一种树枝状金铂合金纳米颗粒模拟酶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种金铂合金纳米颗粒模拟酶及其制备方法和应用，属于催化材料和分析化学领域。

背景技术：

天然酶凭借其高选择性和高效催化活性的特点，在生物化学领域及食品、农业、化工等方面发挥着重要的作用。但是天然酶的活性容易被温度、化学环境(如pH值)等许多因素影响而变性，加之复杂的纯化步骤和高昂的价格，都限制着天然酶的应用。这驱使着众多学者将工作重点放在寻找与天然酶一样的具有高效催化活性但是更加稳定的催化剂，称之为人工模拟酶。

近年来，各种类型的纳米结构被发现具有类似天然酶的催化特点。自从中科院生物物理研究所阎锡蕴小组首次报道四氧化三铁纳米颗粒具有类过氧化物酶的催化活性(L.Z.Gao,J.Zhuang,L.Nie,J.B.Zhang,Y.Zhang,N.Gu,T.Wang,J.Feng,D.L.Yang,S.Perrett，X.Y.Yan，NatureNanotechnology，2007，2，577-583)，氧化铈、氧化钴、硫化铜、氧化石墨烯、金、铂等纳米材料相继也被发现具有类似过氧化物酶、类氧化酶、类过氧化氢酶等特征。这些纳米颗粒由于制备方法简单、价格低廉，并且催化活性对苛刻环境的耐受性较强，成为一类新型的纳米结构模拟酶。由于独特的催化特征，纳米结构模拟酶在生物检测和免疫分析等领域表现出重要的应用价值。

贵金属纳米材料(如金、银、铂、钯)对不同的反应体系表现出独特的催化能力，在电催化、化学化工和生物传感等领域都有广泛的应用。

技术实现要素：

本发明目的之一是提供一种树枝状金铂合金纳米颗粒模拟酶，它同时具有类氧化物酶和类过氧化物酶活性的特征，并且活性可调，可用作氧化物模拟酶和过氧化物模拟酶；本发明目的之二是提供基于金铂合金纳米颗粒类氧化酶比色检测硫氢根离子的方法，该方法可用于测定硫氢根离子。

采用的技术方案如下：

树枝状金铂合金纳米颗粒模拟酶，其金铂合金纳米颗粒形貌呈树枝状多孔结构，合金组成Pt/Au摩尔比例介于0.33至6之间，平均粒径在20nm-40nm。

上述模拟酶的制备方法，包括以下步骤：

将氯金酸和氯铂酸钾在水中混合，加入抗坏血酸(AA)振荡摇匀，25-35℃恒温反应4～5h，反应结束后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，所得沉淀物离心、洗涤、分散于去离子水中，得到金铂合金纳米粒子模拟酶溶液。

按上述方案，金与铂元素的物质的量之比为3:1～1:10。

按上述方案，抗坏血酸摩尔量为金、铂元素摩尔量之和的2～10倍。

按上述方案，反应温度为30℃，反应时间为4.5h。

按上述方案，抗坏血酸浓度为0.1M。

按上述方案，十六烷基三甲基溴化铵浓度为0.1M。

按上述方案，离心时转速为12000rpm/min，时长5-10min。

上述模拟酶作为氧化物模拟酶和过氧化物模拟酶的应用。

树枝状金铂合金纳米颗粒模拟酶作为氧化酶和过氧化物模拟酶可以分别在有和没有过氧化氢时与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)发生显色反应，由无色变为蓝色，同时具有类氧化物酶和类过氧化物酶活性的特征，可用作氧化物模拟酶和过氧化物模拟酶，并且其催化活性强烈依赖于金铂合金的铂/金比例；

金铂纳米颗粒模拟酶溶液类氧化酶活性特征的比色测定步骤如下：

取3.0ml去离子水，依次向其中加入20μl 20mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和25μl0.8mM金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液，然后将上述溶液混合均匀，所述混合溶液中金铂合金纳米颗粒模拟酶与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的物质的量比为1:20。室温(25℃)下放置10-25分钟后，即可观察到溶液从无色变为蓝色，这些表明金铂合金纳米颗粒模拟酶对水溶液中的溶解氧氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺有很高的催化氧化活性，表明本发明的金铂合金纳米颗粒模拟酶具有类似氧化酶的特征，可作为氧化酶模拟酶。

