一种利用5‑磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种将5-磷酸吡哆醛用于制备固定金属亲合材料的方法，及其在样品前处理中的应用。

背景技术：

蛋白质磷酸化是一种可逆的转录后修饰，在各种生理功能中都有重要的作用。目前，质谱技术由于其高灵敏度、高通量被广泛用于磷酸化多肽的研究中。然而由于磷酸化蛋白在生物样品里的含量低，并且磷酸化多肽在质谱中的离子化效率比非磷酸化多肽要低，使得我们难以对其进行直接分析。因此，在质谱分析前对样品中的磷酸化多肽进行富集显得十分重要。

固定金属亲合色谱(immobilizedmetalaffinitychromatography，imac)作为一种快速、简单易用和经济的纯化技术，近年来被研究者广泛应用于磷酸化肽的富集。其基本原理是将金属离子固定于一定的配体上，然后利用金属离子与磷酸根基团之间的配位作用来萃取磷酸化多肽。吸附到材料上的磷酸化多肽可以通过磷酸盐或者碱性溶液解吸下来。其中，研究最多的配体为亚氨基二乙酸(ida)、次氮基三乙酸(nta)和磷酸根基团等，且磷酸根基团修饰的多孔硅胶比传统的imac材料体现出更好的选择性。因此，在接下来的几年中，人们制备了一系列含磷酸根基团的材料，并将其用于复杂生物样品中磷酸化多肽的分离和富集，然而，在制备含磷酸根基团的材料的过程中，经常需要用到一些毒性较大的试剂，并且合成过程较为复杂。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的不足，本发明引入一种新的配体—5-磷酸吡哆醛(pyridoxal5′-phosphate,plp)，它是维生素b6在体内的活性型代谢产物，且具有双功能反应基团，分别是醛基和磷酸根。

本发明提供的技术方案具体如下：

一种固定金属亲合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将活化过的纳米材料y分散在乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷进行搅拌，得到氨基修饰的纳米材料y，即y-nh2；所述的纳米材料y为纳米sio2、fe3o4@sio2纳米微球或碳纳米管；

(2)向步骤(1)得到的y-nh2中加入ph＝7.4的磷酸缓冲液，然后加入5-磷酸吡哆醛和nabh3cn，室温反应，y-nh2表面被磷酸根修饰，将所得固体产物清洗后室温干燥，得到y-nh2-plp；

(3)向金属盐溶液中加入y-nh2-plp，室温震荡5-10h，所得固体产物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金属亲合材料，即y-nh2-plp-mⁿ⁺。

所述步骤(1)中，纳米sio2或fe3o4@sio2纳米微球的活化方式为：将纳米sio2或fe3o4@sio2纳米微球分散在盐酸中室温静置0.5h以上；碳纳米管的活化方式为：将碳纳米管分散在浓硫酸、浓硝酸体积比为3:2的混合液中50℃搅拌20h以上。

所述步骤(1)中，纳米sio2或fe3o4@sio2纳米微球与3-氨丙基三乙氧基硅烷一起进行搅拌的温度为室温；碳纳米管与3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)一起进行搅拌的温度为70℃。

所述步骤(2)中，固体产物的洗涤方式为：依次用乙醇、二次水和丙酮清洗。

步骤(2)中，所述的金属盐为硫酸钛、氯化镓、氯化铁中的一种。

一种固定金属亲合材料，由上述制备方法制备得到。

上述固定金属亲合材料在样品前处理中的应用。

本发明的原理如下：

本发明通过席夫碱反应在氨基化纳米材料(y)表面修饰磷酸根基团，得到y-nh2-plp；继而在磷酸根基团上修饰金属离子，得到y-nh2-plp-mⁿ⁺固定金属亲和色谱(immobilizedmetalaffinitychromatography，imac)吸附剂，该吸附剂的螯合剂为5-磷酸吡哆醛。

本发明通过改变纳米材料y，分别选择二氧化硅(sio2)，氧化碳纳米管(ocnt)和包硅磁颗粒(fe3o4@sio2)制备了三种不同基地材料的y-nh2-plp(y＝sio2、ocnt或fe3o4@sio2)。

本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明的修饰方法简单、省时，且不会破坏基底材料的形貌特征，而且该修饰对基底材料进行功能化，增加了基底材料的实用性。

