等电聚焦装置和固定器的制作方法

等电聚焦装置和固定器
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求享有于2020年2月24日提交的美国专利申请no.16/799,387的权益，该美国专利申请要求享有于2019年10月2日提交的美国临时专利申请no.62/909,675、于2019年8月29日提交的美国临时专利申请no.62/893,549和于2019年8月12日提交的美国临时专利申请no.62/885,733的权益，并且本技术要求享有于2020年3月3日提交的美国专利申请no.16/808,063的权益，该美国专利申请要求享有于2019年10月2日提交的美国临时专利申请no.62/909,675、于2019年8月29日提交的美国临时专利申请no.62/893,549和于2019年8月12日提交的美国临时专利申请no.62/885,733的权益，这些申请中的每个都通过引用整体并入本文以用于所有目的。


背景技术：

3.本公开涉及用于样本处理和表征的方法、装置和系统及其各种用途。在第一方面中，本公开涉及用于对分析物混合物中的分析物执行分离和表征的方法、装置和系统，并且更具体地涉及用于并行地执行多重等电聚焦反应的多通道装置(及其相关方法和系统)。在第二方面中，本公开涉及微流体装置(及其相关方法和系统)，所述微流体装置被设计为执行一个或多个分离反应(例如，等电聚焦)并且随后使分离的分析物活动化(mobilization)和电喷雾离子化以用于通过质谱分析法进行表征。


技术实现要素：

4.本文公开了实现改进的用于对分析物混合物中的分析物分离和分析的定量性能的方法、装置和系统，这在生物医学研究、临床诊断和药物制造中具有潜在应用。例如，监管机构要求对生物药物和候选药物(例如蛋白质)进行严格表征。本文描述的方法和装置可以适用于表征蛋白质和/或其它分析物。在一些情况下，本文描述的方法和装置可以涉及表征分析物混合物，其中，执行一个或多个富集步骤以将分析物混合物分离成富集的分析物级分(fraction)。在一些情况下，本文描述的方法和装置可以涉及执行一个或多个富集步骤以将分析物混合物分离成多路复用形式的富集的分析物级分来用于样本的高通量表征。在一些情况下，本文描述的方法和装置涉及表征分析物混合物，其中，执行一个或多个富集步骤以将分析物混合物分离成富集的分析物级分，所述富集的分析物级分后来经由电喷雾离子化接口被引入到质谱仪中。所公开的方法和装置可以提供对分析物分离和表征的便利性、再现性和/或分析性能的改进。
5.在一个方面中，本文公开了一种固定器，所述固定器包括：电极贮器；入口流体通道，所述入口流体通道包括第一端部和第二端部；出口流体通道，所述出口流体通道包括与所述入口流体通道的所述第二端部流体联接的第一端部和与分离通道流体联接的第二端部，其中，所述入口流体通道和所述出口流体通道在限定或平行于所述电极贮器的表面的平面处彼此相交并且彼此流体地联接；以及膜，所述膜被布置在位于所述平面处或邻近于所述平面的所述电极贮器内，使得所述膜覆盖全部或基本全部开口，所述开口包括所述入
口流体通道和所述出口流体通道的所述相交部；其中，所述膜在定位在所述电极贮器内的高电压电极与容纳在所述入口流体通道和所述出口流体通道内的流体之间提供高流体动力阻力和低电阻连接。
6.在一些实施例中，所述膜是亲水性的。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，所述膜或开口的横截面积是介于约0.001mm2和100mm2之间。在一些实施例中，所述电极贮器还包括插入物，所述插入物被布置在所述电极贮器内并且被定位在所述膜处或邻近于所述膜定位，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，所述入口流体路径和出口流体路径有助于当所述电极贮器被填充有电解质溶液时基本无气泡地润湿所述膜的表面。
7.在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的流体动力阻力大于0.1((n/mm2)/(mm3/s))。在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的流体动力阻力大于1((n/mm2)/(mm3/s))。
8.在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的电阻小于10000000欧姆。在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的电阻小于100000欧姆。在一些实施例中，在操作期间，所述电极贮器被填充有浓度在约1毫摩尔(mm)至约500mm之间的电解质溶液。在一些实施例中，在操作期间，所述电极贮器被填充有浓度在约10mm至约150mm之间的电解质溶液。在一些实施例中，在操作期间，所述电极贮器被填充有ph范围在约1.5和约14之间的电解质溶液。在一些实施例中，所述分离通道包括毛细管的管腔。在一些实施例中，所述分离通道包括在微流体装置内的流体通道。在一些实施例中，所述分离通道被配置为执行电泳。在一些实施例中，所述分离通道被配置为执行等电聚焦。
9.本文还公开了一种流体装置，所述流体装置包括：至少一个流体入口；至少一个流体出口；至少一个分离通道，所述至少一个分离通道包括与所述至少一个流体入口流体联接的第一端部和与所述至少一个流体出口流体联接的第二端部；其中，至少一个流体入口或至少一个流体出口使用一种固定器被电联接到高电压电极，所述固定器包括：电极贮器；入口流体通道，所述入口流体通道包括第一端部和第二端部；出口流体通道，所述出口流体通道包括与所述入口流体通道的所述第二端部流体联接的第一端部和与所述至少一个流体入口或所述至少一个流体出口之一流体联接的第二端部，其中，所述入口流体通道和所述出口流体通道在限定或平行于所述电极贮器的表面的平面处彼此相交并且彼此流体地联接；以及膜，所述膜被布置在位于所述平面处或邻近于所述平面的所述电极贮器内，使得所述膜覆盖全部或基本全部开口，所述开口包括所述入口流体通道和所述出口流体通道的所述相交部；其中，所述膜在定位在所述电极贮器内的高电压电极与容纳在所述入口流体通道和所述出口流体通道内的流体之间提供高流体动力阻力和低电阻连接。
10.在一些实施例中，所述装置包括至少一根毛细管，并且其中，所述至少一根毛细管包括充当所述至少一个分离通道的管腔。在一些实施例中，所述装置是包括平面基底的微流体装置，并且其中，所述平面基底包括所述至少一个分离通道。在一些实施例中，所述至少一个流体入口或所述至少一个流体出口被布置在所述平面基底的至少一个边缘上。在一
些实施例中，所述膜是亲水性的。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，所述膜或开口的横截面积是介于约0.001mm2和100mm2之间。在一些实施例中，所述电极贮器还包括插入物，所述插入物被布置在所述电极贮器内并且被定位在所述膜处或邻近于所述膜定位，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，所述入口流体路径和出口流体路径有助于当所述电极贮器被填充有电解质溶液时基本无气泡地润湿所述膜的表面。在一些实施例中，在操作期间，所述电极贮器被填充有浓度在约1毫摩尔(mm)至约500mm之间的电解质溶液。在一些实施例中，在操作期间，所述电极贮器被填充有浓度在约10mm至约150mm之间的电解质溶液。在一些实施例中，在操作期间，所述电极贮器被填充有ph范围在约1.5和约14之间的电解质溶液。在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的流体动力阻力大于0.1((n/mm2)/(mm3/s))。在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的流体动力阻力大于1((n/mm2)/(mm3/s))。在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的电阻小于10000000欧姆。在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的电阻小于100000欧姆。
11.在一些实施例中，所述入口流体通道和出口流体通道的所述相交部与所述电极贮器之间的流体动力阻力和电阻的比率大于约0.001((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些实施例中，该比率大于约0.01((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些实施例中，该比率大于约0.1((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些实施例中，该比率大于约1((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些实施例中，该比率大于约10((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些实施例中，该比率大于约100((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些实施例中，该比率大于约1000((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些实施例中，该比率大于约10000((n/mm2)/(mm3/s))/ω。
12.在另一方面中，本文公开了用于并行地执行多个等电聚焦反应的方法，所述方法包括：a)提供一种包括平面基底的装置，其中，所述平面基底包括多个分离通道；b)将包含分析物混合物的样本引入到所述多个分离通道中的至少两个分离通道中；c)控制施加到所述至少两个分离通道的电压以执行所述多个等电聚焦反应来分离所述至少两个分离通道中的所述样本的所述分析物混合物；以及d)在并行地执行所述多个等电聚焦反应时独立地监测流过所述至少两个分离通道的电流。
13.在一些实施例中，所述多个分离通道中的所述至少两个分离通道的第一端部使用包含膜的高电压电极固定器被电联接到阳极液贮器。在一些实施例中，所述多个分离通道中的所述至少两个分离通道的第二端部使用包含膜的高电压电极固定器被电联接到阴极液贮器。在一些实施例中，施加到所述至少两个分离通道的电压是被独立地控制的。在一些实施例中，引入到所述至少两个分离通道中的所述样本是相同的，并且使用第一组实验条件以在所述至少两个分离通道的第一子集中执行所述等电聚焦反应，并且使用至少第二组实验条件以在所述至少两个分离通道的至少第二子集中执行所述等电聚焦反应。在一些实施例中，使用不同的一组实验条件以在所述至少两个分离通道中的每个中执行所述等电聚焦反应。在一些实施例中，用于执行所述多个等电聚焦反应的一组实验条件包括由以下各项构成的组中的至少一项：缓冲物选择、ph梯度选择、电压设置、电流设置、电场强度设置、用于改变电压设置、电流设置、电场强度设置的时间进程或等电聚焦反应时间。在一些实施