金铂纳米颗粒模拟酶溶液类过氧化酶活性特征的比色测定步骤如下：

取3.0ml去离子水，依次向其中加20μl 20mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、20μl 0.1M H₂O₂和25μl 0.8mM金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液，然后将上述溶液混合均匀，所述混合溶液中金铂合金纳米颗粒模拟酶、过氧化氢与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的物质的量比为1:100:20。室温(25℃)下放置10-25分钟后，即可观察到溶液从无色变为蓝色，这些表明金铂合金纳米颗粒模拟酶对过氧化氢氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺有很高的催化活性，表明本发明的金铂合金纳米颗粒模拟酶具有类似过氧化物酶的特征，可作为过氧化物模拟酶。

上述模拟酶比色检测硫氢根离子浓度高低的应用。

本发明目的之二是利用硫氢根离子对金铂合金纳米颗粒模拟酶的抑制作用实现对硫氢根离子的比色检测，利用金铂纳米颗粒模拟酶溶液对硫氢根离子的比色测定步骤如下：

取3.0ml去离子水，依次向其中加20μl 20mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、25μl 0.8mM金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液和浓度为(0.83-10×10^-6mM)的硫氢化钠溶液，然后将上述溶液混合均匀；通过比色法或紫外可见吸收光谱实现对硫酸根离子的检测。由于硫氢根离子对金铂合金纳米颗粒模拟酶催化活性的抑制作用，可以观察到溶液颜色随着硫氢根离子浓度升高，溶液颜色由深蓝逐渐变浅，实现对硫氢根离子的比色检测。

本发明相对于现有技术，有益效果如下：

通过共还原方法制备了金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液，该方法操作简单、高效、重复性高、并且反应条件温和，所用试剂无毒，反应中产生的产物和副产物也对环境友好。

所得金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液在过氧化氢存在和不存在的情况下对有机底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺都有很高的氧化催化活性，表现出类似过氧化物酶和氧化酶的活性特征。

所得金铂合金的类酶催化活性强烈依赖于Pt/Au比，依此可实现对其模拟酶催化活性的调控。

所得金铂合金纳米颗粒模拟酶在强酸、强碱、高盐浓度以及高温条件下都有很高的化学稳定性，作为一种新颖模拟酶在免疫分析、生物检测及临床诊断等领域都有潜在的应用价值。

附图说明

图1：不同比例金铂合金纳米颗粒和铂纳米颗粒的透射电镜照片；

图2：不同比例金铂合金纳米颗粒模拟酶催化TMB氧化的紫外吸收光谱图。

图3：不同比例金铂合金纳米颗粒类氧化酶催化TMB氧化反应的动力学曲线。

图4：不同比例金铂合金纳米颗粒类过氧化酶催化TMB氧化反应的动力学曲线。

图5：不同比例金铂合金纳米颗粒类氧化酶和类过氧化物酶活性对比曲线。

图6：不同比例金铂合金纳米颗粒测定硫氢根离子的浓度-显色速率变化曲线。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明举例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

Au纳米颗粒模拟酶的制备：

取2mL去离子水，向其中加入16.7μL浓度为24mM的四氯金酸水溶液和抗坏血酸溶液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴锅中反应4.5小时。反应结束后加入0.1ml浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化水溶液(配制后置于30℃恒温中)，去离子水洗涤定容得到金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液。所述溶液中的氯金酸和抗坏血酸的物质的量比＝0.4:4。所述金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液的浓度为0.8mM。

实施例2

Au₃Pt₁合金纳米颗粒模拟酶的制备(Pt/Au比为0.33)：

取2mL去离子水，向其中加入12.5μL浓度为24mM的四氯金酸水溶液、5.89μL浓度为17mM的氯铂酸钾水溶液和抗坏血酸溶液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴锅中反应4.5小时。反应结束后加入0.1ml浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化水溶液(配制后置于30℃恒温中)，去离子水洗涤定容得到金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液。所述溶液中的氯金酸、氯铂酸钾、抗坏血酸的物质的量比＝0.3:0.1:4。所述金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液的浓度为0.8mM。

实施例3

Au₁Pt₁合金纳米颗粒模拟酶的制备(Pt/Au比为1)：

取2mL去离子水，向其中加入8.3μL浓度为24mM的四氯金酸水溶液、17.7μL浓度为17mM的氯铂酸钾水溶液和抗坏血酸溶液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴锅中反应4.5小时。反应结束后加入0.1ml浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化水溶液(配制后置于30℃恒温中)，去离子水洗涤定容得到金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液。所述溶液中的四氯金酸、氯铂酸钾、抗坏血酸的物质的量比＝0.2:0.2:4。所述金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液的浓度为0.8mM。