(2)本发明制备的固定金属亲合材料y-nh2-plp-mⁿ⁺可作为imac吸附剂，利用金属离子与磷酸根的亲和作用，应用于生物样品中磷酸化肽的选择性富集，成功地应用于标准多肽混合液、牛奶酶解液、人类血清样品、鼠脑裂解液中磷酸化多肽的萃取等领域。

附图说明

图1为y-nh2-plp-mⁿ⁺(以fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺为例)制备的流程图。

图2为β-酪蛋白和牛血清蛋白(bsa)酶解混合液(1:500)的质谱图；其中，图2(a)表示直接分析；图2(b)表示经过fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；图2(c)表示经过sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；图2(d)表示经过cnt-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；磷酸化多肽用其m/z值标记。

图3为β-酪蛋白和牛血清蛋白(bsa)酶解混合液(1:500)的质谱图；其中，图3(a)表示经过fe3o4@sio2-nh2-plp-ga³⁺萃取后；图3(b)表示经过fe3o4@sio2-nh2-plp-fe³⁺萃取后；磷酸化多肽用其m/z值标记。

图4为β-酪蛋白和bsa酶解混合液(1:1000)的质谱图；其中，图4(a)表示直接分析；图4(b)表示经过fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后；磷酸化多肽用其m/z值标记。

图5为血清和脱脂牛奶酶解液的质谱图；其中，图5(a)表示直接分析的血清样品；图5(b)表示fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后的血清样品；图5(c)表示直接分析的脱脂牛奶酶解液样品；图5(d)表示fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺萃取后的脱脂牛奶酶解液样品。

图6为鼠脑裂解液中磷酸化多肽的情况分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明，并不能限制本发明的范围。

实施例1

首先制备氨基修饰的纳米材料，得到y-nh2；再将5-磷酸吡哆醛接到y-nh2上，得到表面修饰磷酸根的y-nh2-plp；最后在磷酸根上固载金属离子，得到y-nh2-plp-mⁿ⁺。

1.氨基修饰的纳米材料(y-nh2)的制备，根据纳米材料不同，其制备方法如下：

①sio2-nh2的制备：将0.5g纳米sio2分散在25ml1m的hcl水溶液中活化30min；经水及乙醇清洗后，将其分散在50ml乙醇中；在上述悬浮液中加入2mlaptes，室温下搅拌3h，得到氨基键合硅胶纳米颗粒。

②fe3o4@sio2-nh2的制备：将2.0gfecl2·4h2o和5.4gfecl3·6h2o溶解在2mhcl水溶液中，通入氮气除去溶解氧，然后加入30ml浓氨水(25wt％)，搅拌30min，得到fe3o4纳米颗粒；将fe3o4纳米颗粒经反复磁分离及水洗后，分散于50ml水中待用。

取5mlfe3o4纳米颗粒悬浮液，用乙醇清洗后，分散于40ml乙醇中，并超声1h；之后加入1.5ml浓氨水，6ml水以及1.5mlteos，并在40℃下搅拌2h。最后所得的fe3o4@sio2纳米颗粒经去离子水及乙醇清洗后，置于60℃真空干燥箱中烘干待用。将0.5gfe3o4@sio2分散在25ml1m的hcl水溶液中活化30min；经水及乙醇清洗后，将其分散在50ml乙醇中；在上述悬浮液中加入2mlaptes，并在室温下搅拌3h，得到氨基键合硅胶纳米颗粒。

③ocnt-nh2的制备：将碳纳米管(cnt)分散于300ml浓硫酸、浓硝酸体积比为3:2的混合液中，在50℃搅拌20h，然后将所得溶液过滤，并用水和丙酮清洗，在100℃真空条件下干燥24h，将所得产物氧化碳纳米管(ocnt)分散于50ml乙醇中，超声30min。随后加入2mlaptes于70℃搅拌4h，得到氨基键合的氧化碳纳米管，即ocnt-nh2。

2.y-nh2-plp的制备：称取0.4gy-nh2于50ml圆底烧瓶中，加入40ml0.1m的磷酸缓冲液(ph7.4)，再加入0.2gplp和0.2g氰基硼氢化钠(nabh3cn)，25℃反应5h。产物依次用乙醇、二次水和丙酮清洗，室温干燥过夜，即得到y-nh2-plp。