例中，引入到所述至少两个分离通道中的所述样本对于所述至少两个分离通道的至少两个子集是不同的，并且使用相同的一组实验条件以在所述至少两个分离通道中的每个中执行所述等电聚焦反应。在一些实施例中，引入到所述至少两个分离通道中的每个中的所述样本是不同的。在一些实施例中，所述方法还包括在执行所述多个等电聚焦反应的同时记录用于所述至少两个分离通道中的每个的电流迹线。在一些实施例中，所述方法还包括在所述等电聚焦反应完成后冲洗所述至少两个分离通道并且以自动的方式将另一个样本引入到所述至少两个分离通道中。在一些实施例中，在所述至少两个分离通道中的任一个中的故障检测对于已被引入到此分离通道中的所述样本而言触发自动重新引入和所述等电聚焦反应的重复。在一些实施例中，所述故障包括气泡的引入、气泡的形成、不正确制备的样本、未充满的试剂贮器或其任何组合。在一些实施例中，通过监测流过分离通道的电流或通过处理所述分离通道的图像来检测所述故障。在一些实施例中，所述方法还包括在执行等电聚焦的同时测量所述至少两个分离通道中的至少一个中的动态光散射。在一些实施例中，所述动态光散射的测量为一个或多个分离的分析物提供尺寸分布曲线的确定、聚集状态的确定或流体动力学半径的确定。在一些实施例中，所述包含膜的高电压电极固定器包括：a)电极贮器；b)入口流体通道，所述入口流体通道包括第一端部和第二端部；c)出口流体通道，所述出口流体通道包括与所述入口流体通道的所述第二端部流体联接的第一端部和与分离通道流体联接的第二端部，其中，所述入口流体通道和所述出口流体通道在限定或平行于所述电极贮器的表面的平面处彼此相交并且彼此流体地联接；以及d)膜，所述膜被布置在位于所述平面处或邻近于所述平面的所述电极贮器内，使得所述膜覆盖全部或基本全部开口，所述开口包括所述入口流体通道和所述出口流体通道的相交部；其中，所述膜在定位在所述电极贮器内的高电压电极与容纳在所述入口流体通道和所述出口流体通道内的流体之间提供高流体动力阻力和低电阻连接。在一些实施例中，所述膜是亲水性的并且包含纤维素或聚四氟乙烯(ptfe)。在一些实施例中，所述包含膜的高电压电极固定器还包括插入物，所述插入物被布置在所述电极贮器内并且被定位在所述膜处或邻近于所述膜定位，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，所述入口流体路径和出口流体路径有助于当所述电极贮器被填充有电解质溶液时基本无气泡地润湿所述膜的表面。在一些实施例中，所述方法还包括用浓度在约1毫摩尔(mm)至约500mm之间的电解质溶液填充所述电极贮器。在一些实施例中，所述方法还包括用浓度在约10mm至约150mm之间的电解质溶液填充所述电极贮器。在一些实施例中，所述电解质溶液具有在约1.5和约14之间的范围内的ph。
14.在又一方面中，本文公开了一种包括平面基底的微流体装置，其中，所述平面基底包括：a)多个流体入口，其中，所述多个流体入口的全部或一部分位于所述平面基底的一个或多个边缘上；b)多个分离通道，所述多个分离通道包括：i)第一端部，所述第一端部使用包含膜的高电压电极固定器被电联接到阳极液贮器；ii)第二端部，所述第二端部使用包含膜的高电压电极固定器被电联接到阴极液贮器；以及iii)所述多个分离通道中的每个分离通道的所述第一端部或所述第二端部之一与所述多个流体入口中的不同流体入口流体连通。
15.在一些实施例中，所述多个分离通道被配置为用于所述多个分离通道的全部或一部分的uv吸光度成像或荧光成像。在一些实施例中，所述微流体装置还包括盒筒，所述盒筒
容纳有包括所述多个分离通道的基底的全部或一部分，并且其中，所述盒筒包括多个包含膜的高电压电极固定器。在一些实施例中，所述盒筒是被配置为执行多路复用等电聚焦反应的系统的一次性部件。
16.本文还公开了一种用于执行多路复用等电聚焦反应的系统，所述系统包括：a)包括平面基底的微流体装置，其中，所述平面基底包括：i)多个流体入口，其中，所述多个流体入口的全部或一部分位于所述平面基底的一个或多个边缘上；以及ii)多个分离通道，所述多个分离通道包括：第一端部，所述第一端部使用包含膜的高电压电极固定器被电联接到阳极液贮器；第二端部，所述第二端部使用包含膜的高电压电极固定器被电联接到阴极液贮器；并且所述多个分离通道中的每个分离通道的所述第一端部或所述第二端部之一与所述多个流体入口中的不同流体入口流体连通；以及b)多路复用电源，其中，所述多路复用电源被配置为：i)控制施加到至少两个分离通道中的每个的电压；并且ii)在对包含分析物混合物的多个样本执行多路复用等电聚焦反应的同时独立地监测流过所述至少两个分离通道中的每个的电流。
17.在一些实施例中，所述多路复用电源被配置为独立地控制施加到所述至少两个分离通道中的每个的电压。在一些实施例中，所述系统还包括成像单元，所述成像单元被配置为(i)获取所述至少两个分离通道中的每个的全部或一部分的uv吸光度或荧光图像并且(ii)处理所述uv吸光度或荧光图像以检测在操作期间包含在分离通道内的一个或多个等电点(pi)标记的位置，以便可以为所述至少两个分离通道中的每个中的一个或多个分离的分析物峰确定pi值。在一些实施例中，所述系统还包括动态光散射单元，所述动态光散射单元被配置为测量所述多个分离通道中的至少一个分离通道中的动态光散射。在一些实施例中，所述系统还包括用于将样本装载到样本入口端口中的自动化液体装卸系统，所述样本入口端口经由所述多个流体入口流体地联接到所述多个分离通道。在一些实施例中，所述系统被配置为在所述多路等电聚焦反应完成后冲洗所述多个分离通道并且以自动的方式将另一组样本引入到所述多个分离通道中。在一些实施例中，在分离通道中的故障检测对于已被引入到此分离通道中的所述样本而言触发自动重新引入和所述等电聚焦反应的重复。
18.本文还公开了用于并行地执行多个等电聚焦反应的方法，所述方法包括：a)提供多个样本等分试样，其中，每个样本等分试样都包含分析物混合物；b)提供包括多个分离通道的装置，其中，所述多个样本等分试样中的一个样本等分试样被引入到每个分离通道中；以及c)提供多路复用电源，其中，所述多路复用电源被配置为在执行多个等电聚焦反应以分离每个样本中的所述分析物的同时独立地控制和监测流过所述多个分离通道中的每个的电流。
19.在一些实施例中，引入到每个分离通道中的所述样本等分试样是取自相同的样本，并且使用不同的一组实验条件以在所述多个分离通道的至少两个子集中执行所述等电聚焦反应。在一些实施例中，使用不同的一组实验条件以在所述多个分离通道中的每个中执行所述多个等电聚焦反应。在一些实施例中，引入到所述分离通道中的所述多个样本等分试样的至少两个子集是取自不同的样本，并且使用相同的一组实验条件以执行所述多个等电聚焦反应。在一些实施例中，引入到所述分离通道中的每个样本等分试样都是取自不同的样本。在一些实施例中，用于执行所述多个等电聚焦反应的一组实验条件包括缓冲物
选择、ph梯度选择、电压设置、电流设置、电场强度设置、用于改变电压设置、电流设置或电场强度设置的时间进程、等电聚焦反应时间或其任何组合。在一些实施例中，所述分析物包括蛋白质。在一些实施例中，所述装置包括微流体装置。在一些实施例中，所述微流体装置包括4个至8个分离通道。在一些实施例中，使用自动化液体装卸系统将所述样本等分试样引入到所述分离通道中。在一些实施例中，所述方法还包括在执行所述多个等电聚焦反应的同时记录用于所述多个分离通道中的每个的电流迹线。在一些实施例中，所述方法还包括使用成像技术监测所述多个等电聚焦反应以检测每个分离通道中的一个或多个分离的分析物峰的位置。在一些实施例中，所述成像技术包括全通道成像技术。在一些实施例中，所述成像技术包括uv吸光度成像或荧光成像。在一些实施例中，荧光成像包括天然荧光成像。在一些实施例中，所述方法还包括使用所述成像技术以检测一个或多个pi标记的位置，以便可以为一个或多个分离的分析物峰确定pi值。在一些实施例中，所述方法还包括在所述多个等电聚焦反应完成后冲洗所述分离通道并且以自动的方式将新的样本等分试样引入到所述分离通道中。在一些实施例中，用于引入所述多个样本等分试样、执行所述多个等电聚焦反应以及冲洗所述分离通道的自动循环时间是介于1分钟和30分钟之间。在一些实施例中，在所述多个分离通道中的任一个中的等电聚焦反应故障检测对于已被引入到此分离通道中的所述样本等分试样而言触发自动重新引入和所述等电聚焦反应的重复。在一些实施例中，所述等电聚焦反应故障包括气泡的引入、气泡的形成或其任何组合。在一些实施例中，通过监测流过分离通道的电流或通过处理所述分离通道的图像来检测所述等电聚焦反应故障。在一些实施例中，所述方法还包括在执行等电聚焦的同时测量所述多个分离通道中的至少一个通道中的动态光散射。在一些实施例中，所述动态光散射的测量为一个或多个分离的分析物提供尺寸分布曲线的确定。在一些实施例中，所述动态光散射的测量为一个或多个分离的分析物提供聚集状态的确定。在一些实施例中，所述动态光散射的测量为一个或多个分离的分析物提供流体动力学半径的确定。
20.本文还公开了微流体装置，所述微流体装置包括：a)多个入口端口；b)包括多个分离通道的基底，其中，每个分离通道的近侧端部都与不同的入口端口流体连通；以及c)多个出口端口，其中，每个分离通道的远侧端部都与不同的出口端口流体连通；其中，所述多个分离通道中的通道被配置为用于全通道成像。
21.在一些实施例中，所述微流体装置还包括用于每个分离通道的集成电极对，其中，每对电极中的一个电极与分离通道的近侧端部接触，而另一个电极与所述分离通道的远侧端部接触。在一些实施例中，所述微流体装置包括4个至8个分离通道。在一些实施例中，所述多个分离通道被配置为用于全通道uv吸光度成像。在一些实施例中，所述多个分离通道被配置为用于全通道荧光成像。在一些实施例中，所述多个分离通道内的至少一个通道被配置为用于执行动态光散射测量。在一些实施例中，在所述装置上没有贮器或凹孔(well)。在一些实施例中，所述入口端口位于所述装置的一个或多个边缘上，如图1a所示。在一些实施例中，所述出口端口位于所述装置的一个或多个边缘上，如图1a所示。在一些实施例中，所述微流体装置是用于执行等电聚焦反应的系统的一次性部件。在一些实施例中，所述微流体装置还包括盒筒，所述盒筒包含所述多个入口端口、所述多个出口端口或所述基底中的一部分或全部。在一些实施例中，所述盒筒是用于执行等电聚焦反应的系统的一次性部件。在一些实施例中，一个或多个入口端口或出口端口使用提供无气泡的电连接的包含膜
的高电压电极固定器来与高电压电极接合。在一些实施例中，所述包含膜的高电压电极固定器是图12中所示的。在一些实施例中，所述膜包括亲水性膜。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的膜覆盖的流体端口具有在约0.5mm至约2mm的范围内的直径。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的电极贮器包括插入物，所述插入物被定位在所述电极贮器内和所述电极贮器的底部处，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，所述入口流体路径和所述出口流体路径允许当所述电极贮器被填充时无气泡地润湿所述膜的表面。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个集成的包含膜的高电压电极固定器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个试剂贮器。在一些实施例中，所述至少一个试剂贮器包括阳极液贮器、阴极液贮器或活动化试剂贮器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个限流器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个阀。在一些实施例中，所述至少一个阀包括剪切阀。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19a所示的阀设计。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19b所示的阀设计。在一些实施例中，所述盒筒具有如图16、图17、图18、图19a或图19b中的任一图所示的侧歧管设计，以便提供用于对所述多个分离通道成像的间隙。
