一种有机整体小柱的制备及有机整体小柱和应用的制作方法

本发明属于蛋白质组学研究方向磷酸化蛋白质组学技术领域，具体涉及应用于磷酸化蛋白质组样品处理方法。

背景技术：

作为重要的蛋白质翻译后修饰，蛋白质磷酸化在细胞代谢调节中发挥着至关重要的作用。异常的磷酸化修饰与许多疾病过程息息相关，例如恶性肿瘤等。目前基于鸟枪法的蛋白质组学分析策略是磷酸化蛋白质组学研究当中的主要方法。在这种方法中，蛋白质样品首先被酶解为多肽，通过磷酸肽富集之后，进行lc-ms/ms分析。由于磷酸化修饰的高度动态范围、磷酸化蛋白的低丰度以及磷酸化肽段较差的离子化效果，因此，影响整个磷酸化蛋白质组学分析的准确度以及灵敏度的关键步骤就是磷酸肽的特异性富集过程。

目前，固定化金属离子亲和色谱(imac)和金属氧化物亲和色谱(moc)，是两种主要的磷酸肽富集手段，其中要属二氧化钛(tio2)和ti(iv)-imac微球材料应用最为广泛。近些年来，填充离心小柱在微量磷酸化蛋白质组学分析中得到了广泛的应用，这是由于它具有操作自动化、样品损失少和无样品污染等优点。但是，该方法需要在离心小柱的尖端制备额外的塞子来对小柱进行封闭，以防止填充的材料溢出洒落。目前，脱脂棉和c8材料是两种主要用于塞子制备的材料，但是脱脂棉在样品处理过程中易吸收溶液，导致较高的离心负压，而c8材料易产生普通肽段的非特异性吸附(文献1.zhu,j.etal.centrifugationassistedmicroreactorenablesfacileintegrationoftrypsindigestion,hydrophilicinteractionchromatographyenrichment,andon-columndeglycosylationforrapidandsensitiven-glycoproteomeanalysis.anal.chem.84,5146-5153(2012).文献2.zhou,h.；ye,m.etal.robustphosphoproteomeenrichmentusingmonodispersemicrosphere–basedimmobilizedtitanium(iv)ionaffinitychromatography.nat.protoc.8,461-480(2013).)。

因此，基于整体材料的离心小柱因其具有较宽的ph耐受范围以及优良的通透性，在微量样品分析方面引起了人们的关注。krenkova等人制备了基于甲基丙烯酸酯的有机整体小柱，继而使用氧化铁纳米粒子或羟磷灰石纳米粒子进一步修饰整体柱材料的表面(文献3.krenkova,j.etal.nanoparticle-modifiedmonolithicpipettetipsforphosphopeptideenrichment.anal.bioanal.chem.405,2175-2183(2013).)，成功地从α-酪蛋白和β-酪蛋 白的胰酶酶解液中富集出相应的磷酸肽，但是，复杂蛋白质样品的富集实验却没有进行，这极可能是因为该整体柱材料缺乏足够的富集特异性。deng等人利用多巴胺可自聚生成聚多巴胺的性质，在聚多巴胺的邻苯二酚基团上固载ti(iv)离子，从而制备得到了imacziptip整体小柱(文献4.yan,y.h.etal.facilesynthesisofti⁴⁺-immobilizedfe3o4@polydopaminecore-shellmicrospheresforhighlyselectiveenrichmentofphosphopeptides.chem.commun.49,5055-5057(2013).文献5.yan,y.h.；zheng,z.f.etal.hydrophilicpolydopamine-coatedgrapheneformetalionimmobilizationasanovelimmobilizedmetalionaffinitychromatographyplatformforphosphoproteomeanalysis.anal.chem.85,8483-8487(2013).文献6.shi,c.y.；deng,c.h.etal.immobilizedmetalionaffinitychromatographyziptippipettetipwithpolydopaminemodificationandti⁴⁺immobilizationforselectiveenrichmentandisolationofphosphopeptides.talanta143,464-468(2015).)，成功地从人血清样品中富集出四条内源性磷酸肽。但是，文献中报道聚多巴胺缺乏足够的化学稳定性，与此同时，商品化的ziptip小柱价格昂贵，增加了该小柱的使用成本。因此，迄今为止，基于整体柱材料的离心富集小柱还没有在复杂生物样品的磷酸蛋白质组学分析中得到应用。