3.y-nh2-plp-mⁿ⁺的制备：配制三份硫酸钛水溶液(0.1m)20ml，分别加入0.2gy-nh2-plp；分别配制氯化镓水溶液(0.1m)、氯化铁水溶液(0.1m)各20ml，分别向这两份溶液中加入0.2gfe3o4@sio2-nh2-plp，室温震荡5h，产物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金属亲合材料，即y-nh2-plp-mⁿ⁺。

实施例2

为了考察三种不同纳米材料修饰钛离子(y-nh2-plp-ti⁴⁺)对磷酸化肽的萃取效果，从而选出一种最优的基底材料，我们比较了三种y-nh2-plp-ti⁴⁺(y＝sio2、ocnt或fe3o4@sio2)在β-酪蛋白和bsa酶解混合液中对磷酸化多肽的萃取效果：

将β-酪蛋白用100mmtris-hcl(ph＝8.5)缓冲液配制成浓度为1mg/ml的溶液；在上述溶液中按照酶与底物比为1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反应16h。酶解后的多肽产物经真空离心浓缩仪抽干后存放在-20℃的冰箱中备用。

称取1mgbsa溶于100μl含8m尿素及100mmtris-hcl的变性缓冲液(ph＝8.5)中，然后加入5μl100mm三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐溶液(三羧甲基磷酸，tcep)，并在室温下反应20min以还原蛋白质中的二硫键，继续加入5μl100mm碘乙酰胺(iaa)溶液，并在避光条件下，室温下反应30min使被还原的巯基烷基化。经还原及烷基化的蛋白质用300μl100mmtris-hcl(ph8.5)稀释后，按照酶与底物比为1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反应16h。酶解后的多肽产物抽干后存放在-20℃的冰箱中备用。

为了比较基于三种不同基底材料y-nh2-plp-ti⁴⁺(y＝sio2、ocnt或fe3o4@sio2)对磷酸化肽段的富集能力，将磷酸化蛋白(β-酪蛋白)与非磷酸蛋白(bsa)酶解产物的混合物作为分析物(β-酪蛋白：bsa＝1:500)。

分别称取10mgy-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均匀后，取20μl分散液，用上样液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡，然后将其加入100μl含多肽混合物的上样液中，涡旋3min，离心或磁分离，经过上样液清洗两遍之后，材料上的分析物用100μl解吸液(0.4mnh3·h2o)解吸到离心管中。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，加入1.2μl基质溶液(20mg/ml2,5-dhb于50％acn，1％h3po4的水溶液中)溶解多肽，全部样品点在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

所有的质谱分析都采用日本shimadzu公司的aximatof²型基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(maldi-tofms)。maldims分析时采用波长为337nm的氮气激光器，其脉冲宽度为3ns；采用20kv的加速电压，在正离子反射模式下进行检测。每张谱图是200次激光扫描的平均结果。

检测结果如图2所示：当β-酪蛋白酶解物未经富集直接经maldims分析时，谱图中存在大量非磷酸化多肽的峰，没有磷酸化多肽的峰(图2(a))。经过三种y-nh2-plp-ti⁴⁺分别处理之后，解吸液中分别可检测到6、4、2个磷酸化多肽的信号峰(图2(b)，图2(c)，图2(d))，而绝大多数非磷酸化多肽的信号被有效地消除，表明这三种y-nh2-plp-ti⁴⁺对磷酸化多肽均表现出一定的选择性。从质谱图中磷酸化多肽个数和杂峰情况来看，以fe3o4@sio2为基底的材料富集效果最好，所能检测到的磷酸化多肽的信息如表1所示。推测的原因是，相比于磁纳米颗粒，硅胶颗粒粒径更大，分散性较差，吸附量较小，且分离需要离心，操作不方便；而碳纳米管表面具有一定的疏水性，会增加对非磷酸化多肽的非特异性吸附。

