一种液滴生物分析芯片及其应用、使用方法与流程

本发明属于生物医学分析技术领域，特别涉及一种液滴生物分析芯片及其应用，以及一种液滴生物分析芯片的使用方法。

背景技术：

液滴分析是近年来发展起来的一种全新的操控微小体积液体的技术。液滴分析大多在芯片上实现，分析中使用两种互不相溶的液体，以其中一种作为连续相，另一种作为分散相。分散相以微小体积分散于连续相中，形成液滴。根据分散相和连续相的不同，液滴分为两种：w/o(water-in-oil)型液滴和o/w(oil-in-water)型液滴，其中水相(water)泛指各种水溶液，油相(oil)为与水不溶的有机溶剂。

在w/o型液滴体系内，由于油相的包裹与隔离，反应溶液可以分散形成为相对独立的微反应器或储存器，因而具有如下优点：1)体积极为灵活，液滴反应体积可以缩小到纳升甚至飞升量级，特别适合高通量反应或样品来源极有限的反应，同时也可以减小昂贵试剂的使用，降低测试成本；2)样品无扩散且样品间无交叉污染，由于每个样品溶液都被不相溶旳油相包裹包围，一方面样品分子保留在水溶液中有利于保持样品浓度，另一方面反应溶液与器壁不直接接触且相邻反应溶液被油相隔离有利于避免相邻液滴间的物质交换；3)反应条件稳定，溶液中的水分子蒸发因油相包围而受到抑制，液滴内反应条件几乎不受外界影响。

对于已经发展的液滴芯片分析系统，大多采用同质性分析模式，即同一类型分析的平行化。这种分析模式虽然在通量方面有巨大的优势，但分析样本的数目有限，而且难于实现集成化分析。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术在分析通量、分析速度、自动化程度以及试剂消耗量方面的缺点与不足，提供一种液滴生物分析芯片。

本发明的另一目的在于提供所述液滴生物分析芯片的应用。

本发明的再一目的在于提供所述液滴生物分析芯片的使用方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种液滴生物分析芯片，包含若干组相互平行的串联微池，每组串联微池由若干通过狭缝串联连通的微池单元组成；串联微池中的部分或全部微池单元具有开放式结构；串联微池和狭缝的底面为平滑薄壁结构。

所述的开放式结构指的是所述的微池单元的顶面敞开或开孔，从而有利于加样和取样的操作。

所述的液滴生物分析芯片的材质是疏水性聚合物材料或者是表面疏水处理的材料。

所述的疏水性聚合物材料优选为聚丙烯(polypropylene,pp)、环烯烃类共聚物(copolymersofcycloolefin,coc)或聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene,ptfe)。

所述的微池单元和所述的狭缝的内表面设置疏水涂层；从而微池及狭缝的内表面具有疏水性。

所述的疏水涂层的材料优选为teflonaf1600。

所述狭缝的长度为1～20毫米，宽度或高度至少有一维尺度介于0.1～1毫米；所述的狭缝的长度优选为3毫米，宽度或高度优选为0.5毫米。

所述的狭缝起到疏水阀作用，阻碍水相溶液自由通过。

所述的狭缝优选为具有“由宽变窄”的渐变过渡结构的狭缝，便于诱导磁粒聚集和防止磁粒截留。

所述的渐变过渡结构是过渡结构的顺向切线与微池至狭缝方向的夹角为锐角。即沿着磁粒的前进方向，与前一微池连接的狭缝的一端的宽度比与后一微池连接的狭缝的另一端的宽度宽。

所述的平滑薄壁结构指的是底面上的平面为无尖锐凹陷表观结构的平整面，从而有利于高效顺畅的磁粒操作，防止磁粒截留损失。

所述的底面的厚度为0.1～1毫米，优选为0.25～1毫米，更优选为0.3毫米。

所述的液滴生物分析芯片的面积优选为10～600平方厘米。

所述的液滴生物分析芯片在生物样品分析中的应用，特别适合在高通量的生物样品分析中的应用。

所述的生物样品分析包括生物分子提取，以及定性分析和/或定量分析。

所述的生物分子优选为蛋白和核酸。

所述的液滴生物分析芯片的使用方法，包括如下步骤：

(1)将所述的液滴生物分析芯片装载于芯片平台上，将油相溶液注入芯片微池中，待油相液体自动填充微池和狭缝；

(2)接着在各个微池中分别加入含有样品或试剂的水相溶液，由于表面张力效应，水相溶液在油相溶液中自发形成油包水液滴；

(3)在水相溶液中加载能结合生物分子的磁性粒子，磁性粒子结合生物分子后在磁场力作用下运动，可以穿越油水界面和狭缝，在液滴间运动，完成生物分子提取、以及定性分析和/或定量分析过程。

