或反应空间的底部由阵列的第一或第二表面来界定。具体来说，第二表面或检 测平面与底材或微阵列的表面之间的距离被称为反应空间或反应室或微隙的厚度。在本发 明范围内，反应空间通常只有小的厚度，例如厚度最多1cm、优选情况下最多5mm、特别优选 情况下最多3mm、最优选情况下最多1mm。在本发明的范围内，微阵列和第二表面之间的距离被理解为是指微阵列底材表 面，即微阵列面向反应空间的一面，与面向反应空间的第二表面的面之间的距离。如果微阵 列与第二表面之间的距离几乎为零，意味着底材表面均勻平坦地放置在第二表面上。在本发明的范围内，微隙被理解为是指反应空间，它可以被微阵列和第二表面 之间的毛细作用力充满。一般来说，微隙具有小的厚度，例如最多1mm，优选情况下最多 750 μ m,特别优选情况下最多500 μ m。根据本发明，范围在10 μ m到300 μ m、15 μ m到 200 μ m和/或25 μ m到150 μ m之间的厚度优选作为微隙的厚度。在具体的实施方案中，微 隙的厚度为50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m或90 μ m。在本发明的范围内，如果反应空间或反应 室的厚度超过2mm，则反应空间或反应室将不再被称为微隙。在本发明的范围内，仓(cartridge)或反应仓被理解为是指具有室体和相应外套 的反应室的单元。在本发明的范围内，共聚焦荧光检测系统被理解为是指荧光检测系统，其中物体 在物镜的焦距平面上通过点光源照明。这里的点光源、物体和点光线检测器准确地位于光 学共轭平面上。共聚焦系统的例子在A.Diaspr0，共聚焦和二维光子显微术基础、应用与 进展，Wiley-Liss，2002中有描述。在本发明的范围内，为整个反应室成像的荧光光学系统被理解为是指非共聚焦的 荧光检测系统，即荧光检测系统，其中利用点光源的照明不只限于物体。因此这样的荧光检 测系统没有焦距限制。本发明的范围内的常规阵列或微阵列在优选例如Imm到4mmXlmm到4mm、优选为 2mmx2mm的方型表面上包含了大约50到10000、优选为150到2000个不同种类的探针分子。 在本发明范围内的其它实施方案中，微阵列在几mm2到几cm2、优选大约Imm2到IOcm2、特别 优选为2mm2到1cm2、最优选大约4mm2到6. 25mm2的表面上包含了大约50到大约80000、优 选大约100到大约65000、特别优选大约1000到大约10000个不同种类的探针分子。例如， 常规的微阵列在2mmX2mm的表面上具有100到65000个不同种类的探针分子。在本发明的范围内，标记或标记物被理解为是指可检测的单位，例如荧光团或其 上可以连接可检测单位的锚定基团。在本发明的范围内，扩增反应通常包含10到50个或更多的扩增循环，优选大约25 到45个循环，特别优选为大约40个循环。在本发明的范围内，循环扩增反应优选为聚合酶 链反应(PCR)。在本发明的范围内，扩增循环是指循环扩增反应的单一增加步骤。PCR的增加步骤 也被称为PCR循环。在本发明的范围内，扩增产物是指通过循环扩增反应、优选通过PCR扩增的核酸分子的增加或拷贝或扩增而得到的产物。通过PCR方法扩增的核酸分子也被称为PCR产 物。在本发明的范围内，变性温度被理解为是指在扩增循环中双链DNA被分开时的温 度。通常情况下、特别是在PCR中，变性温度高于90°C，优选大约95°C。在本发明的范围内，退火温度被理解为是指引物与被检测的核酸杂交时的温度。 通常情况下、特别是在PCR中，退火温度在50°C到65°C的范围内，优选大约60V。在本发明的范围内，链延伸温度或延伸温度被理解为是指通过插入单体元件合成 核酸时的温度。通常情况下、特别是在PCR中，延伸温度在大约68°C到大约75°C的范围内， 优选大约72 °C。在本发明的范围内，寡核苷酸引物或引物是指与被检测的DNA、也被称为靶DNA结 合或杂交的寡核苷酸，其中在循环扩增反应中，被检测的DNA的互补链的合成从结合位点 开始。具体来说，引物是指优选具有大约12到30个碱基的短的DNA或RNA寡核苷酸，它与 较大的DNA或RNA分子的一部分互补，并在其3’-末端具有游离的3-羟基基团。由于该游 离的3’-羟基基团，引物可以作为任何任选的DNA或RNA聚合酶的底材，该聚合酶在引物上 以5’-3’的方向合成核苷酸。此处，新合成的核苷酸的序列由与引物杂交的模板序列中位 于引物的游离3’ -羟基之后的序列所预先决定。常规长度的引物包含12到50个核苷酸， 优选在15到30个核苷酸之间。作为模板用于合成互补核酸链的双链核酸分子或核酸链通常被称为模板或模板 链。在本发明的范围内，分子相互作用或相互作用被理解为是指靶分子和固定化的探 针分子之间特异性的、共价的或非共价的键。在本发明的优选实施方案中，探针和靶分子之 间的相互作用是杂交。从互补的单链核酸分子形成双链核酸分子或双链体分子被称为杂交。此时，结 合优选总是发生在A和T或G和C碱基对之间。在杂交的范围内，例如DNA-DNA双链体、 DNA-RNA双链体或RNA-RNA双链体可以形成。通过杂交，具有核酸类似物的双链体也可以形 成，例如DNA-PNA双链体、RNA-PNA双链体、DNA-LNA双链体和RNA-LNA双链体。杂交实验通 常被用于检测序列互补性，因此可以检测两个不同核酸分子的身份。在本发明的范围内，处理被理解为是指纯化、浓缩、标记、扩增、相互作用、杂交和/ 或清洗和漂洗步骤以及其它在利用物质文库检测靶的过程中进行的方法步骤。检测本身不 落入术语处理之下。在本发明的范围内，样品或样品溶液或被分析物或溶液是被分析的液体，具体来 说其中包含了被检测以及可能需要被扩增的靶分子。此外，除了常规的添加剂例如缓冲液 之外，这种溶液中也可以包含执行扩增反应所需的物质，例如引物。在本发明的范围内，从反应室中替换反应室中的溶液具体来说是指漂洗或清洗步 骤。替换溶液用来例如除去用可检测的标记物标记的、不能与微阵列上的探针发生特异性 相互作用的分子，这可以在完成相互作用之后通过用无标记的溶液替换样品溶液来进行。 不与微阵列上的探针发生特异性相互作用的分子是例如用可检测的标记物标记的、但在扩 增反应中还没有被转化的引物，或者是用可检测的标记物标记的、但在阵列上不具有互补 探针的靶分子，所述互补探针与所述靶分子发生特异性相互作用。
在本发明的范围内，从反应室中除去溶液被理解为是指这样的步骤，通过该步骤 可以将用可检测的标记物标记的、但不与微阵列上的探针发生特异性相互作用的分子从反 应室中除去。不与微阵列上的探针发生特异性相互作用的分子是例如用可检测的标记物 标记的、但在扩增反应中还没有被转化的引物，或者是用可检测的标记物标记的、但在阵列 上不具有互补探针的靶分子，所述互补探针与所述靶分子发生特异性相互作用。在本发明的范围内，如果在将含有靶分子的样品注入反应室和检测相互作用之间 不进行反应室中溶液的替换和/或不从反应室中除去溶液，可以想象在这段时期内可以另 外将溶液注入反应室中，而不替换或除去已经存在于反应室中的溶液。因此，本发明的第一个目标包含了定性和/或定量检测探针和靶分子之间的相互 作用的方法，具体来说包含下列步骤a)将含有靶分子的样品注入含有微阵列的反应室中，其中微阵列含有底材，其上 探针分子被固定在阵列元件上；b)检测靶分子和固定在底材上的探针分子之间的相互作用。其中在将含有靶分子的样品注入反应室之后和检测步骤之前或之中不进行反应 室中溶液的替换和/或不从反应室中移出溶液。在本发明的这个方面，本发明的方法的基本特征是在检测被检测的靶分子和固定 在微阵列的底材上的探针分子之间的相互作用的过程中不进行反应室中溶液的替换或不 从反应室中取出溶液。也就是说，在相互作用后不需要漂洗或清洗步骤，以及/或在相互作 用后不从反应室中除去不与微阵列上的探针特异性相互作用的分子，就可以进行靶和探针 之间相互作用的检测。在本发明的方法中，具体来说这可以通过焦距选择性检测方法来保证，例如通过 共聚焦技术或通过样品底物中、基于深度选择性照明、由于例如总反射引起的激发光的逐 渐消失解偶联(TIFR)，或者使用基于波导的方法。在为了增加灵敏度进一步排除由存在于 液体中、即未杂交的荧光分子引起的背景信号的情况下，这样的焦点选择性方法将是特别 优选的。