实施例4

Au₂Pt₃合金纳米颗粒模拟酶的制备(Pt/Au比为1.5)：

取2mL去离子水，向其中加入6.67μL浓度为24mM的四氯金酸水溶液、14.1μL浓度为17mM的氯铂酸钾水溶液和抗坏血酸溶液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴锅中反应4.5小时。反应结束后加入0.1ml浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化水溶液(配制后置于30℃恒温中)，去离子水洗涤定容得到金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液。所述溶液中的四氯金酸、氯铂酸钾、抗坏血酸的物质的量比＝0.16:0.24:4。所述金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液的浓度为0.8mM。

实施例5

Au₁Pt₃合金纳米颗粒模拟酶的制备(Pt/Au比为3)：

取2mL去离子水，向其中加入4.17μL浓度为24mM的四氯金酸水溶液、17.6μL浓度为17mM的氯铂酸钾水溶液和抗坏血酸溶液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴锅中反应4.5小时。反应结束后加入0.1ml浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化水溶液(配制后置于30℃恒温中)，去离子水洗涤定容得到金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液。所述溶液中的四氯金酸、氯铂酸钾、抗坏血酸的物质的量比＝0.1:0.3:4。所述金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液的浓度为0.8mM。

实施例6

Au₁Pt₆合金纳米颗粒模拟酶的制备(Pt/Au比为6)：

取2mL去离子水，向其中加入2.38μL浓度为24mM的四氯金酸水溶液、20.17μL浓度为17mM的氯铂酸钾水溶液和抗坏血酸溶液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴锅中反应4.5小时。反应结束后加入0.1ml浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化水溶液(配制后置于30℃恒温中)，去离子水洗涤定容得到金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液。所述溶液中的四氯金酸、氯铂酸钾、抗坏血酸的物质的量比＝0.057:0.343:4。所述金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液的浓度为0.8mM。

实施例7

Pt纳米颗粒模拟酶的制备：

取2mL去离子水，向其中加入23.5μL浓度为17mM的氯铂酸钾水溶液和抗坏血酸溶液，振荡摇匀后置于30℃恒温水浴锅中反应4.5小时。反应结束后加入0.1ml浓度为0.1M十六烷基三甲基溴化水溶液(配制后置于30℃恒温中)，去离子水洗涤定容得到金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液。所述溶液中的氯铂酸钾和抗坏血酸的物质的量比＝0.4:4。所述纯铂纳米颗粒模拟酶溶液的浓度为0.8mM。

附图1为实施例中不同Pt/Au比例的金铂合金纳米结构的透射电子显微镜图。纯Au为形貌不规则且表面比较光滑的纳米球形颗粒(图1a)，随着Pt²⁺的加入，在Pt/Au比为0.33时，颗粒表面变得凹凸不平(图1b)，当Pt/Au比为1时，可以看出，有枝状颗粒生成(图1c)，逐渐增大Pt/Au比，当Pt/Au＝3(图1d)，Pt/Au＝6(图1e)时，树枝状形貌越来越明显，且多孔结构也变得比较清晰，尤其是Pt/Au为6时，这种多孔树枝形貌变得更加紧密，与纯Pt(图1f)形貌接近。AuPt纳米颗粒粒径越来越均匀。我们对AuPt纳米颗粒粒径做了统计，Pt/Au比例越大，颗粒粒径就越大，粒径变化从20nm到40nm。当Pt/Au比例为1时，金铂合金纳米颗粒的尺寸粒径为23.6±2.3nm。

金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液的类酶活性的比色测定步骤如下：

类氧化酶特征测试：取3.0ml去离子水，依次向其中加入20μl 20mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和25μl 0.8mM金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液(实施例1～6制得)，然后将上述溶液混合均匀，所述混合溶液中金铂合金纳米颗粒模拟酶与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的物质的量比为1:20；室温(25℃)下放置10-25分钟后，即可观察到溶液从无色变为蓝色，这些表明金铂合金纳米颗粒模拟酶对水溶液中的溶解氧氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺有很高的催化活性，表明本发明的金铂合金纳米颗粒模拟酶具有类似氧化酶的特征，可作为氧化酶模拟酶。

类过氧化物酶特征测试：取3.0ml去离子水，依次向其中加入20μl 20mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、20μl 0.1M H₂O₂和25μl 0.8mM金铂合金纳米颗粒模拟酶溶液(实施例1～7制得)，然后将上述溶液混合均匀，所述混合溶液中金铂合金纳米颗粒模拟酶、过氧化氢与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的物质的量比为1:100:20；室温(25℃)下放置10-25分钟后，即可观察到溶液从无色变为蓝色，这些表明金铂合金纳米颗粒模拟酶对过氧化氢氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺有很高的催化活性，表明本发明的金铂合金纳米颗粒模拟酶具有类似过氧化物酶的特征，可作为过氧化物模拟酶。