22.本文公开了用于并行地执行多个等电聚焦反应的系统，所述系统包括：a)包括多个分离通道的微流体装置，其中，所述装置包括：i)多个入口端口；ii)包括多个分离通道的基底，其中，每个分离通道的近侧端部都与不同的入口端口流体连通；和iii)多个出口端口，其中，每个分离通道的远侧端部都与不同的出口端口流体连通；其中，所述多个分离通道中的通道被配置为用于全通道成像；以及b)可编程多路复用电源，其中，所述多路复用电源被配置为在执行多个等电聚焦反应以将分析物混合物分离成其各自的组分的同时独立地控制和监测流过所述微流体装置中的所述多个分离通道中的每个的电流。
23.在一些实施例中，所述微流体装置还包括用于每个分离通道的集成电极对，其中，每对电极中的一个电极与分离通道的近侧端部接触，而另一个电极与所述分离通道的远侧端部接触。在一些实施例中，所述分离通道共用共同的阴极液。在一些实施例中，所述分离通道共用共同的阳极液。在一些实施例中，所述微流体装置包括4个至8个分离通道。在一些实施例中，所述多个分离通道被配置为用于全通道uv吸光度成像。在一些实施例中，所述多个分离通道被配置为用于全通道荧光成像。在一些实施例中，所述多个分离通道内的至少一个通道被配置为用于执行动态光散射测量。在一些实施例中，在所述微流体装置上没有贮器或凹孔。在一些实施例中，所述入口端口位于所述微流体装置的一个或多个边缘上，如图1a所示。在一些实施例中，所述出口端口位于所述装置的一个或多个边缘上，如图1a所示。在一些实施例中，所述微流体装置是所述系统的一次性部件。在一些实施例中，所述微流体装置还包括盒筒，所述盒筒包含所述多个入口端口、所述多个出口端口或所述基底中的一部分或全部。在一些实施例中，所述盒筒是所述系统的一次性部件。在一些实施例中，一个或多个入口端口或出口端口使用提供无气泡的电连接的包含膜的高电压电极固定器来与高电压电极接合。在一些实施例中，所述包含膜的高电压电极固定器是图12中所示的。在一些实施例中，所述膜包括亲水性膜。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的膜覆盖的流体端口具有在约0.5mm至约2mm的范围
内的直径。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的电极贮器包括插入物，所述插入物被定位在所述电极贮器内和所述电极贮器的底部处，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，所述入口流体路径和所述出口流体路径允许当所述电极贮器被填充时无气泡地润湿所述膜的表面。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个集成的包含膜的高电压电极固定器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个试剂贮器。在一些实施例中，所述至少一个试剂贮器包括阳极液贮器、阴极液贮器或活动化试剂贮器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个限流器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个阀。在一些实施例中，所述至少一个阀包括剪切阀。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19a所示的阀设计。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19b所示的阀设计。在一些实施例中，所述盒筒具有如图16、图17、图18、图19a或图19b中的任一图所示的侧歧管设计，以便提供用于对所述多个分离通道成像的间隙。在一些实施例中，所述系统还包括用于将样本等分试样装载到每个入口端口中的自动化液体装卸系统。在一些实施例中，所述自动化液体装卸系统被配置为用于将样本等分试样引入到每个分离通道中，所述样本等分试样是全部取自相同的样本，并且所述系统被配置为使用不同的一组实验条件以在所述多个分离通道的至少两个子集中执行所述等电聚焦反应。在一些实施例中，使用不同的一组实验条件以在所述多个分离通道中的每个中执行所述等电聚焦反应。在一些实施例中，所述自动化液体装卸系统被配置为用于将取自不同的样本的样本等分试样的至少两个子集引入到所述分离通道中，并且使用相同的一组实验条件以执行所述多个等电聚焦反应。在一些实施例中，引入到所述分离通道中的每个样本等分试样都取自不同的样本。在一些实施例中，用于执行所述多个等电聚焦反应的一组实验条件包括缓冲物选择、ph梯度选择、电压设置、电流设置、电场强度设置、用于改变电压设置、电流设置或电场强度设置的时间进程、等电聚焦反应时间或其任何组合。在一些实施例中，所述分析物包括蛋白质。在一些实施例中，所述可编程多路复用电源还被配置为在正执行所述等电聚焦反应的同时记录用于所述多个分离通道中的每个的电流迹线。在一些实施例中，所述系统还包括成像单元，所述成像单元被配置为获取所述多个分离通道的图像并且检测所述多个分离通道中的分离的分析物峰。在一些实施例中，所述成像单元被配置为执行所述多个分离通道的全通道成像。在一些实施例中，所述成像单元被配置为获取uv吸光度图像。在一些实施例中，所述成像单元被配置为获取荧光图像。在一些实施例中，所述荧光图像包括天然荧光图像。在一些实施例中，所述成像单元还被配置为检测一个或多个pi标记的位置，以便可以为一个或多个分离的分析物峰确定pi值。在一些实施例中，所述系统被配置为在所述多个等电聚焦反应完成后冲洗所述分离通道并且以自动的方式将新的样本等分试样引入到所述分离通道中。在一些实施例中，用于引入所述多个样本等分试样、执行所述多个等电聚焦反应以及冲洗所述分离通道的自动循环时间是介于1分钟和30分钟之间。在一些实施例中，在所述多个分离通道中的任一个中的等电聚焦反应故障检测对于已被引入到此分离通道中的所述样本等分试样而言触发自动重新引入和所述等电聚焦反应的重复。在一些实施例中，所述等电聚焦反应故障包括气泡的引入、气泡的形成或其任何组合。在一些实施例中，所述等电聚焦反应故障包括未适当制备的样本。在一些实施例中，所述等电聚焦反应故障包括空的或未充满的样本凹孔。在一些实施例中，通过监测流过分离通道的电流或通过处理所述分离通道的图像来检测所述等电聚焦反应故障。在一些实施例中，所述系统还包括动态光散射测量单元。在一些实施例中，
所述系统还包括流体流量控制器，所述流体流量控制器被配置为通过一个或多个分离通道、一个或多个动员剂(mobilizer)通道或一个或多个辅助流体通道提供独立受控的压力驱动流动。在一些实施例中，通过所述一个或多个分离通道、一个或多个动员剂通道或一个或多个辅助流体通道的所述压力驱动流动是无脉冲流动。在一些实施例中，所述系统还包括温度控制器，所述温度控制器被配置为将所述多个分离通道保持在恒定温度下。
24.本文还公开了这样的方法，即，所述方法包括：a)横过微流体装置中的分离通道施加电场，以经由等电聚焦执行分析物混合物的分离；b)在整个分离通道或其一部分中同时地且连续地对所述分离的分析物混合物的分离和活动化成像；以及c)经由电喷雾离子化将分离的和活动的分析物从所述微流体装置上的孔口驱排到质谱仪中；其中，所述微流体装置的取向相对于水平面倾斜，使得所述孔口向下指向所述质谱仪的入口。在一些实施例中，所述方法还包括将在所述分离通道中检测到的分离的分析物峰与用于所述分离的分析物的质谱仪数据相关联。在一些实施例中，通过吸光度成像检测所述分离的分析物峰。在一些实施例中，通过荧光成像检测所述分离的分析物峰。在一些实施例中，所述孔口与所述分离通道的电场电连通。在一些实施例中，所述孔口是所述微流体装置上的凹陷部，使得通过电喷雾离子化形成的泰勒锥被完全地布置在所述凹陷部内。在一些实施例中，所述微流体装置包括第一分离通道和第二分离通道。在一些实施例中，所述方法还包括：在施加所述电场以执行所述第二分离通道中的所述分析物混合物的所述等电聚焦分离之前，对所述第一分离通道中的所述分析物混合物进行色谱富集。在一些实施例中，所述方法还包括：在所述分析物混合物分离之前将两性电解质引入到所述分离通道中以在所述分离通道中产生ph梯度，在所述分离之前将等电点(pi)标记引入到所述分离通道中，以及在所述pi标记被分离的同时连续地对所述分离通道成像。在一些实施例中，所述分析物混合物包括完整蛋白质。在一些实施例中，通过使用压力将电解质引入到所述分离通道中来执行所述活动化。在一些实施例中，通过电泳将电解质引入到所述分离通道中来执行所述活动化。在一些实施例中，通过将电解质从与所述分离通道下游的汇合区流体连通的电解质通道引入到所述分离通道中来执行所述活动化。在一些实施例中，所述微流体装置包括两个电极以横过电解质引入通道产生电场。在一些实施例中，在所述微流体装置上没有贮器或凹孔。在一些实施例中，用于所述微流体装置的入口端口位于所述装置的一个或多个边缘上，如图2所示。在一些实施例中，用于所述微流体装置的出口端口位于所述装置的一个或多个边缘上，如图2所示。在一些实施例中，所述微流体装置是用于执行等电聚焦和质谱分析的系统的一次性部件。在一些实施例中，所述微流体装置是盒筒，所述盒筒包括分离通道、孔口、电解质引入通道、阳极液引入通道和用于离子化的气体输送通道。在一些实施例中，所述盒筒是用于执行等电聚焦和质谱分析的系统的一次性部件。在一些实施例中，所述微流体装置的一个或多个入口端口或出口端口使用提供无气泡的电连接的包含膜的高电压电极固定器来与高电压电极接合。在一些实施例中，所述包含膜的高电压电极固定器是图12中所示的。在一些实施例中，所述膜包括亲水性膜。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的膜覆盖的流体端口具有在约0.5mm至约2mm的范围内的直径。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的电极贮器包括插入物，所述插入物被定位在所述电极贮器内和所述电极贮器的底部处，其中，所述插入物包括入口流体路
径和出口流体路径，所述入口流体路径和所述出口流体路径允许当所述电极贮器被填充时无气泡地润湿所述膜的表面。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个集成的包含膜的高电压电极固定器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个试剂贮器。在一些实施例中，所述至少一个试剂贮器包括阳极液贮器、阴极液贮器或活动化试剂贮器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个限流器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个阀。在一些实施例中，所述至少一个阀包括剪切阀。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19a所示的阀设计。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19b所示的阀设计。在一些实施例中，所述盒筒具有如图16、图17、图18、图19a或图19b中的任一图所示的侧歧管设计，以便提供用于对所述多个分离通道成像的间隙。在一些实施例中，所述方法还包括提供用于将样本等分试样装载到每个入口端口中的自动化液体装卸系统。