使用荧光标记的靶分子，通过使用象总内部反射荧光显微术(TIRF)或共聚焦荧光 显微术这样的方法，可以将特异性相互作用信号与背景荧光区分开来。这种例子是基于CCD的检测器，它在暗视野中通过入射光或透射光执行荧 光团的激发，以辨别光学效应如散射和反射(参见例如C. E. Hooper等，在生命科 学中使用增强式C⑶相机进行定量光子成像，Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence (1990), p. 337-344)。其它替代的能够用于本发明的方法的荧光检 测系统是例如在WO 00/12759、WO 00/25113和WO 96/27025中描述的白灯装置，例如在 US 5，324，633、US 6，027，880、US 5，585，639 和 WO 00/12759 中描述的共聚焦系统，例如 在US 5，760，950中描述的基于共聚焦成像中的Nipkow盘的共聚焦激发系统，例如在WO 98/57151中描述的基于结构化激发分布的系统，例如在WO 99/27140中描述的使用微型光 学元件的大规模集成荧光检测系统，以及例如在WO 00/12759中描述的激光扫描系统。使 用这种常规荧光检测系统的荧光检测方法的总的进展在例如US 5，324，633中有描述。在WO 2004/087951中描述的装置，其中的反应室通过微隙形成，特别适合于 执行本发明的检测方法，无需替换反应室中的溶液和/或不从反应室中移出溶液。WO 2004/087951的相关内容在此明确地引用。
在本发明的这个方面的另一个实施方案中，反应室中溶液的替换和/或除去的步 骤被避免，这是通过检测阵列表面上的质量变化来进行检测的，例如在WO 03/004699中描 述的那样。WO 03/004699的相关内容在此明确地引用。在本发明的这个方面的另一个实施方案中，反应室中溶液的替换和/或除去 的步骤被避免，这是通过检测声学表面波来进行检测的，例如在Z. Guttenberg等，Lab Chip. 2005 ；5 (3) =308-17 中描述的那样。在本发明的这个方面的另一个实施方案中，反应室中溶液的替换和/或除去的步 骤被避免，这是通过阵列表面的电极的电化学检测来进行检测的，例如通过测量氧化还原 电势的改变(参见例如 X. Zhu 等，Lab Chip. 2004 ；4(6) :581-7)或 cyclic voltometry (参 见例如 J. Liu 等，Anal Chem. 2005 ；77 (9) :2756-2761 J. Wang, Anal Chem. 2003 ；75(15) 3941-5)。在本发明的这个方面的另一个实施方案中，反应室中溶液的替换和/或除去的步 骤被避免，这是通过阵列表面的电极的电检测来进行检测的，例如通过阻抗测量(另外参 B S. M. Radke φ, Biosens Bioelectron. 2005 ；20 (8) :1662-7) 在本发明的这个方面的另一个实施方案中，反应室中溶液的替换和/或除去的步 骤被避免，这是通过使用具有FRET探针(FRET，荧光共振能量转移)的微阵列来进行的。这 种FRET探针的使用是基于荧光淬灭剂对的形成，从而使只有当靶分子与表面上的互补探 针结合时才产生荧光信号。FRET探针的使用在例如B. Liu等，PNAS 2005，102，3，589-593 ； K. Usui 等，Mol Divers. 2004 ；8 (3) :209-18 J. A. Cruz-Aguado 等，Anal Chem. 2004 ； 76(14) :4182-8 和 J. Szollosi 等，J Biotechnol. 2002 ；82 (3) :251-66 中有描述。在本发明的这个方面的另一个优选实施方案中，反应室中溶液的替换和/或除去 的步骤被避免，这是通过使用下面详细描述的用于定性和/或定量检测探针和靶分子之间 分子相互作用的本发明装置来实现的，其中该装置包含a)具有底材的微阵列，其上探针分子被固定在阵列元件上，其中微阵列被安排在 装置的第一个表面上；以及b)反应室，在上面排列了微阵列的第一个表面和第二个表面之间形成，其中微阵列和第二个表面之间的距离是可变的。本发明的另一个目标涉及使用上述的FRET探针分子，和/或从下列的组中选择的 检测方法上述的总内部反射荧光显微术(TIRF)，上述的共聚焦荧光显微术，上述的检测 质量改变的方法，上述的检测声学表面波的方法，上述的电化学和/或电学检测方法，以避 免在将含有靶分子的样品注入反应室期间或之后、以及在定性和/或定量检测探针和靶分 子之间的分子相互作用的方法中检测之前或期间替换反应室中的溶液和/或从反应室中 除去溶液，具体来说包含下列步骤a)将含有靶分子的样品溶液注入含有微阵列的反应室中，其中微阵列含有底材， 其上探针分子被固定在阵列元件上；b)检测靶分子和固定在底材上的探针分子之间的相互作用。本发明的另一个目的具体来说是用于定性和/或定量检测探针和靶分子之间的 分子相互作用的装置，包含a)具有底材的微阵列，其上探针分子被固定在阵列元件上，其中微阵列被安排在装置的第一个表面上；以及b)反应室，在上面排列了微阵列的第一个表面和第二个表面之间形成，其中微阵列和第二个表面之间的距离是可变的。在探针分子和靶分子之间完成相互作用后，由样品溶液中存在的、不与探针分子 相互作用的标记的分子引起了不希望的背景。具体来说，在探针和/或靶分子是核酸和/ 或核酸类似物的情况下，该背景是由存在于样品溶液中不与探针分子杂交的标记的引物和 /或标记的核酸引起的。已知除去干扰的背景信号的可能性是在相互作用完成之后用未标记的、例如无荧 光的溶液替代样品溶液。但是，由于溶蚀、溶液的老化以及不渗透性问题，这种改变一般来 说是浪费的并容易受到干扰。本发明的装置的基本特征是微阵列和第二表面之间的距离是可变的。微阵列和第 二表面之间的距离的可变性意味着本发明的装置的反应室是可压缩的。具体来说，微阵列 和第二表面之间的距离的变化方式使得微阵列可以均勻地和/或可逆地放置在第二表面 上，或可以将其活性一面、即其上固定了核酸探针的一面压在该表面上。因此，可压缩的反应室允许在进行检测之前通过减小微阵列和检测平面之间的距 离来替换含有不与探针分子相互作用、因而构成不希望的背景的标记分子的样品溶液。通 过这种方式，有可能在检测之前不用非标记的溶液替换样品溶液，就能够使用任何光学检 测系统检测探针和靶分子之间的相互作用。例如，通过本发明的装置，不用非标记的溶液替 换样品溶液，使用DNA芯片的简单荧光显微成像技术检测相互作用信号，特别是弱的荧光 液体，是可能的。具体来说，通过下面描述的本发明的装置的实施方案，最终可以确保不再需要光 学检测系统的聚焦。因此，本发明的装置允许例如使用不具有自动对焦功能的简单的荧光 显微镜装置作为读取装置，用来检测靶和探针之间的杂交，而不需要液体操作步骤，具体来 说例如清洗步骤来除去不与阵列结合的靶分子，例如未杂交的靶核酸，这与迄今为止用于 检测核酸的荧光光学检测系统相反。尽管通过本发明的装置进行多功能样品处理和分析是可行的，仍提供了用于检测 和任选扩增样品中的靶分子的成本效率非常高的系统。本发明的装置、特别是与光学检测 系统相连后，更加耐用，以至于它们也适合于移动使用。通过适当地选择芯片、处理方案和分析的化合物，本发明的装置可以被用于大多 数不同类型的基因分析，例如诱因诊断、病菌诊断和分型。因此，在本发明的装置中，可以 使用很少的设备执行完全的遗传分析，它也能够作为一次性仓使用。因此，本发明的装置允 许执行在位的检测方法，例如在献血过程中。测量结果可以快速获得，优选在0. 5到2小时 之内。所有可以使用本发明的装置操作的步骤，例如纯化、处理、扩增核酸和实际的杂交都 可以自动执行。操作者只需要熟悉样品的撤回、样品在本发明的装置中的注入，以及注意分 析结果。在优选情况下，微阵列和第二表面之间的距离在大约0到大约Imm的范围内变化。 微阵列和第二表面之间距离的进一步优选的下限是大约0. 1 μ m，大约1 μ m，和大约10 μ m。 微阵列和第二表面之间距离的进一步优选的上限为大约0. 01mm、大约0. 5mm、大约1mm，最 优选的是大约0. 3mm。令人吃惊的是，如果底材表面和第二表面之间的距离大约为零或接近零，探针和阵列表面上的靶之间的相互作用甚至不受影响。在优选情况下，本发明的装置还含有检测系统。