在发明实现了一种ti(iv)-imac有机整体小柱的制备，并将其用于微量样品的磷酸化蛋白质组学分析，获得了高效的磷酸肽富集效果。该有机整体小柱制备简单，仅需数分钟的自由基聚合反应便可完成；且无需塞子的制备，在很大程度上减少富集材料的准备时间。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、高效的磷酸肽富集技术ti(iv)-imac有机整体小柱，使其适用于微量磷酸化蛋白质组学的研究。

本发明提出的ti(iv)-imac有机整体小柱，具有丰富的富集活性位点以及亲水性的材料表面，可以实现高效的磷酸肽的富集能力；且制备简单、耗时短，可实现磷酸化蛋白质组学的快速分析。

具体步骤如下：

(1)配置甲醇与1,4-丁二醇的混合溶液，其体积比为1:2-2:1；

(2)使用上述步骤(1)得到的甲醇/1,4-丁二醇混合溶液配置二苯甲酮溶液，其质量体积分数为0.05-0.20g/ml；

(3)取上述步骤(2)中得到的二苯甲酮溶液5μl-20μl，加入到20μlgeloadertip枪头(德国eppendorf公司)内，置于紫外发生器(xl-1500a,spectronics公司,newyork,usa)中，于365nm波长紫外光下照射反应5-20分钟；离心去除geloadertip枪头内的二苯甲酮溶液；

(4)重复上述步骤(3)的过程1-4次；

(5)取2μl-4μl聚合液，加入到步骤(4)中准备好的geloadertip枪头内，置于紫外发生器(xl-1500a,spectronics公司,newyork,usa)中， 于365nm波长紫外光下照射反应5-20分钟，得到磷酸基离心小柱；

聚合液溶剂的体积组成为：12％-15％egmp(乙烯基乙二醇甲基丙烯磷酸酯)、40.0-49.0％dmso(二甲基亚砜)、7.0-10.0％dmf(二甲基甲酰胺)、32.0-35.0％十二烷醇；溶质为0.05-0.20g/mlbis(亚甲基双丙烯酰胺)；

(6)配置40-60mg/ml硫酸钛水溶液，加入到上述步骤(5)中制备好的磷酸基离心小柱内，4000-8000g转速下离心反应10-20分钟，弃掉离心分离出的液体，重复上述操作2-4次；

(7)配置洗涤水溶液1，其中，乙腈的体积分数为20-40％、三氟乙酸的体积分数为0.1-0.3％、余量为水，在4000-8000g转速下离心洗涤步骤(6)得到的小柱，弃掉离心分离出的液体；重复上述操作过程4-6次；

(8)配置洗涤水溶液2，其中，氯化钠的摩尔浓度为150-300mm、余量为水，在4000-8000g转速下离心洗涤步骤(7)得到的小柱，弃掉离心分离出的液体；重复上述操作过程4-6次；

(9)用去离子水洗涤上述步骤(8)中的离心小柱，在4000-8000g转速下离心洗涤，弃掉离心分离出的液体；重复上述操作过程4-6次，获得所需产物ti(iv)-imac有机整体小柱。

将上述步骤(9)中准备的ti(iv)-imac有机整体小柱，用于复杂肽段样品富集分析的具体步骤如下：

(1)配置上样缓冲水溶液，其中乙腈的体积分数为70-90％、三氟乙酸的体积分数为5-7％、余量为水；

(2)使用上述步骤(1)中的上样缓冲水溶液，酸化平衡ti(iv)-imac有机整体小柱，离心弃掉其中的液体；重复上述操作过程2-4次；

(3)使用上述步骤(1)中的上样缓冲水溶液与复杂肽段样品混合，其体积比为1:2-2:1，并转移至ti(iv)-imac有机整体小柱内，在4000-8000g转速下离心富集，离心分离出的液体再次转移至ti(iv)-imac有机整体小柱内，重复上述操作过程1-3次；

(4)配置洗涤水溶液1，其中，乙腈的体积分数为40-60％、三氟乙酸的体积分数为5-7％、氯化钠的摩尔浓度为150-300mm、余量为水；在4000-8000g转速下离心洗涤步骤(3)得到的小柱，弃掉洗涤液；重复上述离心洗涤操作过程1-3次；

(5)配置洗涤水溶液2，其中，乙腈的体积分数为20-40％、三氟乙酸的体积分数为0.1-0.3％、余量为水；在4000-8000g转速下离心洗涤步骤(4)得到的小柱，弃掉洗涤液；重复上述离心洗涤操作过程1-3次；

(6)配置洗脱水溶液，其中氨水的体积分数为5-20％、余量为水；在4000-8000g转速下离心洗涤步骤(5)得到的小柱，收集洗脱液；重复上述离心洗脱操作过程1-3次，合并洗脱液得产物。

