本发明涉及分离纯化介质技术领域，具体为一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法。
背景技术
近年来，国家重点投入发展生物医药领域和海洋生物资源开发领域，随着上游各类生物技术的蓬勃发展，下游生物大分子的分离纯化技术成为生物医用材料研究领域的重要课题，其支撑点是要有性能良好的分离介质。天然多糖具有优良的生物相容性与可降解性，故以其作为生物大分子的分离介质具有比合成聚合物更多的优势，因而一直是国内外学者研究的重点。琼脂糖是从石花菜、紫菜、江蓠等大型海洋藻类中分离出的一种天然海洋生物多糖，具有各种生物活性。而琼脂糖凝胶微球因具有良好的生物相容性、功能基特性、高亲水性、多孔性、非特异性等优势而成为一种优质的生物大分子分离介质，其主要应用在蛋白、抗体、酶等生物分子的分离纯化。
对琼脂糖凝胶微球进行改性，使琼脂糖接上具有不同生物活性的配基，即可用于不同生化物质的分离纯化。但现有琼脂糖凝胶微球改性技术存在制备工艺复杂、不易控制、配基密度低、成本高、污染严重等问题，且一般都是将琼脂糖先制备成微球后，再通过化学反应对微球进行改性，这样容易影响微球机械强度、表面光滑度与孔径大小。
氨基葡萄糖是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物，市面上的氨基葡萄糖主要分为盐酸氨糖与硫酸氨糖两种。氨基葡萄糖是自然界中唯一一种带氨基的糖，对蛋白质安全无毒，不会影响蛋白质的活性，其自带的氨基可用于蛋白子阴离子交换层析。
可见，将琼脂糖凝胶微球偶联上氨基葡萄糖基，制备成含氨基葡萄糖基的琼脂糖凝胶微球，即可作为一种良好的阳离子交换层析介质，分离纯化蛋白质、核酸等生物分子。目前，尚未出现利用氨基葡萄糖对琼脂糖凝胶微球进行改性的报道。
因此，开发出一种制备工艺简单易行、成本低、配基密度高、污染小的含氨基葡萄糖的基琼脂糖凝胶微球及其制备方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明提供一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法，可以有效解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种琼脂糖凝胶微球及其制备方法，以琼脂糖固体为基质，经交联剂活化后与硫酸酐混合反应，得到硫酸脂琼脂糖，再将其制备成所述琼脂糖凝胶微球；
其中，所述琼脂糖微球的粒径为10-1000微米。
进一步的，一种琼脂糖凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
1）在琼脂糖固体中加入一定量超纯水混合均匀，制得琼脂糖溶液；
2）向步骤1）所得琼脂糖溶液中缓慢加入nabh4，再按一定流速加入naoh溶液，并以50-200rpm的转速机械搅拌混匀；
3）在搅拌条件下，按一定流速向步骤2）所得溶液中加入交联剂，在一定温度下反应一定时间；其过程中，待反应至0.3-6h时将交联剂和naoh溶液的加入流速调小；
4）按一定流速向步骤3）所得溶液中加入硫酸酐溶液，并停止加入交联剂与naoh溶液，在一定温度下反应一定时间；
5）将步骤4）所得溶液用超滤膜过滤、浓缩后干燥，制得硫酸脂琼脂糖；
6）将步骤5）所得硫酸脂琼脂糖制备成微球。
进一步的，一种琼脂糖凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
1）将琼脂糖微球水洗后沥干，加入一定量超纯水混合均匀，制得琼脂糖微球溶液；
2）向步骤1）所得琼脂糖微球溶液中缓慢加入nabh4，再按一定流速加入naoh溶液，并以20-40khz低频超声震荡混匀；