本发明的原理：芯片微池和狭缝具有疏水表面，因而向芯片微池中加入油相溶液时油相自动浸润微池和狭缝表面。向各个微池加入相应的试剂/或样品(水溶液)，由于表面张力作用，所添加的试剂/样品溶液在油相中自动形成油包水液滴。相连通微池中的液滴在外界扰动下(如倾斜、振动、加热)依然保持相互独立隔离状态，从而确保各液滴组分浓度的稳定。如图1所示，当向微池所在的区域施加一定方向的磁场力后，微池a中液滴中相应的磁性粒子汇集到狭缝通道处并与母液滴分离，并在场力作用下沿狭缝通道继续运动直至与微池b中液滴汇合继而融合，而微池a中的母液滴仍然截留在微池a中。因此上述过程可以完成液滴的分裂、运动、融合。如果在磁粒表面标记由捕获分子，如核酸序列或抗体，磁粒就可以结合特定的生物分子并携带这些生物分子在一系列液滴之间转移。通过类似的方式，可以完成生物分析所涉及的多步操作，最终可实现芯片上全集成式批量生物样品的自动化分析。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的芯片上的液滴发生和定位无需使用复杂的流体控制装置；

(2)本发明提供的液滴生物芯片制作工艺简单，成本低；

(3)本发明提供的液滴生物芯片液滴体积灵活可变，特别适合数微升至百微升体积的生物样品；

(4)本发明提供的液滴生物芯片采用非接触式操作，无交叉污染风险；

(5)本发明提供的液滴生物芯片芯片能够以全集成方式实现某些生物分析的平行操作，便于实现自动化高通量分析。

综上所述，本发明提供的液滴生物芯片其分析方法具有操作简便、分析快速、自动化程度高和测试通量较高的优势。

附图说明

图1是本发明提供的液滴生物分析芯片的原理示意图。

图2.1-2.3对应实施例1。

图2.1为实施例1液滴生物分析芯片的结构功能区示意图。

图2.2为实施例1液滴生物分析芯片使用时样品的装载示意图。

图2.3为实施例1液滴生物分析芯片的操作示意图。

图3.1-3.2对应实施例2。

图3.1为实施例2液滴生物分析芯片的结构功能区示意图.

图3.2为实施例2液滴生物分析芯片使用时样品的装载示意图。

图4为实施例3液滴生物分析芯片的结构功能区示意图。

图5.1-5.2对应实施例5。

图5.1为实施例5液滴生物分析芯片的立体图。

图5.2为图5.1中微池和狭缝的局部放大图。

其中，1为芯片基质，2为微池，3为狭缝，4为油相，5为水相，6为磁性粒子，7为磁场，8为磁铁，9为封底层。

1-1为核酸提取液，1-2为样品，1-3为无乙醇型洗涤液，1-4为扩增反应液，1-5为酶液。

2-1为样品，2-2为裂解液，2-3为矿物油，2-4为结合液，2-5为磁粒悬液，2-6为无乙醇型洗涤液，2-7为洗脱液，2-8为反应预混液。

a、b、c、d、e是为了描述的方便，将芯片区域区分开来。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

如图2.1所示，一种集成rna提取、恒温扩增及检测的液滴生物分析芯片，包含15组串联微池，每组串联微池由5个微池组成；同组微池之间通过狭缝相连通。

具体地，该芯片为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，pdms)材质。芯片由15组串联微池构成，微池宽度和深度为3.2mm，微池底面的厚度为0.25mm，狭缝尺寸为3mm(长)×0.5mm(宽)×3.2mm(高)。微池和狭缝表面使用teflonaf1600疏水涂层处理。该芯片上集成rna提取、rna恒温扩增及检测，将该芯片置于芯片平台上，基本操作流程如下：

(1)油相加载：向芯片a-e区的各个微池中依次加入25μl、20μl、20μl、15μl、10μl的石蜡油，并确保微池之间的狭缝被石蜡油浸润；

(2)试剂加载：向芯片a-e区的各个微池中依次加入25μl核酸提取液、100μl洗涤液、100μl洗涤液、16μl扩增反应液、4μl酶液，分别形成独立的油包水型液滴；其中，核酸提取液包含修饰有olig-dt捕获探针的磁粒悬液，洗涤液为无乙醇型洗涤液，反应液为包含引物、dntp、荧光探针和反应缓冲液，酶液包含m-mlv反转录酶、t7rna多聚酶及酶保存液；