将ti(iv)-imac有机整体小柱用于磷酸化蛋白质组学快速分析，可获取相应的磷酸肽和磷酸化位点的鉴定结果，该结果可以用于翻译后修饰蛋白 质组学分析。

本发明的优点：

该ti(iv)-imac有机整体小柱具有明显的优点：制备简单、耗时短，磷酸肽富集效率高，可实现磷酸化蛋白质组学的高通量分析。相比较填充小柱，它可以通过光诱导的自由基聚合反应快速制备完成，且无需进行塞子的制备。通过β-酪蛋白和bsa酶解液的磷酸化分析，证实该离心小柱具有优异的富集效率和较高的特异性，而这主要归功于其丰富的富集活性位点和其亲水性的材料表面。将其用于5μghela细胞的磷酸化蛋白质组学分析，共鉴定到1185个高度可信的磷酸化位点，且富集特异性高达92.5％。以上结果证实了ti(iv)-imac有机整体小柱为微量磷酸蛋白组学分析提供了一个强有力的工具。

附图说明

下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1为用于磷酸化蛋白质组学分析的ti(iv)有机整体小柱的制备流程图。每支小柱内加入2μl-4μl聚合液。首先通过自由基聚合反应制得磷酸基有机整体小柱，将其进一步与四价的钛离子螯合，最终制得ti(iv)有机整体小柱。

图2为ti(iv)有机整体小柱的扫描电子显微镜图。(a)图清楚的显示了有机整体柱材料与聚丙烯管壁之间微观形貌。(b)图清楚的显示了微孔结构的形貌。

图3为β-酪蛋白酶解液的malditof-ms分析谱图。(a)是对100fmol酶解液直接进行分析；(b)是对100fmol酶解液富集后进行分析；(c)是对10fmol酶解液富集分析；(d)是对5fmol酶解液富集分析。星号(*)表示磷酸化肽段，井号(#)表示去磷酸化肽段。

图4为β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液混合物的malditofms分析谱图。β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液的摩尔比分别为(a)1:500；(b)1:1000。星号(*)表示磷酸化肽段，井号(#)表示去磷酸化肽段。

图5为hela细胞样品的磷酸化蛋白质组学分析。(a)不同蛋白质上样量下鉴定到的非冗余磷酸肽数目。(b)柱状图为每组样品中鉴定到的单磷酸化肽和多磷酸化肽的比例，点线图为其富集特异性。每一组样品都进行了三次质谱重复实验。误差线指的是标准偏差。

图6为5μghela细胞蛋白质中鉴定到的磷酸化位点的数目。每个蛋白质上样量平行进行了三次技术重复实验。

具体实施方式

实施例1

ti(iv)-imac有机整体小柱的制备过程

如图1所示，使用体积比为1：1的甲醇/1,4-丁二醇溶液配制0.10g/ml二苯甲酮溶液。取10μl二苯甲酮溶液加入到20μlgeloadertip(德国eppendorf公司)内，置于紫外发生器(xl-1500a,spectronics公司,newyork,usa)中，于365nm波长紫外光下照射反应15分钟，待反应结束后，离心去除geloadertip内的二苯甲酮溶液；重复上述操作三次，以充分活化聚丙烯小柱。配制聚合液的组成如下：13.4％egmp(乙烯基乙二醇甲基丙烯磷酸酯)、0.10g/mlbis(亚甲基双丙烯酰胺)、45.0％dmso(二甲基亚砜)、8.3％dmf(二甲基甲酰胺)、33.3％十二烷醇；取3μl聚合液超声脱气10分钟以排除氧气后，加入到上述活化的聚丙烯小柱中，置于365nm波长紫外线下照射反应15分钟。待聚合反应完成后，使用甲醇冲洗有机整体柱材料以除去小柱内未反应的残余物，离心装置是由离心小柱和两个离心管组成，其中一个600μl的离心管用于固定离心小柱的尖端，另一个2ml的离心管用作离心支撑和样品收集。由此，嫁接了磷酸酯有机整体柱材料的聚丙烯小柱制备而成。使用扫描电子显微镜(sem,zeisssupra55,jena,germany)可获取该离心小柱内有机整体柱材料的微观形貌。配制100μl50mg/ml硫酸钛水溶液，加入到上述制备好的磷酸基离心小柱内，5000g转速下离心反应15分钟，弃掉离心分离出的液体，重复上述操作3次，使钛离子与有机整体柱材料上的磷酸基团充分螯合。然后使用洗涤溶水液1(30％acn/0.1％tfa，v/v)，在5000g转速下离心洗涤该小柱至少5次，再用洗涤水溶液2(200mmnacl水溶液)离心洗涤该小柱3次，以充分去除小柱上大大过量的硫酸钛，最后用去离子水洗涤3次以除去上一步洗涤中残留的盐离子。