附图2为不同合金比例的金铂纳米颗粒模拟酶催化TMB氧化的紫外吸收光谱图。从图中可以看出，不同合金比例金铂纳米颗粒(Pt/Au＝0.33,1,3,6)在TMB水溶液中15min时的吸收光谱变化。与催化剂空白相比，Pt/Au＝0.33时650nm处TMB氧化产物的特征吸收峰逐渐出现。而随着Pt/Au比增大时至1、3或6时，颜色也随之加深，650nm处TMB氧化产物的特征吸收峰显著增强，与吸收光谱相对应。

图3和4分别为等量的各不同比例合金纳米颗粒在有和没有过氧化氢存在时催化TMB氧化在650nm处的吸光度变化。当Pt/Au比例逐渐增大时，金铂合金纳米颗粒的类氧化酶和类过氧化物酶催化活性都逐渐增强。无论是在水溶液或者含过氧化氢的水溶液中进行，TMB的氧化速率都与Pt/Au比呈正比。

图5是在有或无过氧化氢时TMB氧化的反应速率，反应速率与AuPt合金成分之间呈线性关系，反应速率随着Pt/Au比增大而增大，在仅仅加入0.67mM H₂O₂时TMB氧化的反应速率就是没有H₂O₂的两倍。这些结果表明，我们可以通过改变金铂合金成分来调节其类酶催化能力。

基于金铂合金纳米颗粒类氧化酶比色检测硫氢根离子，其步骤在于：

1)将实施例4所配制的Pt/Au比为1.5的合金纳米颗粒模拟酶与TMB溶液混合，用紫外可见吸收光谱仪扫描动力学模式每隔2min记录一次溶液的吸收曲线，记录650nm处特征吸收峰的吸光度，通过吸光度随时间的变化来监测和计算TMB的氧化速度。

2)将实施例3所配制的Pt/Au比为1.5的合金纳米颗粒模拟酶与TMB溶液混合后，分别加入0.83、1.66、3.33、10μM的硫氢化钠溶液，用紫外可见吸收光谱仪扫描动力学模式每隔2min记录一次溶液的吸收曲线，记录650nm处特征吸收峰的吸光度，通过吸光度随时间的变化来监测和计算TMB的氧化速度。

基于铂纳米颗粒类氧化酶比色检测硫氢根离子，其步骤在于：

3)将实施例7所配制的铂纳米颗粒模拟酶与TMB溶液混合，用紫外可见吸收光谱仪扫描动力学模式每隔2min记录一次溶液的吸收曲线，记录650nm处特征吸收峰的吸光度，通过吸光度随时间的变化来监测和计算TMB的氧化速度。

4)将实施例7所配制的铂纳米颗粒模拟酶与TMB溶液混合后，分别加入3.3、6.7、16.6、33μM的硫氢化钠溶液，用紫外可见吸收光谱仪扫描动力学模式每隔2min记录一次溶液的吸收曲线，记录650nm处特征吸收峰的吸光度，通过吸光度随时间的变化来监测和计算TMB的氧化速度。

附图6所示为不同HS-浓度分别对Pt和AuPt纳米颗粒对相同浓度的TMB氧化催化速率的影响。发现Pt和AuPt合金都有相同的特点：HS-浓度越高，TMB氧化速率就越低。值得注意的是，Au的加入使AuPt合金化，其对HS-的监测的能力与纯Pt不同。AuPt合金对HS-的监测比Pt慢4倍，0.83μM SH-可以几乎完全抑制金铂合金纳米颗粒对TMB氧化的催化，而纯Pt抑制TMB氧化需要3.3μM。相比之下，Pt纳米颗粒(3.3μM到33μM)比金铂合金合金(0.83μM到10μM)对HS-的检测有更广泛的线性范围。这些结果表明，我们可以通过改变合金成分来优化AuPt合金对类酶催化活性和抑制剂的灵敏度。

由上可知，本发明制备的树枝状金铂合金纳米颗粒溶液，具有类似过氧化物酶和类似氧化酶的催化功能，可作为一种新颖的过氧化物模拟酶和氧化物模拟酶，基于其类酶催化特征，本发明提供了硫氢根离子的比色测定方法。本发明制备的金铂合金纳米颗粒模拟酶可代替过氧化物酶和氧化酶在免疫分析、生物检测和临床诊断等领域取得广泛的应用前景，此外，本发明的金铂合金纳米颗粒模拟酶的制备，方法简单、快速、绿色无污染且成本低廉。