(3)样品加载：向芯片a区各个微池中的核酸提取液液滴中分别加入100μl样品，样品为待测样品、阳性对照、阴性对照或内标；此时芯片各微池内的液滴装载情形如图2.2所示；

(4)rna的释放及与磁粒的结合：芯片往复振荡30秒使样品与核酸提取液充分混合，然后芯片a区微池保持在60℃5分钟，再恢复芯片a区微池温度为室温并静置3分钟；

(5)rna洗涤纯化：如图2.3所示，向芯片a区微池施加磁场驱动磁粒沿狭缝向b区微池运动直至进入b区微池中液滴，运动的线速度为1mm/s，在此过程中磁粒携带rna从核酸提取液液滴中分离出来，继而通过狭缝到达b区微池并与b区微池中的洗涤液液滴融合。振荡芯片使磁粒与洗涤液充分混合；向芯片b区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向c区微池运动，运动的线速度为1mm/s，直至与c区微池中洗涤液液滴融合；振荡芯片使磁粒与洗涤液充分混合；

(6)rna洗脱及引物-模板退火：向芯片c区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向d区微池运动其线速度为1mm/s，直至与d区微池中扩增反应液液滴融合，然后振荡芯片使磁粒与洗涤液充分混合并维持芯片d区微池温度为60℃5分钟，使洗脱的rna模板与扩增反应液中的引物退火结合；

(7)rna恒温扩增：维持芯片e区微池温度为42℃，驱动磁粒带动d区-液滴移动靠近e区酶液液滴，运动的线速度为2mm/s；当两液滴接触后，驱动磁粒在d、e区微池间往复运动30秒，运动的线速度为10mm/s，促发两液滴融合并使扩增反应液液滴与酶液充分混合。保持e区微池温度为42℃，40分钟。

实施例2

如图3.1所示，一种集成dna提取、环介导恒温扩增(lamp)及实时荧光检测的液滴生物分析芯片，包含15组串联微池，每组串联微池由5个微池组成；同组微池之间通过狭缝相连通；微池全部或部分具有开放式结构。

具体地，该芯片为聚四氟乙烯材质。该液滴分析芯片的尺寸为85.5mm(长)×54mm(宽)，厚度为4.2mm。该芯片由15组串联微池构成，微池及狭缝深度均为3.2mm，狭缝尺寸为3mm(长)×0.5mm(宽)×3.2mm(高)，微池底层的厚度为1mm。该芯片上集成dna提取、lamp恒温扩增及检测，将该芯片置于芯片平台上，基本操作流程如下：

(1)油相加载：向芯片a-e区的各个微池中依次加入25μl、20μl、20μl、15μl、10μl的石蜡油，并确保微池之间的狭缝被石蜡油浸润；

(2)试剂加载：向芯片各个微池依次加入以下试剂或样品，a区：50μl裂解结合缓冲液+2μl磁粒悬液，形成核酸提取液液滴；b区：100μl洗涤液；c区：100μl洗涤液；d区：16μl洗脱液；e区：4μl5×lamp反应预混液，分别形成独立的油包水型液滴；

(3)样品加载：向芯片a区各个微池中的核酸提取液液滴中分别加入20μl样品，样品为待测样品、阳性对照或阴性对照的样品裂解液。此时芯片各微池内的液滴装载情形如图3.2所示。

(4)dna的释放及与磁粒的结合：先振荡芯片30秒使样品与裂解结合缓冲液充分混匀，然后维持芯片a区微池56℃6分钟，此过程中控制芯片往返运动，促使磁粒在a区液滴中震荡以促进混合；

(5)dna洗涤：向芯片a区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向b区微池运动直至进入b区微池中洗涤液滴(线速度为2mm/s)，在此过程中磁粒携带dna从裂解-结合液滴中分离出来，继而通过狭缝到达b区微池并与b区微池中的洗涤液液滴融合。振荡芯片使磁粒与洗涤液充分混合。向芯片b区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向c区微池运动(线速度为2mm/s)直至与c区微池中洗涤液液滴融合。振荡芯片使磁粒与洗涤液充分混合；