25.本文公开了包括基底的微流体装置，其中，所述基底限定：a)一个或多个入口端口；b)至少一个分离通道，其被配置为执行分析物混合物的分离；以及c)与所述分离通道的端部流体连通的孔口，其中，所述孔口被配置为对从所述分离通道洗脱的分离的分析物级分执行电喷雾离子化并且将它们驱排到质谱仪中。
26.在一些实施例中，所述微流体装置还包括用于所述至少一个分离通道的集成电极对，其中，每对电极中的一个电极与分离通道的近侧端部接触，而另一个电极与所述分离通道的远侧端部接触。在一些实施例中，所述至少一个分离通道被配置为用于全通道uv吸光度成像。在一些实施例中，所述至少一个分离通道被配置为用于全通道荧光成像。在一些实施例中，在所述装置上没有贮器或凹孔。在一些实施例中，所述一个或多个入口端口位于所述装置的一个或多个边缘上，如图2所示。在一些实施例中，所述装置还包括辅助流体通道，所述辅助流体通道用于输送用于校准质量数据的校准溶液。在一些实施例中，所述微流体装置是用于对分析物混合物执行等电聚焦和质谱分析的系统的一次性部件。在一些实施例中，所述微流体装置还包括盒筒，所述盒筒包含一个或多个入口端口、孔口或基底中的一部分或全部。在一些实施例中，所述盒筒是用于对分析物混合物执行等电聚焦和质谱分析的系统的一次性部件。在一些实施例中，一个或多个入口端口使用提供无气泡的电连接的包含膜的高电压电极固定器来与高电压电极接合。在一些实施例中，所述包含膜的高电压电极固定器是图12中所示的。在一些实施例中，所述膜包括亲水性膜。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，所述膜包括刚性材料，例如，玻璃或陶瓷。在一些实施例中，所述膜可以被处理为亲水性的和/或不带电的。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的膜覆盖的流体端口具有在约0.5mm至约2mm的范围内的直径。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的电极贮器包括插入物，所述插入物被定位在所述电极贮器内和所述电极贮器的底部处，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，所述入口流体路径和所述出口流体路径允许当所述电极贮器被填充时无气泡地润湿所述膜的表面。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个集成的包含膜的高电压电极固定器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个试剂贮器。在一些实施例中，所述至少一个试剂贮器包括阳极液贮器、阴极液贮器或活动化试剂贮器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个限流器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个阀。在一些实施例中，所述至少一个阀包括剪切阀。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19a所示的阀设计。在一些实施例中，所述
剪切阀包括如图19b所示的阀设计。在一些实施例中，所述盒筒包括促进施加真空以从所述孔口的外表面去除多余的流体积聚的机构。在一些实施例中，所述盒筒包括雾化器机构以促进稳定泰勒锥的形成。在一些实施例中，所述盒筒具有如图16、图17、图18、图19a或图19b中的任一图所示的侧歧管设计，以便提供用于对所述多个分离通道成像的间隙。
27.本文公开了一种设备，所述设备包括：a)包括基底的微流体装置，其中，所述基底限定：i)一个或多个入口端口；ii)分离通道，其被配置为执行分析物混合物的分离；和iii)与所述分离通道的端部流体连通的孔口，其中，所述孔口被配置为对从所述分离通道洗脱的分离的分析物级分执行电喷雾离子化并且将它们驱排到质谱仪中，其中，所述微流体装置的取向相对于水平面倾斜，使得所述孔口向下指向所述质谱仪的入口；以及b)成像装置，所述成像装置被配置为在整个分离通道或其一部分中同时地且连续地对所述分离的分析物混合物的分离和洗脱成像。
28.在一些实施例中，所述系统还包括质谱仪。在一些实施例中，所述设备还被配置为将在所述分离通道中检测到的分离的分析物峰与用于所述分离的分析物的质谱仪数据相关联。在一些实施例中，所述分离包括色谱分离。在一些实施例中，所述设备还包括至少两个电极，其中，所述至少两个电极被配置为横过所述分离通道施加电场以经由等电聚焦分离所述分析物混合物。在一些实施例中，所述设备还包括至少两个电极，其中，所述至少两个电极被配置为横过所述分离通道施加电场以经由电泳分离所述分析物混合物。在一些实施例中，通过吸光度成像检测与所述分离的分析物级分相对应的峰。在一些实施例中，通过荧光成像检测与所述分离的分析物级分相对应的峰。在一些实施例中，所述孔口与所述分离通道的电场电连通。在一些实施例中，所述孔口被定位在所述微流体装置上的凹陷部中，使得通过电喷雾离子化形成的泰勒锥被完全地布置在所述凹陷部内。在一些实施例中，所述孔口的外表面包括疏水性涂层以防止在操作期间有过多的流体积聚。在一些实施例中，所述微流体装置包括第一分离通道和第二分离通道。在一些实施例中，所述微流体装置被配置为在施加所述电场以执行所述第二分离通道中的所述分析物混合物的等电聚焦或电泳分离之前执行所述第一分离通道中的所述分析物混合物的色谱富集。在一些实施例中，等电点(pi)标记在执行等电聚焦分离之前被引入到所述分离通道中，并且用于绘制所述分离通道中的pi范围。在一些实施例中，所述设备还被配置为确定用于至少一个分离的分析物级分的等电点的值。在一些实施例中，所述分析物混合物包括完整蛋白质。在一些实施例中，通过使用压力将电解质引入到所述分离通道中来执行活动化。在一些实施例中，通过使用电泳将电解质引入到所述分离通道中来执行活动化。在一些实施例中，所述微流体装置还包括附加电解质引入通道，所述附加电解质引入通道在所述分离通道和孔口的汇合处与所述分离通道相交，并且其中，通过将电解质从所述电解质引入通道引入到所述分离通道中来执行所述活动化。在一些实施例中，所述设备还包括两个电极，所述两个电极被配置为横过所述电解质引入通道施加电场以引入活动化电解质。在一些实施例中，所述微流体装置还包括阳极液引入通道和用于离子化的气体输送通道。在一些实施例中，所述微流体装置还包括与所述分离通道对准的光学狭缝，使得光仅通过所述光学狭缝传输。在一些实施例中，在所述微流体装置上没有贮器或凹孔。在一些实施例中，所述微流体装置的所述一个或多个入口端口位于所述装置的一个或多个边缘上，如图2所示。在一些实施例中，所述微流体装置是所述设备的一次性部件。在一些实施例中，所述微流体装置还包括盒筒，所述盒
筒包含所述一个或多个入口端口、所述孔口和所述基底中的一部分或全部。在一些实施例中，所述盒筒是所述设备的一次性部件。在一些实施例中，一个或多个入口端口使用提供无气泡的电连接的包含膜的高电压电极固定器来与高电压电极接合。在一些实施例中，所述包含膜的高电压电极固定器是图12中所示的。在一些实施例中，所述膜包括亲水性膜。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的膜覆盖的流体端口具有在约0.5mm至约2mm的范围内的直径。在一些实施例中，在所述包含膜的高电压电极固定器内的电极贮器包括插入物，所述插入物被定位在所述电极贮器内和所述电极贮器的底部处，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，所述入口流体路径和所述出口流体路径允许当所述电极贮器被填充时无气泡地润湿所述膜的表面。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个集成的包含膜的高电压电极固定器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个试剂贮器。在一些实施例中，所述至少一个试剂贮器包括阳极液贮器、阴极液贮器或活动化试剂贮器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个限流器。在一些实施例中，所述盒筒包括至少一个阀。在一些实施例中，所述至少一个阀包括剪切阀。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19a所示的阀设计。在一些实施例中，所述剪切阀包括如图19b所示的阀设计。在一些实施例中，所述盒筒包括促进施加真空以从所述孔口的外表面去除多余的流体积聚的机构。在一些实施例中，所述设备还包括促进施加真空以从所述孔口的外表面去除多余的流体积聚的机构。在一些实施例中，所述设备还包括擦拭器机构以从所述孔口的外表面去除多余的流体积聚。在一些实施例中，所述盒筒包括雾化器机构以促进稳定泰勒锥的形成。在一些实施例中，所述设备还包括雾化器机构以促进稳定泰勒锥的形成。在一些实施例中，所述盒筒具有如图16、图17、图18、图19a或图19b中的任一图所示的侧歧管设计，以便提供用于对所述多个分离通道成像的间隙。在一些实施例中，所述设备还包括流体流量控制器，所述流体流量控制器被配置为通过一个或多个分离通道、一个或多个动员剂通道或一个或多个辅助流体通道提供独立受控的压力驱动流动。在一些实施例中，通过所述一个或多个分离通道、一个或多个动员剂通道或一个或多个辅助流体通道的所述压力驱动流动是无脉冲流动。在一些实施例中，所述设备还包括温度控制器，所述温度控制器被配置为将所述多个分离通道保持在恒定温度下。在一些实施例中，所述微流体装置包括辅助流体通道，所述辅助流体通道用于输送用于校准质量数据的校准溶液。在一些实施例中，所述成像装置可以被配置为在从所述分离通道洗脱分析物级分期间充当点检测器，以便为基于时间的色谱图提供改进的时间分辨率。在一些实施例中，介于4个到16个之间的成像装置像素被分拣(binned)以充当点检测器。在一些实施例中，来自分拣的像素的强度数据以至少1hz的速率被读出。
29.本文公开的是固定器，所述固定器包括：a)电极贮器；b)在一平面处相交的入口流体通道和出口流体通道；以及c)膜，所述膜在所述平面上被定位在所述电极贮器内，以便使其覆盖包括所述入口流体通道和所述出口流体通道的所述相交部的开口；其中，所述膜促进在高电压电极与在所述入口流体通道和出口流体通道内的流体之间形成无气泡的电连接。
30.在一些实施例中，所述固定器包括如图12所示的设计。在一些实施例中，所述膜包括亲水性膜。在一些实施例中，所述膜包括再生纤维素膜。在一些实施例中，所述膜包括已
被处理为亲水性的编织聚四氟乙烯(ptfe)膜。在一些实施例中，由所述膜覆盖的所述开口具有在约0.5mm至约2mm的范围内的直径。在一些实施例中，所述电极贮器还包括插入物，所述插入物被定位在所述电极贮器内和所述电极贮器的底部处以及所述膜的顶部上，其中，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路，所述入口流体路径和所述出口流体路径允许当所述电极贮器被填充时无气泡地润湿所述膜的表面。
31.本文公开了包括如图19a或图19b所示的设计的剪切阀。
32.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，其在程度上与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示以通过引用整体并入本文的程度相同。如果本文中的术语与并入的参考文献中的术语发生冲突，则以本文中的术语为准。
附图说明