此时，在优选情况下检测系统是光 学系统。适合于本发明的范围的系统的例子是基于荧光、光吸收、共振转移等的检测系统。 在优选情况下，光学检测系统是荧光光学系统。在特别优选的情况下，荧光光学系统是不具 有自动对焦的荧光显微镜，例如具有固定焦距的荧光显微镜。在另一个实施方案中，检测系统与至少一个调距横板相连，它位于第二表面之上， 可以调整检测系统和第二表面之间的距离。如果微阵列和第二表面之间的距离大约为零， 该调距横板也确定了芯片表面与检测装置的光学系统之间的距离。因此，保持光学检测装 置和微阵列表面之间的距离变化在很小的范围内是可能的。这种变化只包含第二表面，一 般为玻璃表面的厚度变化，第二表面的偏斜，芯片和检测平面之间或调距横板和检测平面 之间的压制表面上可能的污染物引起的层的厚度。这使得重新对焦使光学系统进入焦点成 为不必需，极大地简化了装置的操作，并/或使得昂贵的自动对焦装备成为不必需。在另一个实施方案中，为第一和第二表面之间形成的反应空间提供了侧面限制的 补偿区域，当微阵列和第二表面之间的距离减小时，它能够保持反应室中的体积基本上恒 定。在优选情况下，在第一和第二表面之间形成的反应空间在侧面进一步受到弹性密 封垫的限制。特别优选情况下，弹性密封垫由硅橡胶制成。为了确保探针和靶分子之间相互作用的检测，具体来说，第二表面由透光的材料， 优选为玻璃制成。在本发明的装置的另一个实施方案中，第一表面，至少在其位于微阵列之下的区 域中，被开发成能够相对于第二表面指导微阵列，使得微阵列与第二表面之间的距离是可 变的。此时，第一表面，至少在其位于微阵列之下的区域中，可被开发成能够朝向第二表 面指导微阵列，以便微阵列和第二表面之间的距离可以被减小，和/或能够背向第二表面 指导微阵列，以便微阵列和第二表面之间的距离可以被增加。在本实施方案中，在优选情况下第一表面，至少在其位于微阵列之下的区域中，可 以被弹性变形。在特别优选情况下，第一表面由弹性合成材料例如弹性膜制成。另外优选的是第一表面由两个重叠的层形成，两个重叠的层的外层至少在位于微 阵列之下的区域具有凹口。在本实施方案中，优选情况下两个重叠的层的内层由弹性密封 垫或密封膜形成，它们通常也限制了反应空间的侧面(参见图6)。密封膜可以被导向第二 表面。密封膜封闭了外层上的凹口，它通常对应于室体的较低的一面。在反应室进行PCR 的过程中，由于PCR中普遍存在的高温产生了内部压力，尽管密封膜相对不稳定，仍然使 反应室产生压力抗性。因此本实施方案对应于自关闭的阀。为了确保密封膜的弹性，优选 情况下膜被提供有补偿褶(参见图6)。还可以提供装置，该装置包含至少一种工具，通过该工具可以相对于第二表面指 导微阵列。在下文中，该工具将被称为指导第一表面的工具。该指导第一表面的工具优选 选自杆、针、挺杆和螺钉。此时，装置可以包含至少一种指导第一表面的工具，通过该工具可以将微阵列导 向第二表面，使得微阵列和第二表面之间的距离可以被减小，和/或能够背向第二表面指导微阵列，使得微阵列和第二表面之间的距离可以被增加。在特别优选的情况下，可以通过在第一表面上由工具施加压力和/或牵引来相对 于第二表面指导微阵列。此时，上述安置在第二表面上的调距横板可以用作指导第一平面的工具的支架。在优选情况下，可以通过指导第一表面的工具引起第一表面的震动，特别是以10 到30Hz的频率震动，特别优选的是以大约20Hz的频率震动。以这种方式，可以除去芯片上 存在的可能干扰检测的泡，和/或通过指导第一表面的工具的震动引起的充分混合增加相 互作用的速度，例如杂交速度。在优选情况下，也可以相对于第一表面指导第二表面，使得微阵列和第二表面之 间的距离可变。此时，可以相对于第一表面指导第二表面，使得微阵列和第二表面之间的距离可 以被减小，和/或使得微阵列和第二表面之间的距离可以被增加。具体来说，这可以确保通过调距横板在第二表面上施加压力和/或牵引使第二表 面可以相对于第一表面进行引导，使得微阵列和第二表面之间的距离可变。在本发明的装置的另一个优选实施方案中，第一表面和第二表面都可以被指导， 以便微阵列和第二表面之间的距离可变。在另一个实施方案中，本发明的装置被开发成已经在原始状态下的固定在第一表 面上的微阵列在优选情况下均勻地安置在第二表面上以形成检测平面。可以对第一表面进 行指导以便微阵列和第二表面之间的距离增加。此时，第一表面优选由弹性材料制成。在本发明的装置的另一个实施方案中，第一表面被开发成围绕旋转轴的可旋转的 方式。旋转轴将第一表面分成两面。在本实施方案中，微阵列被安排在第一表面的第一个 侧面部分上。在优选情况下，用于旋转运动的旋转轴通过第一表面的中心，即在优选情况下 两个侧面部分是相等大小的。在优选情况下第一表面由弹性材料制成。在可旋转的第一表面的第一个位置，第一表面被排列得基本上平行于第二表面。 在第一位置上，微阵列的表面与第二表面基本上平坦地接触，即其上固定有探针分子的底 材表面基本上不被样品溶液弄湿。在该第一位置上，在第一表面的第二个侧面部分和第二 表面之间形成了一个空间，它在后面也被称为处理室。该处理室可以作为处理样品溶液的 室。在可旋转的第一表面的第二个位置，第一表面被排列得相对于第二表面成180° 以外的角度。在该第二个位置上，微阵列的表面不与第二表面接触，即固定在微阵列底材上 的探针分子可以自由接近样品溶液中存在的靶分子，因此能够与后者相互作用。在第二个 位置中，处理室被压缩。可旋转的第一表面在优选情况下可以通过在第一表面的第一个侧面部分上施加 牵引力来旋转，和/或通过在第一表面的第二个侧面部分上施加压力来旋转。压力和/或 牵引力可以通过上述的用于指导第一表面的工具来施加。芯片或底材或第一表面在优选情况下可以由硅、陶瓷材料如氧化铝陶瓷、浮法硼 硅玻璃(borofloat)、石英玻璃、单晶CaF2、蓝宝石、黄玉、PMMA、聚碳酸酯和/或聚苯乙烯构 成。对材料的选择也依赖于装置或芯片所使用的目的而进行。如果例如芯片被用于表征 PCR产物，只有那些能够抗拒95°C温度的材料可以使用。
16
在优选情况下，芯片通过核酸分子，具体来说通过DNA或RNA分子而官能化。但是， 它们也可以通过肽和/或蛋白例如抗体、受体分子、药物活性肽和/或激素、碳水化合物和 /或该生物聚合物的混合聚合物而官能化。在另一个优选实施方案中，分子探针通过聚合物接头例如改性的硅烷层固定在底 材表面上。这样的聚合物接头可以用于底材表面的衍生制备，因此可以用于分子探针的固 定化。在探针共价结合的情况下，可以使用已经用反应性官能团例如环氧化物或醛类进行 官能化或改性的聚合物如硅烷。此外，本领域的专业人员也熟悉通过异硫氰酸酯、琥珀酰亚 胺和酰亚胺酯对表面进行活化。最后，通常相应地衍生出氨基官能化的表面。此外，加入偶 联试剂例如二环己基碳二亚胺能够确保分子探针相应的固定化。反应室的室体在优选情况下由例如玻璃、合成材料、和/或金属例如高等级钢、铝 和黄铜这样的材料构成。为了生产室体，可以使用例如适合于注模法的合成材料。尤其是 例如macrolon、尼龙、PMMA和特氟隆这样的合成材料是可能的。在具体的实施方案中，优选 的是导电的合成材料例如含有5%到30%碳纤维的聚酰胺，含有5%到30%碳纤维的聚碳 酸酯，含有2%到20%不锈钢纤维的聚酰胺，以及含有5%到40%、特别是20%到30%碳纤 维的PPS。可以选择和/或可以加上的是，第一和第二表面之间的反应空间可以通过隔片关 闭，该隔片允许例如利用注射器填充反应空间。在优选实施方案中，室体由透光的材料例如 玻璃、PMMA、聚碳酸酯、聚苯乙烯和/或黄玉构成。此时，材料的选择将根据装置的使用目的 进行调整。例如当选择材料时需要考虑到装置将要暴露到的温度。如果，例如装置将要用 于执行PCR，只有那些在如95°C的温度下能够较长时间保持稳定的材料可以使用。具体来说，室体被开发成能够使微阵列用其活性面，即其上固定有核酸探针的阵 列面均勻地和/或可逆地压向第二表面。在具体的实施方案中，本发明的装置含有从下列的组中选择的模块优选由合成 材料制成的室体，密封反应室的隔板或密封垫，DNA芯片，和/或第二个透光的表面，优选为 玻璃窗格，其中第二表面也可任选同时用作芯片(参见图2和图3)。在本实施方案中，室体 和密封垫被开发成具有弹性，以便DNA芯片可以以其活性面均勻和可逆地压向玻璃盖。由 此，位于DNA芯片和检测表面之间的标记的分析液体被完全置换(参见图5和图6)。通过 这种方式可以进行高灵敏度的荧光检测例如计算机成像的荧光显微术，而不受样品溶液的 背景荧光的损害。在优选情况下，室体的第二表面由透明的材料如玻璃和/或透光的合成材料如 PMMA、聚碳酸酯、聚苯乙烯或丙烯酸树脂构成。在优选情况下，反应室在第二表面和微阵列之间以具有可变厚度的微隙的形式形 成。通过在芯片和检测平面之间形成微隙，可以利用毛细作用力安全地填充反应室。该毛 细作用力也发生在反应室无压缩的状态中；但是它们可以通过压缩反应室来增加。在特别 优选的情况下，微隙的厚度在大约Om到大约IOOm的范围内。从能够压缩反应空间从而减小微阵列和检测平面之间的缝隙的宽度的可能性，带 来了在反应室中操作液体的其它可能性。因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了几个 小室代替一个单一的室，其中该小室之间的分区不达到第二表面的高度，以便在反应室未 压缩的状态下小室之间能够产生流体联系。通过压缩反应室可以将小室分开。因此通过压 缩，小室之间的分区可以像阀门一样操作。