3）在震荡条件下，按一定流速向步骤2）所得溶液中加入交联剂，在一定温度下反应一定时间；其过程中，待反应至0.3-6h时将交联剂和naoh溶液的加入流速调小；
5）将步骤4）所得溶液用滤布过滤，洗净，得到硫酸脂琼脂糖凝胶微球，将所得微球于20wt％乙醇溶液中贮存。
其中，步骤1）中所用琼脂糖固体或琼脂糖微球与超纯水的重量比为1:50-8:25。
其中，上述步骤2）中nabh4的加入量为所用琼脂糖固体或琼脂糖微球重量的0.0001-0.02%；所述naoh溶液的浓度为1wt%-50wt%；
步骤3）中所述交联剂为环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、2,3-二溴丙醇、乙二醇二缩水甘油醚或1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
其中，步骤2）和步骤3）中，naoh溶液加入的起始流速控制在0.01ml-5ml/min，之后调小至起始流速的0.05-0.5倍，加入总时间控制在0.5-12h；
交联剂加入的起始流速控制在0.01ml-3ml/min，之后调小至起始流速的0.05-0.5倍，加入总时间控制在0.5-12h。
其中，步骤3）中反应温度为20-70℃，反应时间为0.5-12h。
其中，步骤4）中硫酸酐的用量为所用琼脂糖固体或琼脂糖微球重量的0.01-10%，所用硫酸酐溶液的浓度为1wt%-80wt%；
硫酸酐溶液加入的流速控制在0.01ml-2ml/min，加入时间控制在0.5-12h；
反应温度为20-90℃，反应时间为0.5-12h。
其中，步骤6）中采用粒径均一的琼脂糖凝胶微球生产系统将硫酸酐琼脂糖制备成微球；所述粒径均一的琼脂糖凝胶微球生产系统包括生产区和位于生产区旁侧的控制区，所述生产区内设置有胶磨机和预混加热釜，所述胶磨机与一微波加热釜相连接，所述预混加热釜与一超声波均一消泡釜相连接，所述微波加热釜和超声波均一消泡釜均与一超声波均质釜相连接，所述超声波均质釜与油水分离器相连接，所述油水分离器的油相出口与油品分离纯化设备相连接，所述油品分离纯化设备还与所述预混加热釜相连接，所述油水分离器的水相出口与一微球清洗器相连接，所述微球清洗器与一混匀器相连接，所述混匀器与一计量分装机相连接；
制备时，将所得硫酸酐琼脂糖配制成水溶液，通过胶磨机进行处理后，再经微波加热釜充分溶解形成胶液；同时将油相经预混加热釜混合加热，再经超声均一消泡釜进行均质预乳化消泡处理后形成无泡油相；随后将无泡油相与胶液输送到超声波均质釜进行混合，然后将混合液输送到油水分离器，将分离得到的水相输入微球清洗器进行清洗后，将洗净的微球进行混匀、包装。
进一步的，所述生物活性成分包括蛋白质、核酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明所制备的硫酸酐琼脂糖凝胶微球具有对蛋白质、核酸、生物活性小分子等生物活性成分安全无毒的特性，可保证其活性，且具有配基密度高、机械强度高、孔径均一、稳定性好、吸附容量大、纯化效率高等优点。
2、本发明提供了硫酸酐琼脂糖凝胶微球的制备方法，其具有操作简单、反应条件温和、成本低、污染小等优点，解决了现有琼脂糖凝胶微球改性技术存在的制备工艺复杂、不易控制、成本高、污染严重，及存在的容易影响微球机械强度、表面光滑度与孔径大小等问题。对我国生物医药产业分离纯化技术方面的发展具有一定的推动作用，具有良好的社会、经济效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