如图2所示，通过扫描电子显微镜照片，我们可以清楚的看到有机整体柱材料的表面微观形貌。图2.a清楚地显示出了磷酸基有机整体柱材料与聚丙烯表面之间的键和情况，两者之间并没有出现任何空隙，表明磷酸基有机整体柱材料是紧密嫁接于聚丙烯小柱的表面上的。因此，我们可以发现，与填充离心小柱相比，该有机整体小柱可免于塞子制备的困难与烦恼，极大简化了离心小柱的制备过程。与此同时，更大放大倍数的扫描电子显微镜照片(图2.b)展示了有机整体柱材料的微孔形貌。我们可以发现该有机整体柱材料孔径丰富，且多为大孔，其孔径大约为5μm。这种特性使得该有机整体柱小柱在样品的预处理过程可避免出现很高的离心负压；与此同时，其丰富的大孔结构，对应着材料较高的比表面积，可暴露出较多的磷酸基活性基团，也因此可键和较多的钛离子，而这将大大有利于实现高效快速的磷酸肽富集。更为重要的是，该有机整体柱材料化学稳定性高，可耐受强酸、强碱环境，满足磷酸肽富集的要求，因为在磷酸肽富集过程，磷酸肽的富集与洗脱通常是在强酸、强碱性条件下进行的。

ti(iv)-imac有机整体小柱用于磷酸肽富集分析的具体过程

在磷酸肽富集之前，首先使用上样缓冲液(80％acn,6％tfa水溶液)酸化平衡ti(iv)-imac有机整体小柱。首先将蛋白质酶解液与等体积的上样缓冲液(80％acn,6％tfa)混合均匀，并转移至有机整体离心小柱中，在3000g的转速下离心富集30分钟，离心分离出的液体再次转移至ti(iv)-imac有机整体小柱内，重复上述操作过程2次。然后，依次用洗涤水溶液1(50％acn,6％tfa,200mmnacl)和洗涤水溶液2(30％acn,0.1％tfa)分别离心洗涤小柱两次，保持转速为5000g，每次洗涤15分钟，以去除普通肽段的非特异性吸附和洗涤溶液1中的盐离子。最后，使用100μl10％氨水洗脱吸附在小柱上的磷酸化肽段两次，合并洗脱液得产物，室温冻干，保存在-30℃待用。

实施例2

操作过程同上ti(iv)-imac有机整体小柱用于富集分析的具体过程，将制备好的ti(iv)-imac有机整体小柱用于磷酸化蛋白β-酪蛋白的富集分析。将100fmolβ-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液进行磷酸化肽段的富集，待彻底去除材料上的非特异性吸附之后，用10％氨水溶液洗脱磷酸化肽段，取其中的0.5μl洗脱液点到maldi靶片上进行maldi-tofms分析。作为对照实验，没有经过磷酸肽富集步骤的100fmolβ-酪蛋白的胰酶酶解液平行进行maldi-tofms分析。

如图3.a所示，未经过富集步骤的样品的质谱谱图中，高强度的非磷酸肽段峰占据了整个谱图，无法准备辨别出其磷酸肽的信号峰，这说明大量存在的非磷酸化肽段严重抑制了磷酸化肽段的离子化。但是，与之相反的，经过ti(iv)-imac有机整体小柱富集以后，谱图中只出现了清晰的磷酸肽及其去磷酸化对应物的质谱峰，非磷酸化肽段的信号峰几乎全部消失(图3.b)，这证明了ti(iv)-imac有机整体小柱的高效富集能力。在此基础之上，我们进一步考察了该有机整体小柱对β-酪蛋白酶解液的检测灵敏度，如图3.c和3.d所示，该有机整体小柱可以成功富集到10fmol和5fmolβ-酪蛋白酶解液中的磷酸肽，表明该小柱可实现fmol级别的样品分析。

实施例3

操作过程同上ti(iv)-imac有机整体小柱用于磷酸肽富集分析的具体过程，将β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液以不同摩尔比(500:1和1000:1，mol/mol)混合来模拟复杂样品，进一步评估ti(iv)-imac有机整体小柱的 特异性。

如图4所示，在非磷酸化肽段(bsa酶解液)大大过量的条件下，maldi谱图中只出现了清晰的磷酸肽及其去磷酸化对应物的质谱峰，即使当β-酪蛋白酶解液和bsa酶解液的摩尔比达到1000:1时，非磷酸化肽段的干扰信号依然不明显，这证明了ti(iv)-imac有机整体小柱的高富集特异性。