该通过阀门分开的小室的具体实施方案是将本发明的装置的反应空间进一步分 成不同的PCR室。在每个室中呈现单独的引物。开始时，小室被同时充满被分析物。然后 将反应空间压缩。此后，反应空间经历PCR的温度循环。因为每个小室充满不同的引物，在 每个室中发生不同的扩增反应。室之间的交换不会发生。在PCR进行之后发生杂交。此时，每个小室可以含有单独的芯片区域或单独的芯 片。但是，也可能通过增加微阵列与第二表面之间的距离促进小室之间的流体联系，以便被 扩增的不同物质混合并以这种方式与芯片表面杂交。具有被阀门分开的小室的实施方案的优点是增加了 PCR的多重性，即一个样品进 行独立的PCR的数量，在一步反应中由于生物化学的原因受到限制。因此，将PCR的数量调 整到芯片表面上可能的探针数量是可能的。因此，在本发明的另一个实施方案中，反应室包含了至少两个小室，其中在第一个 未压缩状态中小室是有流体联系的，在第二个压缩的状态中在小室之间没有流体联系。在特别优选情况下，每个小室被指派到微阵列的确定区域。具体来说，小室可以通过用孔洞装备微阵列和/或第二表面来形成，所述孔洞用 作小室之间的壁。在特别优选情况下，小室之间的壁由弹性密封垫形成。当然，具有用阀门分开的小室的处理单元的实施方案可以任意地与任何前述的压 缩原理相结合。在本发明的装置的另一个实施方案中，第一表面由部分可变形的弹性材料例如弹 性膜制成。在只有一部分反应空间可以被压缩的情况下，可以产生芯片被导向第二表面的 小室、不能彼此分开的小室以及不能被改变的小室。因此，能够例如在扩增反应结束时将盐 泵入杂交室的简单的泵系统可以在反应空间中使用。这对于例如最适化PCR缓冲液的化学 杂交条件来说可能是有利的，其中PCR缓冲液仅仅为了执行PCR而最适化。当将反应室分成几个小室时，优选使用几种工具进行搅拌。通常情况下，搅拌的工 具与指导第一表面的工具相同。因此，单独的室可以被特异性地搅拌。这可能适合于例如 执行分离的扩增空间和/或杂交空间。当然，本发明的装置的这个具有几种搅拌工具的实施方案也可以任意地与任何前 述的压缩原理相结合。上述选自室体、侧面限制反应空间的密封垫、微阵列和检测平面的本发明的装置 的元件或模块形成了本发明的装置的所谓的处理单元。在处理单元中，可以进行PCR、杂交 反应、检测和/或评估。在探针和靶是例如待检测的抗体和蛋白的情况下也是同样，由此不 需要执行PCR。但是，下面的解释是专门针对使用核酸靶和探针的检测技术而做的。然而， 对于本领域的专业人员来说，如何对下面描述的单元进行修饰以使它们适合于其它的应用 是很清楚的。在优选情况下，本发明的装置的处理单元以模块的方式构建。这意味着处理单元 可以包含模块的任意组合。在分析过程中也可以交换模块。在另一个优选实施方案中，本发明的装置还包含温度控制和/或调节单元以控制 和/或调节反应室中的温度。这样的用于控制和/或调节反应室中的温度的温度控制和/ 或调节单元具体来说包含加热和/或制冷元件或温度组块。此时，加热和/或制冷元件或温度组块可以被安排成与第一表面和/或第二表面相接触。通过与第一和第二表面都接触， 可以确保特别有效的温度控制和调节。在本实施方案中，微阵列的底材或第一表面和/或第二表面与加热和/或制冷元 件或温度组块相连接，在优选情况下它们应该由具有良好的导热性质的材料制成。这种导 热材料提供了显著的优点，确保在反应空间的整个表面上有着均勻的温度分布，从而允许 在整个反应室中均勻地执行温度依赖性的反应例如PCR，并得到高的产率，并且可以高准确 地控制或调节。因此，在优选实施方案中，微阵列的底材或第一表面或第二表面由具有良好导 热性的材料制成，其具有的热传导率优选在15到SOOWnr1K-1的范围内，特别优选在50到 SOOWnr1K-1的范围内，最优选在100到ZOOWnr1K-1的范围内，其中的材料通常是不透光的。适 合的导热材料的例子是硅，陶瓷材料如氧化铝陶瓷，和/或金属如高级别钢、铝、铜或黄铜。如果本发明的装置的微阵列底材或第一表面或第二表面基本上由陶瓷材料构 成，优选使用氧化铝陶瓷。这样的氧化铝陶瓷的例子是Kyocera公司(Neuss，Germany)生 产的陶瓷 A-473、A-476 和 A-493。在优选情况下，微阵列底材或第一表面或第二表面装备有任选小型化的温度传感 器和/或电极，或者在其背面，即背离反应室的一面具有加热器装置，以便可能通过诱导的 电渗透流对样品液体进行回火和混合。温度传感器可以被开发成例如镍-铬薄膜阻抗温度传感器。电极可以被开发成例如金-钛电极，特别是四极。加热和/或制冷元件在优选情况下可以被选择，以便可能在反应室中对液体进行 快速加热和冷却。此时快速加热和冷却被理解为是指可以通过加热和/或制冷元件介导范 围在0. 2K/s到30K/s之间、优选0. 5K/s到15K/s之间、特别优选2K/s到15K/s之间、最优 选8K/s到ΙΙ/s之间或大约lOK/s的温度变化。在优选情况下，加热和/或制冷元件也可 以介导lK/s到lOK/s之间的温度变化。加热和/或制冷元件例如阻抗加热器可以被开发成例如镍-铬薄膜阻抗加热器。对于温度传感器、加热和/或制冷元件或增加温度的工具和电极的进一步详细规 格和大小，可以参考国际专利申请WO 01/02094的内容。在优选实施方案中，反应室的回火通过使用由导电材料构成的室体来确保。这样 的导电材料在优选情况下是导电的合成材料，例如任选含有5%到30%碳纤维的聚酰胺、 任选含有5%到30%碳纤维的聚碳酸酯、和/或任选含有2%到20%不锈钢纤维的聚酰胺。 优选情况下，含有5%到40%、特别优选是20%到30%碳纤维的PPS(聚苯硫醚)被用作导 电合成材料。另外在优选情况下室体被开发成具有膨胀和变细的部分。室体中的这种膨 胀和变细的部分允许对反应室或相应的表面进行特定的加热。此外，使用这种体积的导体 的优点是，即使是使用的材料任选具有较低的导热性，也可以确保室体或相应的表面被均 勻地回火，因为热被释放到每个体积元件中。偶联和导出热到反应空间中可以通过不同的方式进行。尤其是可以考虑通过外部 微波辐射、内部或外部阻抗加热、内部感应线圈或表面、水制冷和加热、摩擦、光照、特别是 用红外光照、空气冷却和/或加热、摩擦、温度发射器和珀耳帖元件带入热量。反应空间中温度的测量可以以不同的方式进行，例如通过集成阻抗传感器、半导体传感器、光波指导的传感器、多色染料、多色液晶、外部高温计例如所有类型的顶辐射和 /或温度传感器，它们被整合在指导微阵列的工具中。反应室中温度的测量还可以通过下面的方式来进行，通过在室体中整合温度传感 器，例如通过在室体的生产加工过程中注入，通过使用高温计UR传感器和/或温差电堆进 行非接触性测量，通过用例如整合在装置中的热传感器并与室体或室的适当表面或适当体 积相接触进行接触测量，通过测量检测平面的折射指数的温度依赖性变化，通过测定例如 溶液中、探针阵列上或室密封垫中特定分子的颜色的温度依赖性变化，和/或通过测量所 用溶液的PH值的温度依赖性变化，所述pH值的变化可以通过测量pH敏感的指示剂的颜色 变化，例如通过测量其吸收值。此外，由于加热器电阻的急速增加，可以实现对温度的自动限制，其中相应的阈值 温度优选在95°C到110°C的范围内。当达到阈值温度时，加热器的电阻急速增加，从而实际 上没有电流流过，因而实际上不再有热放出。