具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相及其制备方法与流程

本发明涉及用于蛋白质分离的高效液相色谱固定相领域，尤其涉及一种具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相及其制备方法。

背景技术：

高效液相色谱(hplc)由于柱效高和分离条件温和，已经发展成为分离和分析生物大分子的强有力手段。离子交换色谱(iec)是一种高效的分离方法，是hplc中必不可少的分离模式。

它是通过带电的溶质分子与离子交换色谱固定相中可交换的离子通过交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸残基与带相反电荷的色谱固定相相互作用达到分离纯化的方法。所以当前都是带正电荷或者负电荷的离子型色谱固定相，带电功能基团决定了离子交换的基本性质，功能基团的类型决定了离子交换的类型和强弱，它们的总量和有效数量决定了离子交换剂的总交换容量和有效交换容量。

技术实现要素：

本发明所要提供的是一种非离子型色谱固定相，是一种与当前离子型色谱固定相不同的新型固定相，原理是nacl溶液为洗脱液，固定相上的羟基会与洗脱液的氯离子形成o—h…cl的弱氢键作用，使得色谱固定相带上负电荷，因此具有了阳离子交换功能。

本发明所采用的技术方案是：

一种具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相，结构式为：

其中为聚甲基丙烯酸环氧丙脂微球，r为h或ch3，n为1～8的整数。

一种具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相的制备方法，包括以下步骤：

基质表面环氧基水解：将pgma/edma微球i分散于h2so4溶液中，接着搅拌至完全反应，得到环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii；

第一次清洗干燥：将得到的环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii分别用水和甲醇洗涤，接着真空干燥，得到干燥微球pgma/edmaii；

基质表面环氧化：将得到的干燥微球pgma/edmaii分散于混合溶液一中，边搅拌边加入环氧氯丙烷，接着搅拌至完全反应，其中混合溶液一包括二甲亚砜溶液和naoh溶液，得到环氧化微球pgma/edmaiii；

第二次清洗干燥：将得到的环氧化微球pgma/edmaiii分别用水和甲醇洗涤，接着真空干燥，得到干燥微球pgma/edmaiii；

非离子型色谱固定相获得：将得到的干燥微球pgma/edmaiii分散于二氧六环中，边搅拌边加入含多羟基的有机胺，搅拌至完全反应，得到多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv；

第三次清洗干燥：将得到的多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv分别用水和甲醇洗涤，接着真空干燥，得到阳离子交换功能的非离子型色谱固定相。

最优的，所述基质表面环氧基水解步骤具体为：按照6克的pgma/edma微球i分散于至少100ml的h2so4溶液中的比例将pgma/edma微球i分散于h2so4溶液中，其中h2so4溶液浓度为0.1mol/l，在60℃水浴条件下搅拌反应至少10小时，得到环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii。

最优的，所述基质表面环氧化步骤具体为：按照6克干燥微球pgma/edmaii分散于至少60ml的混合溶液一中的比例将干燥微球pgma/edmaii分散于混合溶液一中，室温边搅拌边加入5ml环氧氯丙烷，接着在60℃水浴条件下搅拌反应4～6小时，其中混合溶液一包括二甲亚砜溶液和naoh溶液，得到环氧化微球pgma/edmaiii。

最优的，所述基质表面环氧化步骤中的混合溶液一包括5体积份的二甲亚砜溶液和1体积份的naoh溶液。

最优的，所述非离子型色谱固定相获得步骤具体为：按照6克干燥微球pgma/edmaiii分散于至少50ml的二氧六环中的比例将干燥微球pgma/edmaiii分散于二氧六环中，边搅拌边加入含多羟基的有机胺，室温搅拌反应4～6小时，得到多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv。

最优的，所述非离子型色谱固定相获得步骤中，含多羟基的有机胺为n-甲基葡糖胺，且6克干燥微球pgma/edmaiii分散于至少50ml的二氧六环中，室温边搅拌边加入2克n-甲基葡糖胺。

最优的，所述第一次清洗干燥步骤具体为：将得到的环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii分别用水和甲醇各洗涤2～4次，接着50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaii；所述第二次清洗干燥步骤具体为：将得到的环氧化微球pgma/edmaiii分别用水和甲醇各洗涤2～4次，接着50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaiii；所述第三次清洗干燥步骤具体为：将得到的多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv分别用水和甲醇各洗涤2～4次，接着50℃真空干燥4h，得到阳离子交换功能的非离子型色谱固定相。

最优的，所述pgma/edma微球i的结构式为：

所述环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii和干燥微球pgma/edmaii的结构式均为：