33.本发明的新颖特征在所附权利要求书中被具体地阐述。通过参考以下阐述说明性实施例的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施例中利用了本发明的原理，其中：
34.图1a提供根据本公开的一个方面的包括四通道等电聚焦设计的微流体装置的非限制性示意图。
35.图1b提供包括本公开的电喷雾尖端的示例性微流体装置的流体通道网络的非限制性示意图。
36.图2提供用于执行一个或多个分离反应(例如，等电聚焦反应，然后是电喷雾离子化)的微流体装置的一个非限制性示例的示意性自上而下的视图。
37.图3提供用于执行一个或多个分离反应(例如，等电聚焦反应，然后是电喷雾离子化)的微流体装置的一个非限制性示例的剖视图。
38.图4提供示例性废物管理系统的示意图。
39.图5提供另一个示例性废物管理系统的示意图。
40.图6示意性地示出包括夹持模块的废物管理系统的又一个示例。
41.图7示意性地示出包括管式真空设备的废物管理系统的又一个示例。
42.图8示意性地示出使用正压的废物管理系统的又一个示例。
43.图9示意性地示出示例性雾化器。
44.图10a至图10d示意性地示出雾化器的附加的非限制性示例。图10a：第二雾化器设计的前视图。图10b：第二雾化器设计的等距视图。图10c：第三雾化器设计的剖切俯视图。图10d：第三雾化器设计的剖切侧视图。
45.图11a至图11d示意性地示出雾化器设计的第四示例。图11a：如安装在微流体装置盒筒上的局部剖视图。图11b：孤立的局部剖视图。图11c：剖视侧视图。图11d：剖视俯视图。
46.图12示意性地示出固定器的示例。
47.图13a至图13f示意性地示出包括膜的固定器的非限制性示例。图13a：局部剖视图。图13b：电极贮器的俯视图。图13c：电极贮器的局部剖视图。图13d：电极贮器的底部的俯视图。图13e：电极贮器的底部的剖切细节。图13f：电极贮器的底部的剖切侧视图。
48.图14示意性地示出向系统的一个或多个贮器提供试剂的示例性方法。
49.图15示意性地示出向一个或多个贮器提供试剂的示例性方法。
50.图16示意性地示出如本文的某些实施例中所描述的包括盒筒的示例性系统。
51.图17示出包括本公开的微流体装置的盒筒的示例性实施例。
52.图18示出包括本公开的微流体装置的盒筒的另一个示例性实施例。
53.图19a至图19b示出包括本公开的微流体装置和剪切阀在内的盒筒的附加的示例性实施例。图19a：包括旋转剪切阀的盒筒。图19b：包括弹簧加载的剪切阀的盒筒。
54.图20示出包括本公开的微流体装置的盒筒的另一个示例性实施例。
55.图21示意性地示出固定特征部的非限制性示例，所述固定特征部可以用于将装置固定到盒筒。
56.图22示意性地示出固定特征部的非限制性示例，所述固定特征部可以用于产生盒筒对装置的流体密封。
57.图23示意性地示出与盒筒或装置的贮器电连接的非限制性示例。
58.图24示意性地示出安装板的非限制性示例，所述安装板用于将一个或多个贮器单元联接到也与仪器接合的盒筒。
59.图25示出具有贮器结构的示例性盒筒。
60.图26示出具有贮器结构的另一个示例性盒筒。
61.图27示出具有贮器结构的又一个示例性盒筒。
62.图28a至图28d示出本文公开的示例性成像系统的不同透视图。图28a：包括扫描(或转向)镜的成像系统。图28b：包括用于全通道成像的镜的成像系统。图28c：图28b的成像系统的详细视图。图28d：图28b和图28c中所示的成像系统的俯视图。
63.图29示意性地示出用于将根据本文描述的实施例的微流体分离装置/盒筒与质谱仪接合的示例性系统。
64.图30示意性地示出根据本文描述的实施例的另一个示例性系统。
65.图31示意性地示出根据本文描述的实施例的示例性系统。
66.图32a至图32b示出活动化反应和淌度(mobility)色谱图的示例性数据。图32a：uv吸光度对比用于对分离通道成像的图像传感器的像素数的图表。图32b：从例如图32a所示的数据导出的活动化色谱图(uv吸光度对比时间的图表)。
67.图33示出用于所公开的系统的一个实施例的软件架构的非限制性示例。
68.图34示出本公开的一个实施例中的集成系统的框图的非限制性示例。
69.图35示出本公开的一个实施例中的集成系统的框图的另一个非限制性示例。
70.图36提供计算机控制的电压反馈回路(其中esi尖端被保持在0v处)的示例性流程图。
71.图37提供电压反馈回路(其中esi尖端被保持在+3000v处)的示例性流程图。
72.图38提供具有相交通道的示例性芯片的示意图。
具体实施方式
73.本文公开了用于并行地执行多个等电聚焦反应(或其它分离反应)以用于通过等电点(或其它物理化学性质)快速且准确地分离和表征蛋白质分析物混合物或其它生物分子的方法、装置和系统。本技术的主题与美国专利no.10,209,217b2和no.10,401,324b2的
主题以及共同未决的美国专利申请no.15/363,908、no.16/261,382、no.16/427,767和no.16/532,955的主题相关，这些申请中的每个都通过引用整体并入本文。
74.在本公开的一个方面中，描述了微流体装置，所述微流体装置包括用于并行地执行两个或更多个分离反应的两个或更多个分离通道，其中微流体的形式能够使用极小的输入样本体积来快速且准确地分离和表征分析物混合物。在一些实施例中，所述微流体装置包括平面基底，所述平面基底包括两个或更多个分离通道。在优选的方面中，分离反应是等电聚焦反应。在另一个优选的方面中，分析物混合物包括蛋白质分析物混合物，并且两个或更多个等电聚焦反应的并行执行能够快速且准确地分离分析物混合物中的蛋白质组分并且根据它们的等电点(pi)表征各个蛋白质组分。在一些情况下，与pi标记结合地使用成像(例如，全通道成像)以使用于等电聚焦的ph梯度中的pi标记的位置可视化而允许用于更准确地确定分析物混合物的分离的蛋白质组分的pi。
75.在本公开的另一个方面中，描述了用于操作所述微流体装置的方法和系统，其中使用两个或更多个高电压电源(或单个多路复用高电压电源)能够独立地控制微流体装置的每个分离通道中的分离反应或实验条件。因此，在一些情况下，微流体装置可以用于在相同的一组分离或实验条件下并行地执行两个或更多个不同样本的分离和表征。在一些情况下，微流体装置可以用于在两个或更多个不同的反应或实验条件下并行地执行相同样本的两个或更多个等分试样的分离和表征。在一些情况下，装置上的分离通道的子集可以用于在相同的一组分离或实验条件下执行多个样本的分离，并且可替代地或除此之外，装置上的分离通道的不同子集可以用于在多个不同的反应或实验条件下并行地执行来自相同样本的多个等分试样的分离和表征。
76.实验条件横过微流体装置的分离通道可以是相同的或不同的，并且可以包括缓冲物选择、电解质选择、ph梯度选择、电压设置、电流设置、电场强度设置、用于改变电压设置、电流设置、电场强度设置的时间进程、等电聚焦反应或其组合。
77.在一些情况下，本公开的系统包括所公开的微流体装置中的一个或多个以及两个或更多个高电压电源(或允许独立地控制两个或更多个通道的单个多路复用高电压电源)。在一些情况下，两个或更多个高电压电源(或允许独立地控制两个或更多个通道的单个多路复用高电压电源)被配置为监测和/或记录流过每个分离通道的电流。在一些情况下，分离通道(例如，分离通道的电流)的监测可以独立于其它分离通道的监测来执行。在一些情况下，流过每个分离通道的电流可以用作诊断工具，例如，以确定等电聚焦反应何时完成和/或以检测故障(例如，分离通道中的气泡的引入或形成、不正确制备的样本、未填充的试剂贮器或其组合)。在一些情况下，可以通过监测流过分离通道的电流或通过处理分离通道的图像来检测故障。在一些情况下，电压源可以被配置为在检测故障后关闭施加到分离通道的电压。在一些情况下，电压源可以被配置为在检测故障后重新开始分离反应。
78.在一些情况下，该系统还可以包括自动取样器或流体装卸系统，所述自动取样器或流体装卸系统被配置为用于将样本等分试样和/或其它分离反应试剂自动地且独立地控制加载到多个样本或试剂入口端口中。在一些情况下，该系统还可以包括流体流量控制器，所述流体流量控制器被配置为提供例如通过两个或更多个分离通道的独立受控的压力驱动流动(例如，用于单独使用或用于与施加到两个或更多个分离通道的电压梯度结合使用)。在一些情况下，该系统还可以包括自动取样器或流体流量控制器，所述自动取样器或
流体流量控制器被配置为在分离反应(例如，等电聚焦反应)后冲洗、清洗、冲刷或抽空两个或更多个分离通道。在一些情况下，在冲洗、清洗、冲刷或抽空两个或更多个分离通道后，自动取样器或流体流量控制器可以被配置为自动地将另一个样本(例如，不同的样本，或相同的样本的另一个等分试样)引入到两个或更多个分离通道中。在一些情况下，自动取样器或流体流量控制器可以被配置为如果检测(例如，经由电压或电流监测)故障(例如，气泡的形成或引入、不正确制备的样本、未填充的试剂贮器或其组合)的话自动地将样本、反应试剂或其组合重新引入到一个或多个分离通道中。在这样的情况下，在检测故障后，自动取样器或流体流量控制器会冲洗发生故障的分离通道，重新引入样本、反应试剂或其组合，并且可以重新发起(例如，通过由独立受控的电压源中的一个或多个施加电场)分离反应。
79.在一些情况下，该系统还可以包括成像模块，所述成像模块被配置为获取两个或更多个分离通道的一系列一个或多个图像。在一些情况下，图像的视场可以包括两个或更多个分离通道的全部或一部分。在一些情况下，成像可以包括在执行分离反应的同时的连续成像。在一些情况下，成像可以包括在执行分离反应的同时的间歇成像。在一些情况下，成像可以包括获取uv吸光度图像。在一些情况下，成像可以包括荧光图像，例如，天然荧光或由于附着于分析物的外源荧光标签的存在而产生的荧光。在一些情况下，成像模块可以被配置为例如确定等电聚焦反应何时完成和/或检测故障(例如，分离通道中的气泡的引入或形成)。
80.在一些情况下，该系统还可以包括微板装卸机器人模块，其被配置为运输和更换用作用于样本和/或试剂的来源的微板。在一些情况下，该系统还可以包括微流体装置装卸机器人模块，其被配置为例如在检测故障之后运输和更换在系统中使用的微流体装置。在一些情况下，微板装卸和微流体装置装卸可以由相同的机器人模块装卸。
81.在本公开的又一个方面中，描述了可以包括微流体装置的系统，所述微流体装置被设计为执行一个或多个分离反应，例如，等电聚焦反应，以将包含分析物混合物的样本分离成其各个组分，然后是分离的分析物的电喷雾离子化。在一些情况下，微流体装置可以被容纳在盒筒中，所述盒筒还包括例如高电压电极连接、试剂贮器、阀等。在一些情况下，微流体装置可以包括基本平面的基底，其中平面基底包括多个分离通道。在一些情况下，多个分离通道的一个或多个分离通道的第一端部使用一种固定器被电地和/或流体地联接到电极(例如，阳极液)贮器，所述固定器可以包括膜。在一些情况下，一个或多个分离通道的第二端部使用一种固定器被电地和/或流体地联接到电极(例如，阴极)贮器，所述固定器可以包括膜。膜可以在限定或平行于电极贮器的表面的平面处或附近被布置在电极贮器内，所述平面可以与入口流体通道和出口流体通道相交。膜可以覆盖包括入口流体通道和出口流体通道的相交部的开口的全部或基本全部。在一些情况下，该系统还可以包括分析仪器，例如，质谱仪。所公开的方法、装置和系统能够改进分离数据的再现性和定量准确性，并且还能够改进分离数据和下游分析表征数据(例如，使用质谱仪或其它分析仪器获得的数据)之间的相关性。