具体来说，聚合物例如导电的聚酰胺可以用于 这样的加热器，它的电阻在阈值温度下由于聚合物基体的改变或相的改变而增加。在一个实施方案中，温度控制和调节单元被集成在第一表面和/或第二表面中。 在该实施方案中，具体来说处理单元装配有加热器(参见图4)，它用于执行PCR和杂交中的 温度改变。在优选情况下，处理单元具有低的热容量，以便在低的电力需求下可以实现最大 的温度改变速度，例如至少涨/s。为了确保处理单元快速冷却，另一个优选实施方案打算提 供制冷系统，例如空气冷却系统。在优选情况下，处理单元的冷却可以通过持续地将处理单元周围的空间回火到降 低的温度、从而被动地冷却仓来实现。这使得主动地冷却反应仓成为不必需。在另一个实施方案中，温度控制和调节单元可以包含温度组块，其中每个被预热 到确定的温度。在该实施方案中，具体来说处理单元没有集成加热器。由于省略了集成加 热系统，可以提供更合算的处理单元。由于温度组块与本发明的装置的第一表面和/或第二表面接触，在优选情况下确 保温度控制和调节单元的温度组块之间的热转移。在优选情况下，温度组块可以被排列成 线型或排列在旋转盘上，并且以这种方式集成在例如检测装置中。图7显示了具有几个温 度组块的旋转盘，每个温度组块被调整到确定的温度。通过交换处理单元下方的温度组块， 处理单元被带到温度组块所限定的特定温度下。在优选情况下，温度组块的生产使得它们 比处理单元具有明显高的热容量，以便在该实施方案中也可以实现最大的温度改变速度， 例如至少涨/s。在优选情况下，温度组块仅仅是温度调节型的而不是加热或制冷型的，以 便在这种情况下对能量的需求也是最小的。在本实施方案中，可以省略对处理单元的制冷 或加热。在另一个实施方案中，温度控制和调节单元被集成在用于指导第一表面的工具中 和/或用于搅拌的工具中和/或调距横板中。在本实施方案中，热转移是通过将工具和/ 或调距横板与第一表面和/或第二表面相接触来进行的。在优选情况下，装置另外包含再加工单元，用于样品溶液的纯化和/或再浓缩，和 /或控制反应室中流体的装载和卸载。在本发明的范围内，流体被理解为是指液体和气体。 此外，分析溶液可以在再加工单元中重新缓冲。最后，再加工单元也可以用于提供必需的分
20析化学物质。流体容器与反应室的连接可以按照例如国际专利申请WO 01/02094中的描述 来开发。在本实施方案中，在特别优选情况下，反应室和再加工单元通过两个套管相连，其 中套管的安排方式使得第一个套管确保流体从再加工单元注入到反应室中，而第二个套管 确保被注入的流体从反应室中赶出的空气排出。注入到再加工单元中的样品因此可以通过 套管达到处理单元的反应室中。为此，套管被安排的方式使得它们通过套管导管到达反应室。再加工单元可以被开发成与处理单元分开。在用样品溶液以及任选其它反应液体 填充反应室后，再加工单元可以与处理单元分开，优选情况下使其脱离，也可以丢弃它。下面将描述用于填充反应室的集成或非集成单元的实施方案，这些单元在下面也 被称为填充单元或再加工单元。通常，通过适当的工具例如吸管将反应溶液带入填充单元的特定开口。液体运输 到装置中是通过用吸管施加压力、或通过另外的压力产生工具例如注射器或自动单元例如 自动处理机的功能元件来进行的。在优选情况下，填充单元被开发成以工效学适合的方式手动操作。此外，在优选情 况下，它在外部具有其它容易接近的开口以补加反应物质。在优选情况下，填充单元还含有适合的流体界面以穿透室体的密封垫。为此使用 了特定的套管，它由例如高级别钢或聚合物构成，通常具有0. 05mm到2mm的直径。在优选 情况下，安排了至少一个或以上的套管，特别优选情况下安排两个，其中一个可以用于填充 反应液体，另一个用于反应空间的通气并用于取出剩余的流体。这样的套管可以以固定或 可互换的方式与填充单元相连，其中在优选情况下进行一个不能被操作者分离开的连接， 用于操作一次性的填充物。填充单元也可以含有覆盖套管的单元，以便在系统分离后可以避免任何可能的操 作者造成的损伤或环境的污染。在优选情况下，填充单元还包含了适合的机械界面以与反应仓滑动配合接触。该 界面可以被开发成例如特定的咬合的形式。以这种方式，可以确保在优选的位点穿过室体 的密封垫。当在相应的自动处理器中处理反应仓时，需要进行适合的机械测量，这允许在装 置中进行调整和精确定位。具体来说这应用于液体的替换和/或进料的定位，以及为反应 仓的定位，以用于在反应室中进行反应后检测信号。装置或填充单元还可以包含集成的废物容器，用来容纳剩余物或赶出的气体或液 体介质，例如保护性气体填充物或缓冲液。废物容器可以用例如另外的气体、液体或固体 介质填充，它们可逆或不可逆地结合液体或气体物质，例如纤维素、过滤材料、硅胶。此外， 废物容器可以具有通气口，或可以表现出负压以改善整个单元的填充行为。此外，废物容器也可以被开发成分离的模块。在这种情况下，填充单元被装备有相 应的流体界面，它们对应于商业标准，例如LuerLock，并且通向外部。这样的界面可以与连 续系统具有形式或力的联系。在第一个具体的实施方案中，填充是通过具有集成的废物容器的可分离的填充单 元来进行的。具体来说，填充单元用于反应室的非重复填充。填充单元被开发成例如将它插到或暂时连接到仓上，将样品注入到反应空间中，在填充完成之后，再将填充单元与仓分 离并丢弃。在该第一个具体的实施方案中，填充单元还包含有集成的废物容器，可以如前所 述被开发成。该实施方案的一个例子被显示在图22中。通过模块式填充单元填充反应仓 的步骤显示在图23中。在第二个具体的实施方案中，填充通过集成的填充单元进行。此时，填充单元是反 应仓的一个集成元件，因而不能与后者分开；填充单元和仓的丢弃是同时进行的。此时，在 优选情况下填充单元被用于反应室的非重复填充，并可能用于其它的内部流体处理步骤。 在该实施方案中，优选情况下填充单元还包含技术装置，用于执行套管在系统中的优选位 置，特别用于防止在将套管插入室体的密封垫的过程中由于疏忽造成的刺穿。然而，也可以 设想套管在该优选位置刺穿室体的密封垫。该技术装置可以通过例如设置弹簧、弹性元件、 或用于进行捕获的凹口和隆起处来实现。在本实施方案中，填充元件还包含填充和废物通 道，其中含有相应的流体界面，所述界面也可以对应于商业标准，例如LuerLock，并通向外 部。这样的界面可以与连续系统具有主动的或非主动的连锁，用于注入和/或除去气体和/ 或液体介质。该实施方案的一个例子显示在图M中。具有集成的填充单元的反应仓的填 充步骤显示在图25中。在第三个具体的实施方案中，填充通过具有集成的废物容器的集成的填充单元来 进行。在该实施方案中，填充单元是反应仓的一个集成元件，因此不能与后者分开；填充单 元和仓同时被丢弃。此时，填充单元优选用于反应室的非重复填充，并可能用于其它的内部 流体处理步骤。在本实施方案中，填充单元还优选包含技术装置，用于执行套管在系统中的 优选位置，优选用于防止在将套管插入室体的密封垫的过程中由于疏忽造成的刺穿。然而， 也可以设想套管在该优选位置刺穿室体的密封垫。该技术装置可以通过例如设置弹簧、弹 性元件、或用于进行捕获的凹口和隆起处来实现。在本实施方案中，填充元件还包含集成的 废物容器，可以按照上面的描述开发。该实施方案的一个例子显示在图沈中。具有集成的 填充单元和集成的废物容器的反应仓的填充步骤可以通过例如在图23和25中描述的步骤 的组合来进行。下面将描述安排套管以便在压缩步骤中维持压力平衡的具体的实施方案。用于反 应仓的填充工具的套管可以被安排成例如这样的方式，使得在非压缩状态下填充和反应空 间压缩过程中转移多余的反应溶液都是可能的。在优选情况下，这可以通过适当改变密封 垫和套管排列的结构来实现，其中套管优选刺穿反应室中的补偿区域。如果多余的体积不 能通过特定的密封垫设计被吸收，这种排列结构是特别适合的。图27中举例显示了一种带 有未改变形式的密封垫的可能的垂直套管排列结构。本发明的装置还可以含有与检测系统相连、用于控制试验步骤和/或用于处理由 检测系统记录的信号的单元。控制和/或处理单元可以是微控制器或工业计算机。这种检 测单元和处理单元的偶联，确保了反应结果转化为分析结果，允许将本发明的装置作为手 持装置使用在例如医学诊断中。此外，在优选情况下，本发明的装置还具有用于外部计算机的界面。这尤其允许 将数据转移到外部存储器中。在另一个优选实施方案中，装置装备有编码，优选为数据矩阵和/或条形码，包含 了关于物质文库和/或扩增和/或检测反应的执行情况的信息。通过这样的个人识别数字，读取或检测装置可以自动识别哪个试验已经被进行。为此，在生产本发明的装置时，含有关 于物质文库、检测反应的执行等信息的数据记录被储存在数据库中。因此，具体来说，数据 记录可以含有关于探针在阵列上布局的信息，以及关于如何以最有利的方式进行评估的信 息。数据记录或数据矩阵还可以含有关于PCR的温度-时间模式的信息，该PCR任选用于 扩增靶分子。如此获得的数据记录在优选情况下是数字，以数据矩阵的形式连接到支架上。 通过记录在数据矩阵中的数字，在读出物质文库时可以任选地访问成套的数据记录。最后， 数据矩阵可以被温度控制或调节单元和其它控制器，例如用于反应室通过流体容器的填充 和卸载的控制器所读取，因此可以确保扩增和检测反应自动地进行。编码，例如数据矩阵，不必须含有全部的信息。它也可以简单地含有一个识别或进 入号码，然后可以通过该号码从计算机或数据载体中下载必需的信息。本发明的装置可以非常容易地制造。图3中显示了处理单元可以由仅仅4个独立 的元件构成，它们彼此之间简单地适合。