(6)dna洗脱：向芯片c区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向d区微池运动直至进入d区微池中洗脱液滴(线速度为1mm/s)，轻柔振荡芯片使磁粒上的dna充分解解离到洗脱液中。芯片结构设计上，d区与e区之间无狭缝结构，d/e区液滴可以在一定条件下跟随磁珠一起运动，因此可以通过磁珠拖动其中的一种液滴向另一种液滴靠近直至融合。与实施例1不同的是，dna扩增反应中需要去除磁珠，因此在dna洗脱液与扩增反应液融合后需立即分离去除磁珠。因而，在操作流程上，结合有dna的磁珠首先进入d区洗脱液液滴，振荡芯片使磁粒上的dna充分解解离到洗脱液中，然后利用磁粒拖动d区洗脱液滴靠近e区扩增预混液液滴并与之融合，并立即向c区快速拖动磁珠使之与扩增反应液分离，扩增反应液保留在e区以执行dna扩增。

(7)lamp的恒温扩增及实时荧光检测：向芯片d区微池施加磁场牵引磁粒向e区微池运动直至进入e区微池中扩增预混液液滴融合(线速度为1mm/s)，然后迅速驱动磁粒反向运动(线速度为5mm/s)使之脱离扩增反应液并通过d区-c区的狭缝到达c区。振荡芯片洗脱液与lamp扩增预混液充分混合，并维持芯片d-e区微池温度为65℃50分钟。在此期间，以一定的时间间隔采集e区各微池中液滴的荧光信号，由此绘制液滴荧光强度随扩增时间的变化曲线——扩增曲线，并确定d-e区各个微池对应样品的扩增时间阈值tt。

(8)dna检测结果的判定：根据实时荧光信号的时间阈值tt，结合阴性对照、阳性对照对检验结果进行被判定。

实施例3

如图4所示，一种集成dna提取、荧光实时定量pcr检测的液滴生物分析芯片，包含15组串联微池，每组串联微池由5个微池组成；同组微池之间通过狭缝相连通；微池全部或部分具有开放式结构。

具体地，该芯片为聚碳酸酯材质。该液滴分析芯片的尺寸为85.5mm(长)×54mm(宽)，厚度为4.2mm。该芯片由15组串联微池构成，微池及狭缝深度均为3.7mm，狭缝尺寸为3mm(长)×0.5mm(宽)×3.7mm(高)，微池底层厚度为0.5mm，表面使用teflonaf1600疏水涂层处理。该芯片上集成dna提取、lamp恒温扩增及检测，将该芯片置于芯片平台上，基本操作流程如下：

(1)油相加载：向芯片a-e区的各个微池中依次加入25μl、20μl、20μl、15μl、10μl的石蜡油(no.a630217，生工生物工程(上海)股份有限公司)，并确保微池之间的狭缝被石蜡油浸润；

(2)试剂加载：向芯片a-e区各个微池依次加入20μl裂解缓冲液+50μl结合液+2μl磁粒悬液、100μl洗涤液、100μl洗涤液、10μl洗脱液、5μl的lamp预混液，分别形成独立的油包水型液滴。其中芯片a区各微池中所加入的裂解缓冲液、结合液和磁珠悬液应确保形成相互隔离的液滴(所述试剂为杭州博日科技有限公司的magabioplus通用基因组dna提取纯化试剂盒)，洗涤液为无乙醇型洗涤液，洗脱液为去离子双蒸水；

(3)样品加载：向芯片a区各个微池中的核酸提取液液滴中分别加入20μl样品，样品为待测样品、阳性对照或阴性对照。此时芯片各微池内的液滴装载情形如图3.2所示。

(4)dna的释放及与磁粒的结合：先振荡芯片30秒使样品与裂解结合缓冲液充分混匀，然后维持芯片a区微池56℃5分钟。向芯片a区微池施加磁场牵引磁粒液滴进入结合缓冲液液滴，二者融合后继续牵引磁粒携带结合缓冲液液滴进入裂解缓冲液至其融合。振荡芯片促使磁粒-结合液-裂解液充分混合并维持轻柔振荡5分钟。

(5)dna洗涤：向芯片a区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向b区微池运动直至进入b区微池中洗涤液滴，运动的线速度为5mm/s，在此过程中磁粒携带dna从裂解-结合液滴中分离出来，继而通过狭缝到达b区微池并与b区微池中的洗涤液液滴融合。振荡芯片使磁粒与洗涤液充分混合。向芯片b区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向c区微池运动(线速度为5mm/s)直至与c区微池中洗涤液液滴融合。振荡芯片使磁粒与洗涤液充分混合。

(6)dna洗脱：向芯片c区微池施加磁场牵引磁粒沿狭缝向d区微池运动直至进入d区微池中洗脱液滴(线速度范围3mm/s)，轻柔振荡芯片使磁粒上的dna充分解解离到洗脱液中。