所述环氧化微球pgma/edmaiii和干燥微球pgma/edmaiii的结构式均为：

所述多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv和阳离子交换功能的非离子型色谱固定相结构式均为：

其中为聚甲基丙烯酸环氧丙脂微球，r为h或ch3，n为1～8的整数。

由上述技术方案可知，本发明提供的阳离子交换功能的非离子型色谱固定相，以聚甲基丙烯酸环氧丙脂微球为基质，将其表面环氧基水解后生成邻二醇基，在naoh的作用下使羟基与环氧氯丙烷发生反应，再在二氧六环中使环氧基与含多羟基的有机胺发生反应，得到一种含有多羟基及胺基的特殊色谱固定相。该固定相含有大量不带电荷的羟基以及带微弱正电荷的胺基，在阳离子交换模式下表现出极好的分离性能，从而可以使用填充该色谱固定相的色谱柱对碱性蛋白质进行分离纯化。

附图说明

附图1：具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相反应原理图。

附图2：具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相对五种标准蛋白的色谱分离图。图中1、2、3、4、5分别为核糖核酸b、核糖核酸酶a、细胞色素c、α-糜蛋白酶原a、溶菌酶。

具体实施方式

结合本发明的附图，对发明实施例的技术方案做进一步的详细阐述。

一种具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相，结构式为：

其中为聚甲基丙烯酸环氧丙脂微球，r为h或ch3，n为1～8的整数。

参照附图1所示，一种具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相的制备方法，包括以下步骤：

s1：基质表面环氧基水解：按照6克的pgma/edma微球i分散于至少100ml的h2so4溶液中的比例将pgma/edma微球i分散于h2so4溶液中，其中h2so4溶液浓度为0.1mol/l，在60℃水浴条件下搅拌反应至少10小时，得到环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii。其中pgma/edma微球i的结构式为：

s2：第一次清洗干燥：将得到的环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii分别用水和甲醇各洗涤2～4次，接着50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaii。其中环氧基水解成邻二醇基微球pgma/edmaii和干燥微球pgma/edmaii的结构式均为：

s3：基质表面环氧化：按照6克干燥微球pgma/edmaii分散于至少60ml的混合溶液一中的比例将干燥微球pgma/edmaii分散于混合溶液一中，室温边搅拌边加入5ml环氧氯丙烷，接着在60℃水浴条件下搅拌反应4～6小时，其中混合溶液一包括5体积份的二甲亚砜溶液和1体积份的naoh溶液，得到环氧化微球pgma/edmaiii。

s4：第二次清洗干燥：将得到的环氧化微球pgma/edmaiii分别用水和甲醇各洗涤2～4次，接着50℃真空干燥4h，得到干燥微球pgma/edmaiii。其中环氧化微球pgma/edmaiii和干燥微球pgma/edmaiii的结构式均为：

s5：非离子型色谱固定相获得：按照6克干燥微球pgma/edmaiii分散于至少50ml的二氧六环中的比例将干燥微球pgma/edmaiii分散于二氧六环中，边搅拌边加入2克的n-甲基葡糖胺，室温搅拌反应4～6小时，得到多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv。

s6：第三次清洗干燥：将得到的多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv分别用水和甲醇各洗涤2～4次，接着50℃真空干燥4h，得到阳离子交换功能的非离子型色谱固定相。其中多羟基有机胺改性的色谱固定相微球pgma/edmaiv和阳离子交换功能的非离子型色谱固定相结构式均为：

其中为聚甲基丙烯酸环氧丙脂微球，r为h或ch3，n为1～8的整数。

接着将得到的阳离子交换功能的非离子型色谱固定相装柱，在离子交换模式下对五种标准蛋白进行分离。

分离条件如下所述：

流动相：a液是20mmol/l的tris，且tris的ph是7.5；b液是20mmol/ltris+1.0mol/lnacl，且b液的ph是7.5。线性梯度洗脱，初始时流动相a占流动相总体积的90％，流动相b占流动相总体积的10％，接下来的30min内流动相a占流动相总体积的份数降至40％，流动相b占流动相总体积的份数升至60％，流速为1.0ml/min，对核糖核酸b、核糖核酸酶a、细胞色素c、α-糜蛋白酶原a、溶菌酶等五种蛋白质实现了良好的分离，分离结果如附图2所示，图中1、2、3、4、5分别为核糖核酸b、核糖核酸酶a、细胞色素c、α-糜蛋白酶原a、溶菌酶，可以看出本发明所述的具有阳离子交换功能的非离子型色谱固定相，可以将上述五种标准蛋白达到基线分离。