本发明属于蛋白微球制备领域，具体涉及一种羽毛绒蛋白纳米微球及其制备方法。
背景技术：
蛋白微球具有良好的生物相容性、可生物降解性、比表面积大、分散性好等特点，依靠微球蛋白囊壁的渗透、选择过滤与可控释放等功能，采用蛋白材料将芯材(如药物、染料、功能助剂、标记物质等)加工制备成蛋白微球，可大大提高芯材的稳定性，同时赋予其可控的释放功能。因此蛋白微球技术将在酶的固定化、生物抗体与疫苗开发、新药研发与药物缓释等多个领域具有广阔的应用前景。
目前关于蛋白微球的研究热点主要包括纳米微球的制备技术、微球壁材蛋白质来源的拓展与性能研究等方面。研究表明纳米蛋白微球具有较高的分散性，优良的储存稳定性，高效的药物缓释效率。同时，羽毛绒纤维主体是天然蛋白质，若将羽毛绒蛋白加以利用，可拓宽蛋白质资源渠道，同时具有变废为宝的社会效益，具有重要意义。
传统蛋白微球制备工艺，包括乳化法、喷雾干燥法、自组装法和层流射流技术等，但是，上述方法存在以下缺陷和问题：如乳化工艺中，溶剂去除不够彻底，甚至会产生有毒物质的问题；喷雾干燥工艺容易产生积聚、黏着，产量下降的问题；自组装和喷雾干燥法微球成球形差，粒径难以控制等问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种羽毛绒蛋白纳米微球及其制备方法，采用乳化交联+超声复合作用工艺，解决了水溶性羽毛绒蛋白的提取和羽毛绒蛋白纳米微球的制备问题。羽毛绒的溶解率高，而且，制备羽毛绒蛋白分子量分布集中，浓度较高，可直接用于微球制备，具有节时高效的工艺优势。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供的一种羽毛绒蛋白纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备复合碱液溶解体系：
将碳酸钠、氢氧化钠溶于水，搅拌溶解，冷却至室温后，再加入吸湿助溶剂，搅拌溶解后，再加入稳定剂组分羧甲基纤维素，搅拌混匀，即得复合碱液溶解体系；
2)、将羽毛绒加入制备的复合碱液溶解体系中，低速搅拌溶解，即得羽毛绒蛋白溶解液；
3)、在加热和搅拌条件下，向液体石蜡中加入司班80乳化剂，加完后停止加热，在余热条件下持续超声震荡，即得石蜡溶液；
4)、将步骤2)制备的羽毛绒蛋白溶解液加入到步骤3)制备的石蜡溶液中，超声，至形成稳定乳白色w/o乳液；
5)、将戊二醛交联剂加入到步骤4)制备的体系中，继续超声处理，得微球溶液；
6)、向步骤5)所得微球溶液中加入异丙醇，离心，倒出上层清液，采用石油醚对微球进行反复冲洗并抽滤，常温常压干燥，即得羽毛绒蛋白纳米微球。
步骤1)中碳酸钠在体系中的质量浓度2-4％；氢氧化钠的质量浓度1-2％；
步骤1)中所述吸湿助溶剂由以下质量比的原料组成：尿素：硫脲：丙三醇：葵醇：异构十三醇＝20：20：3：1：0.5。
步骤1)中吸湿助溶剂在体系中的质量浓度为12-15％；
步骤1)中所述稳定剂组分在体系中质量浓度为0.8-1.0％。
步骤1)中加入吸湿助溶剂后的溶解液在不立刻溶解羽毛绒的条件下，无须加入稳定剂组分，封闭常温保存，在溶解羽毛绒之前向其中加入稳定剂组分即可。
步骤2)中羽毛绒溶解在20-25℃条件下进行。
步骤2)中羽毛绒与复合碱液溶解体系的质量比为2-5：100。所述低速搅拌具体为：20-50r/min条件下，搅拌溶解4-12h。
步骤3)中加入司班80乳化剂的速率是5-10ml/min；
步骤3)中所述在加热和搅拌条件下具体为：在搅拌速率20-30r/min和加热温度40-55℃条件下。
步骤3)中所述超声震荡是指：超声功率80w，频率45khz，时间5-10min。
步骤4)中所述超声是指：超声功率80w，频率45khz，超声时间60min。
步骤4)中所述羽毛绒蛋白溶解液的质量浓度优选为4％。
步骤4)中将步骤2)制备的羽毛绒蛋白溶解液加入到步骤3)制备的石蜡溶液中速率为：30-50ml/min。
步骤5)中所述超声：功率80w，频率45khz时间120min。
上述制备过程中，液体石蜡、司班80乳化剂、羽毛绒蛋白溶解液和戊二醛交联剂的体积比为40-45：4：4-6：0.8-1.2。
本发明提供的一种羽毛绒蛋白纳米微球，采用上述方法制备得到。
本发明先采用复合碱液体系，在常温条件下搅拌溶解羽毛绒，羽毛绒的溶解率高于94％，具有溶解率高、节能降耗等工艺优势；同时，采用乳化交联+超声复合作用工艺，制备羽毛绒蛋白分子量分布集中，浓度较高，可直接用于微球制备，具有节时高效的工艺优势，实现了微球粒径可控，且成球性良好，优化了微球制备工艺。该制备方法打破了传统蛋白微球制备工艺出现的问题和局限性。