图10和11显示的实施方案由于本发明的结构也 可以容易地制造，尽管它们由几个元件组成。对每个元件的大小的几何耐受性可以是非常 大的，例如1/10到2/10mm，以便例如密封垫和室体的大规模注模可以以非常合算的方式进 行。低耐受性通过将芯片压向检测平面而便利化，因此距离检测显微镜的光径基本上不受 处理单元的元件的影响。仅有的几个具有低耐受性的几何数量是芯片的x、y位置和检测平 面的厚度。但是芯片的ζ位置的变化只发挥次要作用。尽管它们的技术需求低，光学系统 例如荧光检测显微镜的聚焦装置并不需要。这些性质清楚地表明了本发明的装置对于移 动在位使用的适合性。在本发明的另一个方面，提供了定性和/或定量检测探针和靶分子之间的分子相 互作用的方法，包括下面的步骤a按照前面的描述将含有靶分子的样品、优选为样品溶液注入本发明装置的反应 室中；以及b检测靶分子和固定在底材上的探针分子之间的相互作用。本发明的方法允许在反应室中定性和/或定量检测探针和靶分子之间的分子相 互作用，而不需要在相互作用完成之后和检测之前替换样品或反应液体以除去干扰的背
旦
ο在本发明的范围内，探针和靶分子之间的相互作用的检测通常如下进行在将探 针或探针群以预定的方式以微阵列的形式固定到特定的基体上之后或提供微阵列之后，将 靶与探针在溶液中接触，并在预定的条件下保温。通过保温，在探针和靶之间发生了特异性 相互作用或杂交。此时形成的键比靶分子与不特异性针对该靶分子的探针形成的键明显稳
定得多。靶及其探针之间的特异性相互作用的检测可以通过多种方法进行，这一般依赖于 在靶分子与微阵列相互作用之前、之中或之后插入到靶分子中的标记物的类型。一般情 况下，这样的标记物是荧光基团，以便可以通过荧光光学方法读出特异性的靶/探针相互 作用，这种方法与其它常规的检测方法特别是质量敏感的方法相比具有较高的局部分辨 率，并且工作量小(参见例如A.Marshall，J. Hodgson, DNA芯片可能性的阵列，Nature Biotechnology 1998，16，27-31 ；G. Ramsay, DNA 芯片技术状态，Nature Biotechnology 1998，16,40-44)。
根据固定在微阵列上的物质文库和靶分子的化学本质，核酸与核酸之间、蛋白 与蛋白之间以及核酸与蛋白之间的相互作用可以通过这种试验原理来检测(调查报告 参 见 F. Lottspeich, H. Zorbas,1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, Germany) 0此处，抗体文库、受体文库、肽文库和核酸文库都被当作物质文库，可以被固定在 微阵列或芯片上。到目前为止核酸文库扮演了最重要的角色。它们是微阵列，其上固定了脱氧核糖 核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。在本发明的方法的优选实施方案中，微阵列与第二表面之间的距离保持在这样一 个位置，它允许在步骤b)的检测之前进行样品溶液的处理和/或靶分子与固定在底材上的 探针分子之间的相互作用，例如被检测的核酸的扩增和/或被检测的核酸与固定在底材上 的核酸探针之间的杂交。优选情况下步骤b)中微阵列和第二表面之间的距离可以改变，优选减小。即在优 选情况下检测在微阵列与检测平面之间距离减小的情况下进行。特别优选情况下，微阵列 与检测平面之间的距离在检测过程中大约为零。在一个实施方案中，微阵列被导向第二表面以减小微阵列和第二表面之间的距 离。优选情况下，这是通过利用至少一种指导第一表面的工具施加压力以推动第一表面来 确保的，所述工具例如挺杆、杆、针和螺钉，其中工具产生的压力作用点具体来说位于微阵 列下方。将微阵列压向第二表面或检测平面可能是容易的，因为第一表面至少在微阵列下 方的区域中是可以弹性变形的。此外，第一表面也可以被开发成具有两个重叠的层，其中两 个重叠的层的外层至少在位于微阵列之下的区域具有凹口，而两个重叠的层的内层由弹性 密封垫形成。然后通过指导第一表面的工具在内层靠近凹口的位置施加压力。但是，指导第一表面的工具例如针、杆、挺杆和/或螺钉不能仅仅用于对第一表面 施加压力。在泡将在DNA芯片上形成这种可能干扰检测的情况下，可以通过指导第一表面 的工具进行搅拌以除去这些泡，例如对第一表面施加大约20Hz的震动频率，特别是以弹性 膜的形式。此外，常见的一个问题是芯片表面上的相互作用例如杂交花费非常长的时间。除 了其它原因之外，这是由于相互作用或杂交的速度是由扩散作用决定的事实。在优选情况 下，可以通过指导第一表面的工具进行搅拌以增加相互作用或杂交的速度，例如对第一表 面施加大约20Hz的震动频率，特别是以弹性膜的形式，因为搅拌或震动导致反应室中的混
合 O在另一个实施方案中，第二表面被导向第一表面以减小微阵列与第二表面之间的 距离。具体来说，通过利用调距横板在第二表面上施加压力将第二表面导向第一表面，这可 以被确保。在另一个实施方案中，第一表面被导向第二表面，第二表面被导向第一表面，以减 小微阵列与第二表面之间的距离。下面将描述相对第二表面指导第一表面或相对第一表面指导第二表面的其它实 施方案。该实施方案不仅适合于相对第二表面或检测表面定位第一表面或探针阵列，而且还可以具体来说用于相对于检测表面移动探针阵列。通过这样的运动，可以实现例如反应 室中溶液的搅拌。在一个实施方案中，通过磁场将探针阵列相对于检测表面移动或在室中移动。探 针阵列和/或第二表面可以，例如含有磁性材料或含有其上添加了磁性材料的元件，和/或 固定在完全或部分由磁性材料构成的支架上。在优选情况下还可以通过移动磁体被动地 移动探针阵列和/或第二表面，该磁体安置在相应的表面之下并且例如通过磁场与该表面 相联。在另一个实施方案中，探针阵列通过重力冲击相对于检测平面移动和/或定位。在另一个实施方案中，探针阵列通过反应室中产生的液流相对于检测平面移动和 /或定位。为此，装置可以被开发成例如这样的方式，在探针阵列被液流包围的情况下，在反 应室的一侧产生负压，而在另一侧产生正压，这样就导致探针阵列在反应室中运动。这样的 液流可以例如通过由反应室中局部的温差引起的热对流来产生。在另一个实施方案中，探针阵列通过电场冲击相对于检测平面移动和/或定位。在另一个实施方案中，通过局部过热在探针阵列下产生气泡，由此将芯片在反应 室中移动或导向检测平面。通过在检测前减小微阵列与第二表面之间的距离，在优选情况下样品溶液几乎完 全从微阵列与检测平面之间的区域中除去。因此，由不与阵列表面结合的标记的分子，例如 标记的引物和/或标记的靶核酸引起的背景信号被减小了。因此，在步骤b)的检测中，微阵列与第二表面之间的距离优选通过这样的方式改 变，使得微阵列与第二表面之间的样品溶液基本上被除去。然后微阵列基本上位于检测平 面中，干扰的背景几乎被避免了。在另一个替代实施方案中，微阵列平坦地放置在在装置的原始状态下已经形成检 测平面的第二表面上，并且不仅通过将第一表面导向第二表面和/或将第二表面导向第 一表面而被带入检测平面。在该实施方案中，在处理步骤中微阵列不被样品溶液润湿。为 了进行相互作用反应例如杂交，优选由弹性材料制成的第一表面例如弹性膜被导离检测表 面。