实施例3

为了考察三种常用金属离子(ti⁴⁺，ga³⁺，fe³⁺)对磷酸化肽的萃取效果，从而选出一种最优的金属离子以获得最优的材料，我们比较了fe3o4@sio2-nh2-plp-mⁿ⁺(m＝ti⁴⁺、ga³⁺或fe³⁺)在β-酪蛋白和bsa酶解混合液中对磷酸化多肽的萃取效果：

为了比较三种键合不同金属离子的fe3o4@sio2-nh2-plp-mⁿ⁺(m＝ti⁴⁺、ga³⁺或fe³⁺)对磷酸化肽段的富集能力，将磷酸化蛋白(β-酪蛋白)与非磷酸蛋白(bsa)酶解产物的混合物作为分析物(β-酪蛋白：bsa＝1:500)。

分别称取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-mⁿ⁺分散于1ml水中，混合均匀后，取20μl分散液，用上样液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡，然后将其加入100μl含多肽混合物的上样液中，涡旋3min，离心或磁分离，经过上样液清洗两遍之后，材料上的分析物用100μl解吸液(0.4mnh3·h2o)解吸到离心管中。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，加入1.2μl基质溶液(20mg/ml2,5-dhb于50％acn，1％h3po4的水溶液中)溶解多肽，全部样品点在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

检测结果如图3所示：fe3o4@sio2-nh2-plp-fe³⁺和fe3o4@sio2-nh2-plp-ga³⁺这两种材料对磷酸化多肽也表现出一定的选择性，尤其是多磷酸化多肽。从质谱图中磷酸化多肽个数和杂峰情况来看，fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺表现得最好(图2(b))。推测原因是，fe³⁺和ga³⁺相比于ti⁴⁺与磷酸化多肽的相互作用力更弱，因此损失大量的单磷酸化多肽。

实施例4

为了进一步评价fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺对磷酸化多肽的萃取能力，我们将fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺应用于更复杂的β-酪蛋白和bsa酶解混合液中磷酸化多肽的萃取，同时继续提高磷酸化蛋白(β-酪蛋白)与非磷酸蛋白(bsa)酶解产物的混合物中bsa的比例。

称取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均匀后，取20μl分散液，用上样液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡，然后将其加入100μl含多肽混合物的上样液中，涡旋3min，离心或磁分离，经过上样液清洗两遍之后，材料上的分析物用100μl解吸液(0.4mnh3·h2o)解吸到离心管中。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，加入1.2μl基质溶液(20mg/ml2,5-dhb于50％acn，1％h3po4的水溶液中)溶解多肽，全部样品点在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

检测结果如图4所示：当β-酪蛋白酶解物和bsa酶解物的比例为1:1000时，在未经过前处理的谱图中只能看到大量的非磷酸化肽信号(图4(a))；经过fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺处理之后，谱图中可以看到6个磷酸化肽的峰，而且大量的非磷酸化肽信号被去除(图4(b))，说明fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺对磷酸化肽有极好的选择性。

实施例5：fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺应用于血清中内源性磷酸化多肽的富集

正常人的血清样品通过标准的临床渠道从武汉大学校医院获得，采集到的血清保存在-20℃冰箱中。

称取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中。混合均匀后，取20μl，用上样液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡后，进行萃取。萃取磷酸化多肽时，血清(2μl)需要用上样液稀释50倍再进行萃取。上样液和解吸液分别为100μl5％tfa-50％acn(v/v)和0.4m氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液进行冷冻旋干，1.2μl基质溶液(20mg/ml2,5-dhbin50％(v/v)acn,1％(v/v)h3po4)溶解多肽，全部样品点在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

检测结果如图5所示：血清未经过材料处理直接进样时，质谱图中只能非磷酸多肽的信号(图5(a))；经过材料处理之后，质谱图中清晰的呈现着4个磷酸化多肽，而且几乎看不到非磷酸化肽的信号(图5(b)，附表2)，表明材料适用于高蛋白生物样品的分析。

实施例6：fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺应用于脱脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的选择性富集

脱脂牛奶购买自武汉大学某超市。牛奶的酶解过程如下：取100μl低脂牛奶经真空离心浓缩仪抽干后复溶于100μl含8m尿素及100mmtirs-hcl的变性缓冲液(ph8.5)中。上述溶液经10mm二硫苏糖醇(dtt)于37℃下反应30min以还原蛋白质中的二硫键，之后在20mm碘乙酰胺(iaa)中于避光条件下，室温下反应30min使被还原的巯基烷基化。经还原及烷基化的蛋白质用300μl100mmtris-hcl(ph8.5)稀释后，按照酶与底物比为1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反应16h。所有的酶解物保存在-20℃冰箱中备用。酶解后的多肽样品稀释500倍后用于材料的选择性评价。