82.如上所述，所公开的方法、装置和系统的关键特征是使用成像来监测分离通道中的分离反应，以用于检测分析物峰的存在和/或确定何时分离反应已经完成的目的。在一些情况下，可以为分离通道的全部或一部分采集图像。在一些情况下，可以在执行分离步骤和/或活动化步骤的同时执行分离通道的全部或一部分的成像。在一些情况下，图像可以用
于检测分离通道内富集的分析物峰的位置。在一些情况下，图像可以用于检测分离通道内的一个或多个标记或指示物的存在，例如，等电点(pi)标准，并且从而确定用于一个或多个分析物的pi。在一些情况下，图像可以用于检测分离通道中的故障(例如，气泡形成)。在一些情况下，从这些图像导出的数据可以用于确定分离反应何时完成(例如，通过监测峰速度、峰位置和/或峰宽度)并且随后触发活动化步骤。
83.在一些情况下，活动化步骤可以包括将活动化缓冲液或活动化电解质引入到分离通道中。在一些情况下，活动化缓冲液或活动化电解质可以使用流体动力压力引入。在一些情况下，活动化缓冲液或活动化电解质可以借助于电泳引入。在一些情况下，活动化缓冲液或活动化电解质可以借助于电泳和流体动力压力的组合引入。在一些情况下，一系列一个或多个分离的分析物带的活动化可以包括促使分离的分析物带朝向分离通道的出口或远侧端部迁移。在一些情况下，一系列一个或多个分离的分析物带的活动化可以包括促使分离的分析物带朝向与下游分析仪器流体连通的分离通道的出口或远侧端部迁移。在一些情况下，分离通道的出口或远侧端部可以与电喷雾离子化(esi)接口流体连通，使得迁移的分析物峰被注入质谱仪中。在一些情况下，用于检测分析物峰位置和确定分析物pi的图像数据也可以用于将分析物分离数据与质谱数据相关联。在一些情况下，用于检测分析物峰位置的图像数据可以用于产生关于活动化反应的信息和/或将活动化信息与质谱数据相关联。
84.在一些情况下，可以使用其它表征技术来监测一个或多个分离反应。在一些情况下，在执行分离反应(例如，等电聚焦)的同时，可以在分离通道中的至少一个中使用动态光散射。在一些情况下，动态光散射可以用于为一个或多个分析物确定尺寸分布曲线、聚集状态或流体动力学半径。一个或多个分析物可以使用分离反应(例如，等电聚焦)分离。
85.在优选的方面中，所公开的方法可以以微流体装置的形式执行，从而允许用于处理极小的样本体积和整合两个或更多个样本处理和分离步骤。在另一个优选的方面中，所公开的微流体装置包括用于联接到下游分析仪器的集成接口，例如，用于对分离的分析物执行质谱分析的esi接口。在一些情况下，所公开的方法可以以更常规的毛细管的形式执行。
86.本文描述的所公开的方法、装置和系统的各个方面可以被应用于以下阐述的任何特定应用。将应理解，所公开的方法、装置和系统的不同方面可以被单独地、共同地或彼此组合地理解。
87.定义：除非另有定义以外，本文使用的所有技术术语的含义与本公开所属领域的技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
88.如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数引用，除非上下文另有明确规定以外。本文对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”，除非另有阐述以外。类似地，术语单数形式的“包括”、复数形式的“包括”、“正包括”、单数形式的“包含”、复数形式的“包含”和“正包含”旨在非限制性的。
89.如本文所使用的，短语“包括，但不限于
……”
和“一个非限制性示例是
……”
意味着包括给定示例的变体和派生物，如由本公开所属领域的技术领域的普通技术人员通常所理解的。
90.如本文所使用的，术语“约”一个数字是指该数字加上或减去该数字的10％。术语“约”当在范围的上下文中使用时是指该范围减去其最小值的10％和加上其最大值的10％。
91.如本文所使用的，术语“表征”和“分析”可以被可互换地使用。“表征”或“分析”通常可以意味着评估样本，例如，以确定样本或其组分的一种或多种性质，或以确定样本的身份。
92.如本文所使用的，术语“芯片”和“装置”可以在本文中被可互换地使用。
93.如本文所使用的，术语“分析物”和“物类”可以被可互换地使用。分析物通常意味着在可测量的属性上与另一分子、生物分子、化学物、高分子等不同的分子、生物分子、化学物、高分子等。例如，两种物类可以具有略有不同的质量、疏水性、电荷或净电荷、等电点、功效，或者可以在化学修饰、蛋白质修饰等方面不同。
94.样本：所公开的方法、装置、系统和软件可以用于分离和表征从多种生物或非生物样本中的任一者获得的分析物。示例包括但不限于组织样本、细胞培养样本、全血样本(例如，静脉血、动脉血或毛细血管血液样本)、血浆、血清、唾液、间质液、尿液、汗液、泪液、得自工业酶或生物药物制造过程的蛋白质样本、环境样本(例如，空气样本、水样本、土壤样本、表面擦拭样本)和类似物。在一些实施例中，在使用所公开的用于综合化学分离和表征的方法和装置进行分析之前，可以使用由本领域的技术人员已知的多种技术中的任一种来处理样本。例如，在一些实施例中，可以处理样本以提取蛋白质或核酸。可以从多种来源或受试者中的任一种(例如，细菌、病毒、植物、动物或人类)收集样本。
95.样本体积：在所公开的方法和装置的一些实例中，使用微流体装置的形式会使得能够处理非常小的样本体积。在一些实施例中，加载到装置中并且用于分析的样本体积可以在约0.1μl至约1ml的范围内。在一些实施例中，加载到装置中并且用于分析的样本体积可以是至少0.1μl、至少1μl、至少2.5μl、至少5μl、至少7.5μl、至少10μl、至少25μl、至少50μl、至少75μl、至少100μl、至少250μl、至少500μl、至少750μl或至少1ml。在一些实施例中，加载到装置中并且用于分析的样本体积可以是至多1ml、至多750μl、至多500μl、至多250μl、至多100μl、至多75μl、至多50μl、至多25μl、至多10μl、至多7.5μl、至多5μl、至多2.5μl、至多1μl或至多0.1μl。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些实施例中，加载到装置中并且用于分析的样本体积可以在约5μl至约500μl的范围内。本领域的技术人员将认识到，用于分析的样本体积可以具有在该范围内的任何值，例如，约18μl。
96.分析物：在一些情况下，样本可以包括多种分析物类。在一些情况下，样本中存在的分析物类的全部或一部分可以在分析之前或分析期间被富集。在一些情况下，这些分析物可以是例如聚糖、碳水化合物、核酸分子(例如，dna、rna)、肽、多肽、重组蛋白、完整蛋白、蛋白质异形体、消化蛋白质、融合蛋白质、抗体药物偶联物、蛋白质药物偶联物、代谢物或其它生物学相关分子。在一些情况下，这些分析物可以是小分子药物。在一些情况下，这些分析物可以是蛋白质混合物中的蛋白质分子，例如，生物蛋白质药物(例如，酶药物或抗体药物)和/或从培养物或体内隔离的细胞中收集的裂解物。
97.微流体装置：本文公开了被设计为即在多个分离通道内并行地执行多个分析物分离反应的装置。在一些情况下，所公开的装置是微流体装置，其被设计为即在装置内的多个分离通道内并行地执行多个分析物分离反应。在一些情况下，微流体装置可以被设计为对在同一装置中即在装置内的多个第一分离通道、第二分离通道、第三分离通道等内的多个
分析物样本并行地执行一个或多个不同的分离步骤，即，第一分离反应、第二分离反应、第三分离反应等。在优选的实例中，分离步骤中的至少一个可以包括等电聚焦，并且该装置可以被设计为即在装置内的两个或更多个分离通道中并行地执行两个或更多个等电聚焦反应。在一些情况下，可以选择分离通道的数量，例如，4个、6个或12个，以与用作样本和/或试剂源的微板凹孔的布局相一致。
98.在一些情况下，微流体装置包括基本平面的基底，其中平面基底包括：多个流体入口，所述多个流体入口或其一部分位于平面基底的一个或多个边缘处；以及多个分离通道，所述多个分离通道包括(i)第一端部，所述第一端部使用第一固定器被电联接到电极贮器(例如，阳极液贮器)，和(ii)第二端部，所述第二端部使用第二固定器被电联接到另一个电极贮器(例如，阴极液贮器)，并且其中，所述多个分离通道中的每个分离通道的第一端部或第二端部之一与多个流体入口中的不同流体入口流体连通。在一些情况下，第一固定器和/或第二固定器包括膜。在一些情况下，第一固定器和/或第二固定器是高电压电极固定器并且任选地包括膜。
99.图1a提供根据本公开的一个方面的包括四通道等电聚焦设计的微流体装置的非限制性示意图，如在以下示例1中将更详细讨论的。
100.图1b提供根据本公开的第二方面的用于执行分离反应并且包括电喷雾尖端的示例性微流体装置的流体通道网络的非限制性示意图，如在以下示例14中将更详细描述的。
101.在一些情况下，在被配置用于并行地执行每个分离步骤(例如，等电聚焦反应)的装置内的分离通道的数量可以是至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个或多于20个。在一些情况下，在被配置为用于并行地执行每个分离步骤的装置内的分离通道的数量可以是至多20个、至多18个、至多16个、至多14个、至多12个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，在被配置为用于并行地执行每个分离步骤的装置内的分离通道的数量可以在约4个至约12个的范围内。本领域的技术人员将认识到，在被配置为用于并行地执行每个分离步骤的装置内的分离通道的数量可以具有在该范围内的任何值，例如，约5个。
102.在一些情况下，多个分离通道的每个分离通道的近侧端部都与不同的入口端口流体连通，以便可以将不同的样本或样本等分试样引入到每个分离通道中。在一些情况下，多个分离通道的子集中的每个分离通道的近侧端部都与相同的入口端口流体连通，以便可以将相同的样本或样本等分试样引入到分离通道的子集中。在一些情况下，多个分离通道的每个分离通道的近侧端部都与上游分离通道的远侧端部或出口端部流体连通。
103.在一些情况下，多个分离通道的每个分离通道的远侧端部都与不同的出口端口流体连通。在一些情况下，多个分离通道的子集中的每个分离通道的远侧端部都与相同的出口端口流体连通。在多个分离通道之中的共用出口端口的这种示例可以用于去除其中的内容物，例如，以便促进废物收集。在一些情况下，多个分离通道的每个分离通道的远侧端部都与下游分离通道的近侧端部或入口端部流体连通。
104.在一些情况下，所公开的微流体装置可以包括两个或更多个集成电极，其被配置为沿着分离通道或沿着与分离通道相交的互连通道施加电压梯度。在一些情况下，该装置
包括用于每个分离通道的集成电极对，其中每对电极中的一个电极与分离通道的近侧端部接触，而另一个电极与所述分离通道的远侧端部接触。在一些情况下，所公开的微流体装置可以每个分离通道都包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个集成电极。在一些情况下，所公开的微流体装置可以包括用于每个分离阶段处的每个分离通道的集成电极对，例如，第一分离通道、第二分离通道、第三分离通道等。
105.除了多个分离通道(例如，两个或更多个第一分离通道、两个或更多个第二分离通道、两个或更多个第三分离通道等)之外，本公开的装置或微流体装置可以包括多个入口端口、出口端口、样本和/或试剂引入通道、互连通道、样本和/或试剂废物通道、贮器(例如，样本贮器、试剂贮器或废物贮器)、微型泵、微型阀、通风口、捕集器、过滤器、膜和类似物，或它们的任何组合。