称取40g琼脂糖固体，加入1000ml超纯水，混合均匀，制得琼脂糖溶液，然后缓慢加入nabh40.0004g，再持续用泵以0.5ml/min的流速加入20wt%的naoh溶液，机械搅拌混匀，搅拌转速为80rpm；在搅拌条件下，持续用泵以0.3ml/min的流速加入环氧氯丙烷，在50℃下反应1h，反应至0.3h时逐步将环氧氯丙烷加入的流速调小至0.03ml/min，将naoh溶液加入流速调小至0.05ml/min；再用泵以0.01ml/min的流速向溶液中加入10wt%硫酸酐溶液，并停止加入环氧氯丙烷与naoh溶液，55℃下反应1h；将所得溶液用4040超滤膜过滤、浓缩后干燥，制得硫酸酐琼脂糖。
采用粒径均一的琼脂糖凝胶微球生产系统，将所得硫酸酐琼脂糖制备成微球，其具体是将所得硫酸酐琼脂糖配制成水溶液，通过胶磨机进行处理后，再经微波加热釜充分溶解形成胶液；同时将油相经预混加热釜混合加热，再经超声均一消泡釜进行均质预乳化消泡处理后形成无泡油相；随后将无泡油相与胶液输送到超声波均质釜进行混合，然后将混合液输送到油水分离器，将分离得到的水相输入微球清洗器进行清洗后，将洗净的微球进行混匀、包装。所得琼脂糖凝胶微球中氨基葡萄糖基含量为3.05mmol/g。
实施例2
称取80g琼脂糖固体，加入1000ml的超纯水，混合均匀，制得琼脂糖溶液，缓慢加入nabh40.008g，再持续用泵以1ml/min的流速加入30wt%naoh溶液，机械搅拌混匀，搅拌转速为100rpm；在搅拌条件下，持续用泵以0.5ml/min的流速加入乙二醇二缩水甘油醚，在55℃下反应2h，反应至0.5h时逐步将乙二醇二缩水甘油醚加入的流速调小至0.05ml/min，将naoh溶液加入流速调小至0.1ml/min；再用泵以0.02ml/min流速向溶液中加入20wt%硫酸酐溶液，并停止加入乙二醇二缩水甘油醚与naoh溶液，65℃下反应1h；将所得溶液用8040超滤膜过滤、浓缩后干燥，制得硫酸酐琼脂糖。
按实施例1所述粒径均一的琼脂糖凝胶微球生产系统，将所得硫酸酐琼脂糖制备成微球。所得琼脂糖凝胶微球中硫酸酐含量为3.75mmol/g。
实施例3
称取60g琼脂糖微球水洗后沥干，加入1000ml超纯水混合均匀，制得琼脂糖微球溶液，缓慢加入nabh40.0012g，再持续用泵以0.8ml/min的流速加入40wt%naoh溶液，低频超声震荡混匀，其超声频率为25khz；在震荡条件下，持续用泵以0.4ml/min的流速加入乙二醇二缩水甘油醚，在40℃下反应8h，反应至4h时逐步将乙二醇二缩水甘油醚加入的流速调小至0.03ml/min，将naoh溶液加入流速调小至0.06ml/min；再用泵以0.05ml/min的流速向溶液中加入15wt%硫酸酐溶液，并停止加入乙二醇二缩水甘油醚与naoh溶液，45℃下反应1.5h；将所得琼脂糖微球溶液用滤布过滤，洗净，制得硫酸酐琼脂糖凝胶微球，将所得微球置于20wt％乙醇溶液中贮存。所得琼脂糖凝胶微球中硫酸酐含量为2.55mmol/g。
终上所述，本发明所制备的硫酸酐琼脂糖凝胶微球具有对蛋白质、核酸、生物活性小分子等生物活性成分安全无毒的特性，可保证其活性，且具有配基密度高、机械强度高、孔径均一、稳定性好、吸附容量大、纯化效率高等优点；提供了硫酸酐琼脂糖凝胶微球的制备方法，其具有操作简单、反应条件温和、成本低、污染小等优点，解决了现有琼脂糖凝胶微球改性技术存在的制备工艺复杂、不易控制、成本高、污染严重，及存在的容易影响微球机械强度、表面光滑度与孔径大小等问题。对我国生物医药产业分离纯化技术方面的发展具有一定的推动作用，具有良好的社会、经济效益。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。