称取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均匀后，取20μl分散液，用上样液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡后，进行萃取。萃取磷酸化多肽时，牛奶酶解物用上样液稀释500倍再进行萃取。上样液和解吸液分别为100μl5％tfa-50％acn(v/v)和0.4m氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液进行冷冻旋干，1.2μl基质溶液(其中，2,5-dhb浓度为20mg/ml，50％(v/v)acn，1％(v/v)h3po4)溶解多肽，全部样品点在maldi靶上用于maldi-tofms分析。

检测结果如图5所示：牛奶酶解物未经过材料处理直接进样时，质谱图中只能看到7个磷酸化多肽以及大量的非磷酸化肽(图5(c))；经过材料处理之后，质谱图中清晰的呈现着20个磷酸化多肽(图5(d)，附表3)，表明材料可用于实际样品分析。

实施例7：fe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺应用于鼠脑裂解液中磷酸化多肽的富集

斯普拉格(sd)雌性大鼠由湖北省疾控中心提供，年龄3～4个月，体重250～300g。鼠脑被取下后，清洗干净，切碎。取0.5g鼠脑组织，用匀浆管研碎，加入1mlripa裂解液(含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)。在冰浴中裂解30分钟后，于4℃下12000rpm离心30min，收集上清液。利用bca方法对上述上清液中的蛋白进行定量。往上述上清液中加入3体积的丙酮/乙醇/乙酸混合液(50/50/0.1,v/v/v)进行蛋白沉淀。之后4℃下4000rpm离心30min；去除上清液后，得到蛋白质，在空气中晾干。蛋白质用含8m尿素和0.2mtris、4mmcacl2的溶液复溶后同上述步骤进行酶解。酶解后的多肽产物经c18柱脱盐并抽干后存放在-20℃的冰箱中备用。

称取10mgfe3o4@sio2-nh2-plp-ti⁴⁺分散于1ml水中，混合均匀后，取20μl分散液，用上样液(5％tfa-50％acn(v/v))平衡后，进行萃取。萃取鼠脑裂解液样品时，鼠脑蛋白的用量为0.5mg。上样液和解吸液分别为100μl5％tfa-50％acn(v/v)和0.4m氨水水溶液。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，用c18柱spe脱盐，然后用反相液相色谱-电喷雾串联质谱(lc-esi-ms/ms)分析。

经富集后的细胞裂解物酶解产物采用nanorplc-esi-ms/ms(tripletof5600+，absciex)进行质谱分析。多肽首先被结合到captrap柱(5μm,5×0.3mm,agilenttechnologies)上，然后被洗脱到反相c18分析柱(75μm×150mm,3μmparticlesize,poresize,eksigent)上。液相色谱的流动相分别为溶液a(3％dmso,97％h2o,0.1％甲酸)和溶液b(3％dmso,97％acn,0.1％甲酸)，其梯度设置如表3-1所示，流速为300nl/min。一级质谱扫描范围从400到1800amu，250ms累积时间。每个完整的一级质谱扫描包括40次二级质谱分析，扫描范围从350到1500amu，离子的带电量为+2到+5价。二级质谱分析阀值设为120，18秒内排除相同质荷比离子。

检测结果如图6所示：该方法在0.5mg鼠脑裂解液中共检测到3014个磷酸化多肽，其中单磷酸化多肽有2848个，多磷酸化多肽有166个，对磷酸化多肽的特异性为88.1％(图6)。结果表明该材料在复杂生物样品的分析中表现良好，有望用于磷酸化蛋白组的全分析。

表1β-酪蛋白酶解液中鉴定到的磷酸化多肽的详情

“_”表示磷酸化位点

表2人类血清中鉴定到的磷酸化多肽的详情

“_”表示磷酸化位点。

表3脱脂牛奶酶解液中鉴定到的磷酸化多肽的详情

“_”表示磷酸化位点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。