与现有技术相比，本发明基于超声波独特的剪切作用和强分散作用，通过超声波功率和频率等参数的调整完成对羽毛绒蛋白微球粒径的控制绿色高效并且方法简单。乳化-交联工艺选择保证微球材料稳定性和成球性，可通过交联剂用量等工艺参数的调整调节微球最终粒径和药物缓释性能，各环节操作简单，可操作性强。超声波仪器同乳化-交联工艺较好的契合，减少传统工艺的机械搅拌工序，有利于均匀乳液形成并未交联反应提供良好的反应条件，并缩短了微球制备时间。所制备微球同传统工艺相比拥有更均一的粒径分布，微球形貌更加规整，微球之间层积和粘黏现象大大减少，且工艺可控性进一步加强。
附图说明
图1a为羽毛绒溶解前；
图1b为羽毛绒溶解6小时；
图2为羽毛绒溶解进程；
图3a为高倍数羽毛绒蛋白微球扫面电镜；
图3b为第倍数羽毛绒蛋白微球扫面电镜；
图4羽毛绒蛋白微球粒径分布图。
具体实施方式
实施例1
一种羽毛绒蛋白纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
1)制备复合碱液溶解体系：
室温下，将碳酸钠、氢氧化钠溶于水，碳酸钠质量浓度为2.5％，氢氧化钠质量浓度为1％；搅拌溶解后，冷却至室温后，再加入吸湿助溶剂，搅拌溶解后，体系中吸湿助溶剂质量浓度为13％；再加入稳定剂组分羧甲基纤维素，搅拌混匀，羧甲基纤维素在体系中质量浓度为0.8％，即得复合碱液溶解体系；所述吸湿助溶剂由以下质量比的原料组成：尿素：硫脲：丙三醇：葵醇：异构十三醇＝20：20：3：1：0.5。
2)将羽毛绒加入制备的复合碱液溶解体系中，20℃下，在30r/min搅拌速度下，搅拌溶解24h，溶解率94.5％，即得质量浓度为4％的羽毛绒蛋白溶解液；
羽毛绒最初分散到复合碱体系中，并逐渐溶解；羽毛绒纤维在溶解体系中的形貌如图1a和图1b所示。由图1a和图1b所示，复合碱溶解体系呈无色透明，常温下将羽毛绒浸没其中，溶解液迅速呈黄色透明状，随着羽毛绒进一步溶解，溶液呈浅黄色浑浊状，溶解体系中纤维形貌如图2所示。可见，本发明采用的复合碱溶体系可在常温下对羽毛绒高效溶解，溶解24h后，羽毛绒的溶解度为94.5％。
3)、称取40ml去液体石蜡溶液置于干燥的烧杯中，然后在速率20r/min的均匀机械搅拌条件下加热至40℃，按照6ml/min速率向液体石蜡中滴加4ml司班80乳化剂，加完后停止加热，在余热条件下持续超声震荡，功率80w，频率45khz条件下超声波震荡8min，即得石蜡溶液；
4)、保持功率80w，频率45khz条件下继续超声，在超声条件，取步骤2)制备的4％的羽毛绒蛋白溶解液4ml加入到步骤3)制备的石蜡溶液中，至形成稳定乳白色w/o乳液；开启超声，频率45khz，80w功率下持续超声60min，直至形成稳定乳白色w/o乳液。(控制频率45khz，过低的超声波频率会导致制备微球粒径分布变宽，而过高的频率则会导致破乳，降低微球产率，超声波功率、超声时间影响着微球最终粒径，本发明控制功率80w；高功率超声波震荡时其剪切力大，微球粒径降低，且乳液达到平衡时间降低)。仅凭借超声波强乳化分散作用无法形成稳定羽毛绒蛋白微球，需继续添加交联剂。
5)、向步骤4)制备好的羽毛绒蛋白乳液分散体中加入1.2ml戊二醛交联剂，频率45khz，80w功率下持续时间120min，通过蛋白与交联剂的胺醛缩合反应和羟醛缩合反应使羽毛绒蛋白固化成微球；
6)、向步骤5)所得微球溶液中加入3倍体积的异丙醇，在6000r/min转速下离心10min后倒出上层清液，采用石油醚对微球进行反复冲洗并抽滤，常温常压干燥，即得羽毛绒蛋白纳米微球。
微球测试与表征
采用实施例1所述方法制成羽毛绒蛋白微球所测最终性能如下：
利用扫面电镜对微球形态进行观察，发现超声波辅助乳化-交联工艺所制备蛋白微球成球性能良好，微球表面光滑，仅存在少量粘黏。如图3a和3b所示。
采用马尔文粒径分析仪对微球尺寸分布进行分析，结果表明微球平均粒径为2072.5nm，主要分布在164～295nm和1990～5560nm两个区间，且粒径在190nm、3090nm和5560nm分布为主。如图4所示。
综上，本专利利用超声波辅助乳化-交联工艺制备微球不仅具备良好的成球性和可控性，而且微球粒径分布较为集中，有利于缓释微球等材料的开发，具有广阔的应用前景。