实施例4

操作过程同上ti(iv)-imac有机整体小柱用于磷酸肽富集分析的具体过程，将其用于实际样品hela细胞样品的富集分析。运用ti(iv)-imac有机整体小柱分别富集分析一系列不同质量的hela细胞蛋白酶解液，分别是10μg，25μg，50μg以及100μg，将富集到的磷酸肽样品进行lc-ms/ms分析。

图5.a给出了每个样品中分别鉴定到的非冗余磷酸肽的数目。从10μghela细胞蛋白质中可以鉴定到约1300个非冗余磷酸化肽段，随着样品检测质量的增加，鉴定到的磷酸肽的数量也随之增加，25μghela细胞蛋白质中鉴定到约2000个非冗余磷酸化肽段，50μghela细胞蛋白质中鉴定到约2300个，最终，在100μg上样量时，磷酸肽的鉴定数目达到了稳定状态，同样可鉴定到约2300个非冗余磷酸化肽段。这表明了ti(iv)-imac有机整体小柱高效的富集能力，完全可以应用于实际生物样品的磷酸化蛋白质组学分析。

进一步统计每组样品中分别鉴定到的单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的比例。如图5.b所示，当上样量是10μg和25μg时，单磷酸化肽段的比例都为75％左右，而当上样量增加到50μg和100μg时，单磷酸化肽段的比例显著降低到50％左右。这是因为当样品的上样量较少时(10μg)，该有机整体小柱具有足够的富集容量去同时吸附单磷酸化肽段和多磷酸化肽段。然而，随着上样量的增加，富集材料逐渐达到了其饱和的状态，同时由于其有限的富集容量，单磷酸化肽段和多磷酸化肽段之间就会出现竞争吸附。显而易见的是，多磷酸化肽段由于包含有多个磷酸根，因此与吸附材料上的钛离子的结合能力较强，从而可以被富集材料优先选择性地富集。因此，我们可以发现ti(iv)-imac有机整体小柱在25μghela细胞蛋白的上样量时达到饱和，当上样量增至50μg和100μg时，该有机整体小柱已经处于过饱和的状态。因此该ti(iv)-imac有机整体小柱的富集容量为25μg。

该ti(iv)-imac有机整体小柱的富集特异性也同时证明了这一点。当蛋白质样品量为10μg时，富集特异性高达95％；当样品上样量增加到25μg和50μg时，吸附特异性小幅下跌，但依然高达90％左右，这主要是得益于该材料较高的富集效率，但是当蛋白质样品量激增至100μg时，富集特异性则显著降低到只有75％左右。再一次证明了该ti(iv)-imac有机整体小柱的富集容量为25μg。

实施例5

操作过程同上ti(iv)-imac有机整体小柱用于磷酸肽富集分析的具体过程，ti(iv)-imac有机整体小柱用于微量样品的分析。对5μghela细胞蛋白酶解液进行富集分析，将得到的磷酸肽样品通过自动进样器上样至质谱仪进行分析检测，同时进行三次技术重复试验。

图6给出了每次实验中所鉴定到非冗余的磷酸化位点数目。三次技术重复实验中，分别从5μghela细胞蛋白中鉴定到1087，1043和1060个非冗余磷酸化位点，其中分别有802，767和772个位点是高度可信的磷酸化位点(classi，即localizationprobability>0.75，scoredifference>5)。这是目前文献报道中，从5μg复杂细胞样品中，结合自动进样的标准lcms/ms分析方法，鉴定到的最好结果。其对磷酸肽的富集特异性是92.7％(rsd＝0.2％)。如此之高的富集特异性也同时表明了该有机整体小柱的高效富集能力。

本发明为一种ti(iv)-imac有机整体小柱的制备，并将其用于微量生物样品的磷酸化蛋白质组学分析。该有机整体柱材料是聚甲基丙烯酸酯类高聚物，含有丰富的孔结构，比表面积高，钛离子的富集活性位点多；与此同时，由于其亲水性的材料表面，在磷酸肽富集方面展现出了强大的富集能力。将其用于5μghela细胞的磷酸化蛋白质组学分析，平均鉴定到了超过1000个以上的非冗余磷酸化位点，且富集特异性高达92.5％。更重要的是，该ti(iv)-imac有机整体小柱制备简单，相比较填充小柱，它可以通过光诱导的自由基聚合反应仅需数分钟就制备完成；且无需进行塞子的制备，在很大程度上减少富集材料的准备时间。