(7)荧光实时定量pcr检测：向芯片d区微池施加磁场牵引磁粒向e区微池运动直至进入e区微池中pcr预混液液滴融合，运动的线速度为1mm/s，然后迅速驱动磁粒反向运动(线速度为5mm/s)，使之脱离扩增反应液并通过d区-c区的狭缝到达c区。振荡芯片洗脱液与pcr预混液充分混合。对芯片d-e区微池执行常规pcr热循环。在此期间，在每一个热循环过程中采集e区各个微池中液滴的荧光信号一次，由此绘制液滴荧光强度随循环数的变化曲线——扩增曲线，并确定d-e区各个微池对应样品的循环阈值ct。

(8)dna检测结果的判定：根据实时荧光信号的循环阈值，结合阴性对照、阳性对照对检验结果进行被判定。

实施例4

一种液滴生物分析芯片，包含5组串联微池，每组串联微池由5个微池组成；同组微池之间通过狭缝相联通；微池全部或部分具有开放式结构。

具体地，该芯片为黑色聚四氟乙烯材质材质。该液滴分析芯片的尺寸为40mm(长)×25mm(宽)。微池宽2mm、深4mm，微池串联区为长3mm、宽0.3mm的狭缝。微池底层的厚度为0.5mm。

在该芯片上基于化学发光检测的心脏病标记物的分析流程如下：

(1)取样针顺序吸取5μl矿物油，5μl标记捕获抗体磁珠悬液。重复操作5次，依次加载于第一列的各个微池.。五组中每个液滴中磁珠标记的捕获抗体分别针对谷草转氨酶(ast)、肌酸激酶同工酶(mmb)、磷酸肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)和肌钙蛋白；

(2)取样针顺序吸取5μl矿物油和10μl洗涤液。重复操作5次，依次加载于第二列的各个微池；

(3)取样针顺序吸取5μl矿物油，10μl洗涤液。重复操作5次，依次加载于第三列的各个微池；

(4)取样针顺序吸取5μl矿物油，5μl含有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)标记检测抗体的溶液，依次加载于第四列的各个微池。五组中每个液滴中磁珠标记的检测抗体分别针对谷草转氨酶(ast)、肌酸激酶同工酶(mmb)、磷酸肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)和肌钙蛋白；

(5)取样针顺序吸取5μl矿物油，5μl鲁米诺溶液，重复操作5次，依次加载于第五列的各个微池；

(6)取样针顺序吸取10μl矿物油和5μl血清。重复操作5次，依次加载于第一列的各个微池，保存5分钟；

(7)将芯片转移至磁铁上方，往返拖动芯片1分钟，使磁珠在第一列微池中振荡；

(8)驱动芯片在磁铁上方运动，拖动磁珠从第一列微池进入第二列微池中含有洗涤液的液滴，并在该处停留30秒；

(9)驱动芯片在磁铁上方运动，使磁珠从第二列微池进入第三列微池中含有洗涤液的液滴，并在该处停留30秒；

(10)驱动芯片在磁铁上方运动，使磁珠从第三列微池进入第四列微池中含有检测抗体的液滴，在保持5min；

(11)驱动芯片在磁铁上方运动，使磁珠从第四列微池进入第五列微池中含有路莫诺的液滴；

(12)液滴芯片移入暗仓，检测液滴中化学发光信号。

实施例5

一种液滴分析芯片，包含系列串联微池，每组串联微池由若干微池组成；串联的微池之间通过狭缝相联通；微池全部或部分具有开放式结构。

满足上述特征的液滴分析芯片结构设计之一，如图2.2，利用阳模浇筑或注塑一次成形。

满足上述特征的液滴分析芯片结构设计之二，如图5.1所示，由封底层和微池层构成。其中，如图5.2所示，微池层制作有微池通孔阵列，在与封底层连接的一侧串联微池之间有狭缝连通，狭缝宽度和高度的分别为0.8mm和0.5mm。狭缝在微池至狭缝方向上具有宽度渐变过渡结构，过渡结构的顺向切线与微池至狭缝方向的夹角为锐角。微池层成型后，与封底层封接即可形成具备上述特征性的液滴芯片。构成上述封底层和微池层的材料组合之一分别为厚度不超过0.5mm的玻片和pdms，对应封接方法为等离子键合；构成上述封底层和微池层的材料组合之二分别为厚度为0.1mm的铝箔和环烯烃共聚物(copolymersofcycloolefin，coc)，对应方法为热压键合。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。