106.可以使用由本领域的技术人员已知的多种制造技术和材料中的任一者来制造所公开的装置和微流体装置。在一些情况下，这些装置可以被制造为一系列两个或更多个分离的零件，并且随后被机械地夹持或被永久地粘合在一起以形成完整的装置。在一些情况下，例如，流体通道(在本文中有时也被称为“微通道”)可以被制造在第一层中(例如，通过玻璃基底的光刻图案化和通道的湿法化学蚀刻至所需深度)，并且继而通过将第二层粘合到第一层来密封，其中与流体通道相交的第二层中的通孔提供通向流体通道的外部通路。在一些情况下，流体通道可以被制造在第一层中(例如，通过在合适的聚合物膜中激光切割通道图案)，并且继而通过将第一层夹在第二层和第三层之间并且将第一层粘合在第二层和第三层之间来密封，其中与流体通道相交的第二层和/或第三层中的通孔提供通向流体通道的外部通路。在后一个示例中，第一层的厚度限定流体通道的厚度(或深度)。
107.合适的制造技术的示例包括但不限于传统机械加工、cnc机械加工、注塑成型、3d打印、一层或多层激光或模切聚合物薄膜的对准和层压或许多微加工技术中的任一者，例如，光刻和湿法化学蚀刻、干法蚀刻、深反应离子蚀刻或激光微加工。在一些实施例中，微流体结构可以由弹性体材料进行3d打印得到。
108.可以使用由本领域的技术人员已知的多种材料中的任一种来制造所公开的装置和微流体装置。一般来说，所使用的材料的选择取决于制造技术的选择，并且反之亦然。合适材料的示例包括但不限于玻璃，石英，熔融石英，硅，多种聚合物中的任一种，例如，聚二甲基硅氧烷(pdms；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、多氟聚乙烯、高密度聚乙烯(hdpe)、聚醚醚酮、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(cop)、环状烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚醚醚酮(peek)、环氧树脂、诸如特氟龙(聚四氟乙烯(ptfe))的不粘材料、诸如su8的各种光刻胶或任何其它厚膜光刻胶，或这些材料的任何组合。在一些情况下，在包括多个层的装置或微流体装置中的不同层可以由不同材料制造。在一些情况下，在包括一个或多个层的装置或微流体装置中的给定单层可以由两种或更多种不同的材料制造。
109.在一些情况下，装置或微流体装置的全部或一部分可以是光学透明的(例如，对紫外线(uv)、可见光和/或近红外光而言透明的)以促进分离通道和/或装置的其它部分的成像。在一些情况下，分离通道的全部或一部分被配置为用于成像，例如，全通道成像。例如，在一些情况下，分离通道可以被制造在光学不透明材料的层中，所述光学不透明材料的层被夹在光学透明材料的两个层之间，由此形成“光学狭缝”，通过所述“光学狭缝”可以传输
和/或收集光。
110.通常，在所公开的装置中的流体通道、样本和/或试剂贮器等的尺寸将被优化以(i)向包含分析物混合物的样本或样本等分试样提供快速、准确且可再现的分离并且(ii)将样本和试剂的消耗减到最少。通常，流体通道或贮器的宽度可以是介于约10μm和约2mm之间。在一些情况下，流体通道(或贮器)的宽度可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少750μm、至少1mm、至少1.5mm或至少2mm。在一些情况下，流体通道(或贮器)的宽度可以至多2mm、至多1.5mm、至多1mm、至多750μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多50μm、至多25μm或至多10μm。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，流体通道(或贮器)的宽度可以在从约100μm至约1mm的范围内。本领域的技术人员将认识到，流体通道(或贮器)的宽度可以具有在该范围内的任何值，例如，约80μm。
111.一般而言，流体通道(或贮器)的深度将是介于约1μm和约1mm之间。在一些情况下，流体通道(或贮器)的深度可以是至少1μm、至少5μm、至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、或至少1mm。在一些情况下，流体通道(或贮器)的深度可以是至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多50μm、至多40μm、至多30μm、至多20μm、至多10μm、至多5μm或至多1μm。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，流体通道(或贮器)的深度可以在从约50μm至约100μm的范围内。本领域的技术人员将认识到，流体通道(或贮器)的深度可以具有在该范围内的任何值，例如，约55μm。
112.盒筒：在一些情况下，所公开的装置或系统可以被配置为彼此联接或者可以是集成单元的一部分，例如，盒筒。盒筒可以包括微流体装置、包括多个分离通道的基底、贮器、试剂、膜、阀、固定器(例如，本文所述的那些，诸如包含膜的高电压电极固定器)固定装置或特征部(例如，螺钉、销(例如，弹簧针)、粘合剂、杠杆、开关、凹槽、形状配合对、钩和圈、闩锁、螺纹、夹子、夹持物、插脚、环、橡皮筋、铆钉、索环、系结、按扣、胶带、真空、密封件)、垫圈、o型环、电极或它们的组合。盒筒可以是整体构建的或者可以是模块化的并且包括可去除的零件。例如，微流体装置可以被配置为可去除地联接到盒筒。类似地，贮器、膜、阀等均可以是可从盒筒去除的。在一个或多个部件可以是可去除的情况下，盒筒可以被配置为使得各个部件中的每个都可以通过使用者在足够的容差下对准就位。例如，盒筒可以包括凹槽和销，使得微流体装置可以通过使该装置一直沿着盒筒滑动到盒筒到达用于对准的销为止来集成。在一些情况下，该装置可以被配置为与盒筒或其一部分齐平定位。在一些情况下，该装置可以定位到盒筒中，使得一个或多个入口、出口等可以被连接(例如，流体地和/或电地)到贮器、电极、膜和/或其它有用的接口单元。在一些情况下，装置和贮器、电极等的接合可以由使用者在没有任何附加测量或调整的情况下执行。例如，贮器可以被配置为接收电极，所述电极咬合到位或经由弹簧针固定，从而建立电连通和/或流体连通。将应理解，盒筒和装置的这些示例性配置并不意味着限制性的，并且定位微流体装置或盒筒的其它部件的许多不同配置可以被实现。在一些情况下，盒筒可以被配置为本文所述的系统的一次
性部件。
113.在优选的实施例中，盒筒可以包括一个或多个贮器，其被配置为容纳所需体积的流体。在一些情况下，贮器会能够容纳至少约200微升(μl)、至少约300μl、至少约400μl、至少约500μl、至少约600μl、至少约700μl、至少约800μl、至少约900μl、至少约1毫升(ml)、至少约1.5ml、至少约2ml、至少约2.5ml、至少约3ml、至少约3.5ml、至少约4ml、至少约4.5ml或至少约5ml的流体。在一些情况下，贮器会能够容纳至多约5ml、至多约4.5ml、至多约4ml、至多约3.5ml、至多约3ml、至多约2.5ml、至多约2ml、至多约1.5ml、至多约1ml、至多约900μl、至多约800μl、至多约700μl、至多约600μl、至多约500μl、至多约400μl、至多约300μl或至多约200μl的体积。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，贮器可以容纳可以在约200μl至约2ml的范围内的流体体积。本领域的技术人员将认识到，贮器流体体积容量可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.8ml。
114.在一些实施例中，可以提供一个或多个套件，所述套件可以包括盒筒、一种或多种试剂以及在一些情况下用于使用该套件的指令。试剂可以作为液体被储存在贮器中。在一些实施例中，试剂可以是干燥的，例如冻干的，并且能够在溶液或缓冲液中被重组。在一些情况下，试剂可以与盒筒分离并且可以被设置在套件中。
115.在一些情况下，贮器可以被可控地联接(例如，电地、流体地)到微流体装置。例如，盒筒可以包括一个或多个阀，其可以用于控制装置中的流量或流速。在一些情况下，盒筒可以包括旋塞阀或剪切阀(例如，滑动阀或旋转剪切阀)，其可以允许用于在一种或多种液体试剂(例如，活动化试剂)的输送期间的受控的流速。在一些情况下，盒筒可以与注射泵集成或接合，所述注射泵可以用于控制液体流入装置中的流速。在一些情况下，可以使用活塞、弹簧加载装置或其它机械方法来控制流速。
116.在一些情况下，盒筒可以被配置为容纳不同类型或型号的装置。例如，盒筒可以被配置为容纳至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同类型或型号的装置。在一些情况下，盒筒可以包括端口或连接部，其可以与芯片的通道接合(例如，与芯片的入口和/或出口接合)。
117.分析物的分离和富集：在一些情况下，所公开的装置或系统可以被配置为执行一个或多个分离或富集步骤，其中混合物中的多个分析物被分离和/或浓缩在各个级分中。例如，在一些情况下，所公开的装置可以被配置为执行第一富集步骤，其中将样本中的分析物混合物分离成和/或富集为包含来自原始样本的分析物分子的子集的分析物级分(例如，分析物峰或分析物带)。在一些情况下，这些分离的分析物级分可以被活动和/或洗脱，并且在一些情况下，可以继而经受另一个下游分离和/或富集步骤。在一些情况下，例如，在最终分离和/或富集步骤后，可以从装置驱排分离的/富集的分析物级分以用于进一步分析。
118.在一些情况下，所公开的装置和系统可以被配置为执行一个、两个、三个、四个或五个或更多个分离和/或富集步骤。在一些情况下，分离或富集步骤中的一个或多个可以包括固相分离技术，例如，反相hplc。在一些情况下，分离或富集步骤中的一个或多个可以包括溶液相分离和/或富集技术，例如，毛细管区带电泳(cze)或等电聚焦(ief)。
119.所公开的装置和系统可以被配置为执行由本领域的技术人员已知的多种分析物分离和/或富集技术中的任一种，其中一个或多个分离或富集步骤在至少第一分离通道中
执行，所述第一分离通道被配置为被整体地或部分地成像，以便可以在执行分离过程时监测分离过程。例如，在一些情况下，成像的分离可以是电泳分离，其包括例如等电聚焦、毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳、电场梯度聚焦、动态场梯度聚焦和类似的，其从分析物混合物产生一个或多个分离的分析物级分。在一些情况下，可以在至少第一分离通道中执行分离和活动化步骤，所述第一分离通道被配置为被整体地或部分地成像，使得可以在执行分离和活动过程时监测分离和活动过程。在任何这些情况下，分离通道的全部或部分成像可以被连续地或间歇地执行，并且可以在分离和/或富集过程之前、期间或之后被执行。
120.在一些情况下，使用微流体装置的形式可以提供用于快速的分离时间和准确的且可再现的分离数据。例如，在微流体装置被配置为执行电泳分离和/或等电聚焦反应的情况下，微流体通道的高表面积与容积之比可以允许人们在没有招致显着焦耳加热的情况下使用高电场强度，由此使得在没有分离分辨率的实质分散和损失的情况下实现非常快速的分离反应。在一些情况下，流体通道几何形状的精确控制提供用于对样本注入体积、电场强度等的精确和可再现的控制，由此能够非常精确地确定化验的一个或多个参数，例如，分离分辨率和/或pi测定。
121.化验的一个或多个参数可以包括分离的特征。例如，一个或多个参数可以从由分离分辨率、峰宽度、峰容量、ph梯度的线性和最小可分辨pi差异组成的组中选出。