因此芯片表面移离检测表面并被样品溶液润湿。相互作用例如杂交可以发生。为了进 行检测和进一步处理，例如以弹性膜形式的第一表面被再次释放，由此跳回至其最初被调 整的位置，这可以通过指导第一表面的工具例如针、杆、螺钉和/或挺杆施加压力来加速。 因此，微阵列可以被再次压向检测平面，检测可以在没有背景的情况下进行。在本发明的另一个实施方案中，使用了上述的本发明的装置，其第一表面被开发 成可以围绕旋转轴旋转的方式。在第一个位置，也被称为起始位置中，安置在第一个侧面部分上的微阵列的表面 基本上均勻地放置在第二表面上，即其上固定有探针分子的底材表面基本上不被样品溶液 润湿。优选情况下，在第一个位置，在第一表面的第二个侧面部分与第二表面之间形成的空 间，处理室中进行反应溶液的处理，即具体来说是纯化、重新浓缩、清洗和漂洗和/或扩增步骤。然后，将可旋转的第一表面带到第二个位置，其中第一表面被排列成相对于第二 表面呈180°以外的角度，优选为45°的角度。优选情况下，这通过使用前述的指导第一表 面的工具在第一表面的第一个侧面部分上施加牵引力和/或在第一表面的第二个侧面部分施加压力来进行。通过将第一表面导向第二个位置，微阵列被导离第二表面，样品溶液渗 入微阵列和第二表面之间形成的空洞。固定在微阵列的底材上的探针分子可以让样品溶液 中存在的靶分子自由接近，从而使探针和靶分子之间的相互作用可以发生。在本发明的方 法的本实施方案中，在第一表面上施加压力和/或牵引力的优点在于，通过这种方式可以 移动样品溶液，从而可以加速相互作用反应。为了进行检测以及任选其它处理，可旋转的第一表面被导离第一个位置，这可以 通过例如在第一表面的第一个侧面部分施加压力和/或在第一表面的第二个侧面部分施 加牵引力，或在第一表面是弹性设计的情况下，通过释放第一个侧面部分来进行。此时，微 阵列又基本上平坦地放置在第二表面上，以便第二表面和微阵列之间的样品溶液在该位置 上被基本上替换，可以产生基本上无背景的检测。被检测的靶可以存在于任何种类的样品中，优选在生物样品中。优选情况下，靶在通过本发明方法检测和定量之前被分离、纯化、复制和/或扩
+曰O本发明的方法还允许在反应室中扩增和定性和/或定量检测核酸，其中分子相互 作用或杂交的检测可以在完成不需要替换样品或反应液体的循环扩增反应之后进行。本发 明的方法也确保了扩增中杂交事件的循环检测，也就是说即使是在循环扩增反应期间也可 以检测杂交。最后，在本发明的方法的帮助下，扩增产物可以在扩增反应过程中和扩增反应 完成后被定量。通常扩增是通过常规的PCR方法或通过平行地实行通过PCR对待分析的靶分子进 行扩增并通过上述的靶分子与物质文库支持物的杂交的方法来进行的。在另一个实施方案中，扩增在两步方法中(也参见WO 97/45559)以多重PCR的形 式进行。在第一步中，通过使用融合引物进行多重PCR，该引物的3’-末端是基因特异性的， 5’_末端代表通用的区域。后者在用于多重反应的所有正向和反向引物中都是相同的。在 第一个阶段中，引物的量是有限的。此时，所有的多重产物可以被扩增直到达到一致的摩尔 量，只要对所有产物来说循环的次数足够达到引物的限制就行。在第二个阶段中，使用了 与融合引物的5’ -区域一致的通用引物。扩增被进行直到获得所需的DNA量。在本发明的方法的另一个优选实施方案中，检测在循环扩增反应期间和/或循环 扩增反应完成之后进行。在优选情况下，检测在扩增反应过程的每个扩增循环中进行。另 外，检测也可以在每两个循环中或每三个循环中或任意间隔中进行。在进行线性扩增反应，其中靶的量随着每一步以某个量增加，或在进行指数扩增 反应，例如PCR，其中DNA靶的量随着每一步相乘增加时，在处理单元中，芯片可以在每个扩 增步骤之后被压向检测平面，从而进行检测。因此，有可能对扩增反应进行在线监测。具体 来说在非线性扩增反应中，因此可能确定DNA靶量的起始浓度。通过这种方式，扩增步骤的数量也可以被在线最适化。只要DNA靶的量达到特定 的浓度，扩增就可以中止。如果起始靶浓度低，循环步骤的次数就被增加以便能够确保进行 产物的分析。在需要减少反应时间的阳性对照的情况下，分析处理可以在非常早就中止。执行扩增反应所需的化学物质，例如聚合酶、缓冲液、氯化镁、标记的引物、具体来 说是荧光标记的引物、dNIPs等，可以被提供到反应室中，例如以冷冻干燥的形式。优选情况下，循环扩增反应是PCR。在PCR中，通常每个PCR循环使用三个温度。
26优选情况下，杂交的核酸在最高的温度即变性温度下从微阵列上解离。变性温度的优选值 是95°C。因此可以在该变性温度下测定杂交信号，作为在相应的PCR循环中被检测的核酸 的零值或参照值。PCR循环中下一个温度是退火温度，为例如大约60°C，在此温度下，有利于被检 测的核酸和固定在微阵列的底材上的核酸之间的杂交。因此，在本发明的方法的一个实施 方案中，存在于PCR循环中的靶核酸的检测在退火温度下进行。为了增加本发明的方法的灵敏度，将温度降低到退火温度以下，以便检测优选在 低于扩增循环的退火温度的温度下进行，可能是有利的。例如，检测可以在25°C到50°C的 温度范围内进行，优选在300C到450C的温度范围内。在本发明的方法的另一个替代实施方案中，被检测的核酸和固定在微阵列底材上 的核酸之间的杂交首先在低温下进行，以便随后升高杂交温度。这样的实施方案的优点在 于，与在高于50°C的温度下进行杂交相比杂交时间缩短了，而不损失相互作用中的特异性。如果从等于或低于退火温度下测定到的测量值中减去在变性温度下测定到的零 值或对照值，可以获得无干扰的测量结果，其中的波动和漂移被消除了。通常被检测的靶分子带有可检测的标记。在本发明的方法中，检测优选通过用至 少一种在步骤b)中检测的标记物标记被结合的靶来进行。正如上面已经提到的那样，与靶或探针偶联的标记物优选是可检测的单元或通过 锚定基团与靶或探针偶联的可检测单元。对于检测或标记的可能性，本发明的方法是相当 灵活的。因此，本发明的方法可以与多种物理、化学或生物化学的检测方法相容。唯一的先 决条件是被检测的单元或结构可以直接偶联或经由能够与寡核苷酸偶联的锚定基团连接 到探针或靶上，例如寡核苷酸上。标记物的检测可以基于荧光、磁性、电荷、质量、亲和性、酶活性、反应性、金标 记等。因此，标记物可以是例如基于使用荧光团标记的结构或成分。在荧光检测的情况 下，标记物可以是能够在分析过程中或之后与靶或探针偶联的任意染料。例如Cy染料 (Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)、Alexa 染料、德克萨斯红、焚光素、若 丹明(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)、类镧族元素钐、镱和铕(EG&G，Wallac， Freiburg，Germany)。在特别优选情况下，该可检测的标记物是荧光标记物。正如上面已经提到的那样， 在本发明的方法中使用本发明的装置确保了利用不带自动聚焦的荧光显微镜、例如具有固 定焦距的荧光显微镜，检测荧光标记物。除了荧光标记物之外，在本发明的范围内发光标记物、金属标记物、酶标记物、放 射性标记物和/或聚合物标记物也可以用作标记和/或检测单元，与靶或探针偶联。同样地，可以通过与标记的报告分子杂交(三明治杂交)来检测的核酸可以用作 标记物(标签)。各种分子生物学检测反应例如引物延伸、连接和RCA被用来检测标签。在本发明的方法的替代实施方案中，可检测的单元通过锚定基团与靶或探针偶 联。优选使用的锚定基团是生物素、地高辛配基等。在后续的反应中，锚定基团通过特异性 结合成分例如链亲和素偶联物或抗体偶联物被转换，而这些偶联物是可以检测的或能够触 发可检测的反应。通过使用锚定基团，锚定基团被转化为可检测的单元可以在加入含有靶 的样品之前、期间或之后进行，或者也可以在切割探针中可以被选择性切割的键之前、期间或之后进行。这些探针中可以被选择性切割的键是例如在国际专利申请WO 03/018838中 描述的那些，其相关的内容在此被明确地引用。根据本发明，标记也可以通过标记的分子与探针分子的相互作用来进行。例如，标 记可以通过用如上述标记的寡核苷酸与寡核苷酸探针或寡核苷酸靶进行杂交来进行。其它适合于本发明的范围的标记方法和检测系统在例如Lottspeich和hrbas， Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Germany 1998, 23. 3 和23. 4章节中有描述。在本发明的方法的优选实施方案中，使用了检测方法，其结果产生了含有特定溶 解性产物的加成物，从而导致沉淀。为了进行标记，使用的具体底物或离析物可以被转化为 几乎不溶的通常被染色的产物。在这种标记反应中，可以使用催化底物转化为几乎不溶的 产物的酶。适合于在阵列元件上产生沉淀的反应以及检测沉淀的可能反应在例如国际专利 申请WO 00/72018和国际专利申请WO 02/(^810中有描述，其相关的内容在此明确地引用。在本发明的方法的特别优选的实施方案中，被结合的靶配备上标记物，催化可溶 的底物或离析物反应形成阵列元件上几乎不溶的沉淀，其中探针/靶相互作用已经发生， 或作为晶核将可溶的底物或离析物转化为阵列元件上几乎不溶的沉淀，其中探针/靶相互 作用已经发生。通过这种方式，使用本发明的方法允许同时定性和定量分析各种探针/靶相互作 用，其中可以使用单个大小小于等于ΙΟΟΟμπκ优选小于等于ΙΟΟμπκ特别优选小于等于 50 μ m的阵列元件。酶法标记物已经知道被使用在基于微量滴定板的免疫细胞化学和免疫学测试中 (参见 E. Lidell 和 I. Weeks，抗体技术，BIOS Scientific Publishers Limited，1995)。因 此，例如，酶催化底物转化为几乎不溶的通常被染色的产物。特别优选情况下，导致沉淀在阵列元件上形成的反应是酶催化的可溶的底物或离 析物转化为几乎不溶的产物。在具体的实施方案中，导致沉淀在阵列元件上形成的反应是 由过氧化物酶催化的3，3' ,5,5'-四甲联苯胺的氧化。优选情况下，辣根过氧化物酶被用于催化3，3' ,5,5'-四甲联苯胺的氧化。但 是，本领域的专业人员将会知道其它的过氧化物酶也可用于3，3' ,5,5'-四甲联苯胺的氧化。据信3，3' ,5,5'-四甲联苯胺在过氧化物酶的催化作用下在第一步反应中 被氧化形成蓝色的自由基正离子(参见例如Gallati和Pracht, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1985，23，8，454)。这种蓝色的自由基正离子通过聚阴离子，例如硫酸葡聚糖以复 合物的形式沉淀。通过过氧化物酶催化3，3' ,5,5'-四甲联苯胺氧化的沉淀反应在例如 EP 0 456 782中有描述。不求全部，下面的表1提供了可能适合于在靶和探针发生相互作用的阵列上引起 沉淀的几种反应的调查报告。表权利要求
1.用于定性和/或定量检测探针分子和样品溶液中靶分子之间的相互作用的系统，包 含用于接收反应室的部件，其中，反应室由第一表面和第二表面之间形成，探针分子被固 定在微阵列上的阵列元件上，该微阵列被放置在第一表面上；以及该微阵列与第二表面之 间的距离是可变的；检测部件，它被构建成当微阵列与第二表面之间的距离减少时能够进 行检测；一种工具，通过该工具可以相对于第二表面指导该微阵列。
2.根据权利要求1中的系统，其中，通过该工具可以相对于第二表面指导该微阵列，这 样让位于微阵列与第二表面之间的样品溶液被实质移出。
3.根据权利要求1或2中的系统，其中，通过该工具可以相对于第二表面指导该微阵 列，这样让该微阵列与第二表面之间的距离在0到Imm的范围内变化。
4.上述权利要求任何一个中的系统，其中的检测部件是光学系统，优选为荧光光学系统。
5.上述权利要求任何一个中的系统，其中检测部件与一个间隔(spacer)连接，当检测 部件放置在第二表面的时候，该间隔可以调节检测部件与第二表面之间的距离。
6.上述权利要求任何一个中的系统，其中检测部件为不是自动聚焦的荧光显微镜或有 固定焦距的荧光微镜。
7.上述权利要求任何一个中的系统，其中用于接收反应室的部件构建成可以用于调节 或配置反应室的位置和精度。
8.上述权利要求任何一个中的系统，其中用于接收反应室的部件构建成用于配置反应 室的位置来从反应室替换溶液或/和给反应室补给溶液。
9.上述权利要求任何一个中的系统，其中用于接收反应室的部件构建成用于配置反应 室的位置来检测反应室里的信号。
10.上述权利要求任何一个中的系统，该体统还包括包温度控制单元和/或温度调节 单元，用于控制和/或调节反应室中的温度。
11.上述权利要求任何一个中的系统，其中可以相对于第二表面指导该微阵列的工具 是通过压缩和/或拉伸作用于第一表面。
12.上述权利要求任何一个中的系统，其中第一表面可以通过该工具设定成振动。
13.权利要求6-12的系统，其中可以相对于第二表面指导该微阵列的工具是通过压缩 和/或拉伸作用于第一表面，第二表面可以相对与第一表面被移动让该微阵列与第二表面 之间的距离是可变的。
14.上述权利要求任何一个中的系统，该系统还包括一个填充反应室的补给元件和/ 或用于纯化或浓缩样品溶液的回收元件，和/或控制反应室中流体卸下或卸进的元件。
15.权利要求14的系统，填充元件具有一个连接反应室的流体截面(afluidic interface)0
16.上述权利要求任何一个中的系统，其中系统还包括读取编码的系统，其中编码为矩 阵和/或条形编码。
17.上述权利要求任何一个中的系统，该系统包括该反应室。
18.上述权利要求任何一个中的系统，其中为第一和第二表面之间形成的反应室提供 侧面限制补偿区，该补偿区在该微阵列与第二表面之间的空间减小时，使反应室中的体积 保持基本恒定。
19.权利要求17或18的系统，其中的第一表面由透明材料制成，优选的为透明塑料制成。
20.权利要求17-19的系统，其中，第一表面至少在该微阵列下方的区域中被构建成可 以相对于第二表面指导该微阵列，以便可以改变该微阵列与第二表面之间的距离，其中第 一表面至少在该微阵列下方的区域为弹性变形的，例如由弹性塑料制成。
21.上述权利要求任何一个中的系统，其中探针分子和/或靶分子是从下面的组中选 择的生物聚合物核酸、肽、蛋白、抗原、抗体、碳水化合物和/或其类似物，和/或上述生物 聚合物的共聚物。
22.定性和/或定量检测探针和靶分子之间的分子相互作用的方法，包括下面的步骤 a)将含有靶分子的探针溶液导入到放置了的微阵列的第一表面与第二表面之间形成的反 应室中；探针分子被固定在该微阵列的阵列元件上，该微阵列被放置在装置的第一表面上； 其中微阵列与第二表面之间的距离可变；b)将反应室导入到一个如权利要求1-21中的系统；c)检测靶分子和固定在该底材上的探针分子之间的相互作用
23.权利要求22的方法，微阵列与第二表面之间的距离被保持在一个位置，这样来促 使被固定在该微阵列的阵列元件上的探针分子与靶分子中的探针的作用。
24.权利要求22或23的方法中，在步骤C中，让微阵列与第二表面之间的距离可变，优 选为减少。
25.权利要求M的方法中，在步骤C中，让微阵列与第二表面之间的距离可变来让位于 微阵列与第二表面之间的样品溶液被实质移出。
26.权利要求22-25的方法中，靶分子被提供一种可检测的标记物质，优选的为荧光标 记物质。
27.权利要求沈的方法中，荧光标记物质被不带有自动聚焦的荧光显微镜影响或者带 有固定焦距的荧光显微镜影响。
28.权利要求22-27的方法中，其中靶分子和或探针分子为核算或核算的类似物质，该 靶分子在反应室中通过循环扩增反应来扩增，其中在一个或几个循环之后和/或循环扩增 反应完成之后进行的检测。
29.权利要求1到23任何一个中的装置的应用，用于进行基于微阵列的测试。
全文摘要
本发明用于定性和/或定量检测探针分子和样品溶液中靶分子之间的相互作用的系统，包含用于接收反应室的部件，其中，反应室由第一表面和第二表面之间形成，探针分子被固定在微阵列上的阵列元件上，该微阵列被放置在第一表面上；以及该微阵列与第二表面之间的距离是可变的；检测部件，它被构建成当微阵列与第二表面之间的距离减少时能够进行检测；一种工具，通过该工具可以相对于第二表面指导该微阵列。
文档编号B01L7/00GK102121054SQ20101058555
公开日2011年7月13日 申请日期2005年5月6日 优先权日2004年5月6日
发明者亚力山大·德沃拉克, 尤金·埃曼特劳特, 托尔斯泰·舒尔茨, 托马斯·乌尔里希, 托马斯·凯泽, 托马斯·艾林格尔 申请人:科隆迪亚戈芯片技术有限公司