122.通常，实现完全分离所需的分离时间将根据所利用的具体分离技术和操作参数(例如，分离通道长度、微流体装置设计、缓冲物组合物、施加的电压等)而变化。在一些情况下，使用所公开的装置和系统实现的分离时间可以在约0.1分钟至约30分钟的范围内。在一些情况下，分离时间可以是至少0.1分钟、至少0.5分钟、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟或至少30分钟。在一些情况下，分离时间可以是至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟、至多5分钟、至多1分钟、至多0.5分钟或至多0.1分钟。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，分离时间可以在约1分钟至约20分钟的范围内。本领域的技术人员将认识到，分离时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约11.2分钟。
123.类似地，使用所公开的装置和系统实现的分离效率和分辨率可以根据所利用的具体分离技术和操作参数(例如，分离通道长度、微流体装置设计、缓冲物组合物、施加的电压等)以及是利用分离的一个维度还是分离的两个维度而变化。在一些情况下，例如，当执行等电聚焦时，使用可切换的电极来触发活动化电解质到分离通道中的电泳引入而可以引起改进的分离分辨率。例如，在一些情况下，使用所公开的方法和装置执行的ief的分离分辨率可以提供用于具有在约0.1至约0.0001个ph单位范围内的pi差异的分析物带的分辨率。在一些情况下，ief分离分辨率可以允许用于具有小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、小于0.001、小于0.0005或小于0.0001个ph单位的pi差异的分析物带的分辨率。
124.因此，在一些情况下，例如，当使用分离通道的全部或一部分的成像来识别等电聚焦反应中的pi标记的位置和确定用于分离的分析物的pi值时，可以确定pi值的准确度会小于
±
0.1个ph单位、小于
±
0.05个ph单位、小于
±
0.01个ph单位、小于
±
0.005个ph单位、小于
±
0.001个ph单位、小于
±
0.0005个ph单位或大于
±
0.0001个ph单位。
125.在一些情况下，使用所公开的装置实现的峰值容量可以在约100至约20000的范围内。在一些情况下，峰值容量可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少10000、至少15000或至少20000。在一些情况下，峰值容量可以是至多20000、至多15000、至多10000、至多5000、至多4000、至多3000、至多2000、至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多400、至多300、至多200或至多100。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，峰值容量可以在约400至约2000的范围内。本领域的技术人员将认识到，峰值容量可以具有在该范围内的任何值，例如，约285。
126.毛细管等电聚焦(cief)：在一些实施例中，分离技术可以包括等电聚焦(ief)，例如，毛细管等电聚焦(cief)。等电聚焦(或“电聚焦”)是一种用于通过其等电点(pi)(即，其中分子具有零净电荷的ph值)的差异来分离分子的技术。cief涉及将两性电解质(两性电解物)溶液添加到包含阳极或阴极的试剂贮器之间的样本通道，以在分离通道(即，将包含电极的凹孔连接的流体通道，例如，毛细管的管腔或微流体装置中的通道)内产生ph梯度，横过所述分离通道施加分离电压。两性电解质可以是溶液相或固定在通道壁的表面上。带负电的分子通过介质中的ph梯度朝向正电极迁移，而带正电的分子朝向负电极移动。在低于其等电点(pi)的ph范围内的蛋白质(或其它分子)将带正电，并且因此将朝向阴极(即，带负电的电极)迁移。蛋白质的总净电荷将随着其通过增大ph的梯度迁移而减少(例如，由于羧基或其它带负电荷的官能团的质子化)，直到蛋白质到达与其pi相对应的ph区域为止，此时它没有净电荷并且因此迁移停止。结果，蛋白质混合物根据其酸性和碱性残基的相对含量而分离，并且变得聚焦成尖锐的固定带，每个蛋白质都位于与其pi相对应的ph梯度中的一点处。该技术能够实现极高的分辨率，将因单个电荷而不同的蛋白质被分级成分离的带。在一些实施例中，等电聚焦可以在已经(例如，用中性和亲水性聚合物涂层)永久地或动态地涂覆的分离通道中执行，以消除电渗流(eof)。合适的涂层的示例包括但不限于氨基改性剂、羟丙基纤维素(hpc)和聚乙烯醇(pva)、(阿尔科生物分离)、线性聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷(pvp)、甲基纤维素、羟乙基纤维素(hec)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、三乙胺、丙胺、吗啉、二乙醇胺、三乙醇胺、二氨基丙烷、乙二胺、壳聚糖、聚乙烯亚胺、尸胺、腐胺、亚精胺、二亚乙基三胺、四亚乙基五胺、纤维素、葡聚糖、聚环氧乙烷(peo)、醋酸纤维素、支链淀粉、乙基吡咯烷甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸二甲酯、二十二烷基二甲基溴化铵、brij35、磺基甜菜碱、1,2-二月桂酰n-磷脂酰胆碱、1,4-二癸基-1,4-重氮二环[2,2,2]辛烷二溴化物、琼脂糖、聚(n羟乙基丙烯酰胺)、pole-323、超支化聚氨基酯、普鲁兰多糖、甘油、吸附涂层、共价涂层、动态涂层等。在一些实施例中，可以(例如，在未涂覆的分离通道中)使用在分离介质中的诸如甲基纤维素、甘油、尿素、甲酰胺、表面活性剂(例如，triton-x100、chaps、洋地黄皂苷)的添加剂执行等电聚焦以显著地通过增大电解质的粘度来减少电渗流、允许更好的蛋白质溶解和限制毛细管内(例如，在毛细管的管腔中)或流体通道内的扩散。
[0127]
如上所述，用于毛细管等电聚焦技术的ph梯度是通过使用两性电解质产生的，即，所述两性电解质含有酸性基团和碱性基团两者并且主要作为在一定ph范围内的两性离子来存在。在分离通道的阳极侧上的电解质溶液的一部分被称为“阳极液”。在分离通道的阴
极侧上的电解质溶液的那部分被称为“阴极液”。多种电解质可以用在所公开的方法和装置中，包括但不限于磷酸、氢氧化钠、氢氧化铵、谷氨酸、赖氨酸、甲酸、二甲胺、三乙胺、乙酸、哌啶、二乙胺和/或其任何组合。电解质可以以任何合适的浓度使用，例如，0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％等。电解质的浓度可以是至少0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。电解质的浓度可以是至多90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％。可以使用一系列浓度的电解质，例如，0.1％至2％。两性电解质可以被选自任何商业或非商业载体两性电解质混合物(例如，servalyt ph 4-9(德国海德堡，赛瓦)、beckman ph 3-10(美国加利福尼亚州，富勒顿贝，克曼仪器公司)、ampholine 3.5-9.5和pharmalyte 3-10(两者均来自法国奥赛通用电气医疗中心)、aeslytes(aes)、fluka两性电解质(美国新泽西州，斯韦德斯伯勒，托马斯科学公司)、biolyte(美国加利福尼亚州，赫拉克勒斯，bio-rad))和类似物。载体两性电解质混合物可以包括含有多重脂肪族氨基和羧酸基团的小分子(约300da至1000da)的混合物，这些基团具有紧密间隔的pi值和良好的缓冲能力。在存在施加的电场的情况下，载体两性电解质分成平滑的线性或非线性ph梯度，其从阳极到阴极逐渐地增加。
[0128]
在所公开的方法和装置中可以使用多种pi标准中的任一种来用于计算用于分离的分析物峰的等电点。例如，可以使用在cief应用中通常使用的pi标记，例如，蛋白质pi标记和合成小分子pi标记。在一些情况下，蛋白质pi标记会是具有普遍接受的pi值的特定蛋白质。在一些情况下，pi标记可以是可例如经由成像检测的。可以使用可商购获得的蛋白质pi标记或合成小分子pi标记的多种或组合，例如，可从先进电泳解决方案有限公司(加拿大安大略省，剑桥)、proteinsimple、由shimura设计的肽库以及slais染料(阿尔科生物分离)获得的小分子pi标记。
[0129]
毛细管区带电泳(cze)：在一些情况下，分离或富集技术可以包括毛细管区带电泳，这是一种用于在施加的电场中分离溶液中的带电分析物的方法。带电分析物分子的净速度受到由分离系统表现的电渗流(eof)μeof和用于各个分析物的电泳淌度μep(其取决于分子的大小、形状和电荷)两者的影响，使得表现不同的大小、形状或电荷的分析物分子表现出不同的迁移速度并且分离成带。与其它毛细管电泳方法相比，cze使用“简单的”缓冲物或背景电解质(用于分离的溶液)。
[0130]
毛细管凝胶电泳(cge)：在一些情况下，分离或富集技术可以包括毛细管凝胶电泳，这是一种用于基于大分子(例如，dna、rna和蛋白质)及其碎片的大小和电荷来分离和分析大分子的方法。该方法包括使用填充凝胶的分离通道，其中凝胶在带电分析物分子在施加的电场中进行电泳运动期间充当抗对流和/或筛分介质。凝胶的功能是抑制通过施加电场引起的热对流，同时也充当阻碍分子通过的筛分介质，由此导致不同大小或电荷的分子具有不同的迁移速度。
[0131]
毛细管等速电泳(citp)：在一些情况下，分离技术可以包括毛细管等速电泳，这是一种用于分离带电分析物的方法，所述方法使用在合适尺寸的毛细管或流体通道内的两种电解质(被称为前导电解质和终止电解质)的不连续系统。前导电解质包含具有最高电泳淌度的离子，而终止电解质包含具有最低电泳淌度的离子。待分离的分析物混合物(即，样本)被夹在这两种电解质之间，并且施加电场促使毛细管或流体通道内的带电分析物分子分隔
到紧密相邻的区带中，以便降低电泳淌度。这些区带在所施加的电场中以恒定的速度运动，使得可以利用诸如电导检测器、光电检测器或成像装置的检测器来记录它们沿分离通道的通过。与毛细管区带电泳不同，在使用毛细管等速电泳执行的单个分析中，同时测定或检测阴离子和阳离子分析物是不可行的。
[0132]
毛细管电动色谱(cec)：在一些情况下，分离技术可以包括毛细管电动色谱，这是一种基于液相色谱和电泳分离方法的组合来分离分析物混合物的方法。cec提供毛细管电泳(ce)的效率以及填充毛细管高效液相色谱(hplc)的选择性和样本容量两者。由于cec中使用的毛细管被填充有hplc填充材料，所以在hplc中可用的广泛种类的分析物选择性在cec中也是可用的。这些填充材料的高表面积使cec毛细管能够容纳相对大量的样本，使随后洗脱的分析物的检测比其在毛细管区带电泳(cze)中进行稍微更简单的任务。
[0133]
胶束电动色谱(mekc)：在一些情况下，分离技术可以包括毛细管电动色谱，这是一种基于表面活性剂胶束(准固定相)和周围水性缓冲溶液(流动相)之间的差异分隔来分离分析物混合物的方法。针对mekc使用的基本设置和检测方法与在cze中使用的那些相同。不同之处在于，缓冲溶液含有浓度高于临界胶束浓度(cmc)的表面活性剂，使得表面活性剂单体与胶束处于平衡状态。通常在开放毛细管或流体通道中使用碱性条件执行mekc，以产生强电渗流。十二烷基硫酸钠(sds)是在mekc应用中常用的表面活性剂的一个示例。sds的硫酸基团的阴离子特性促使表面活性剂和胶束具有与强电渗流的方向相反的电泳淌度。结果，表面活性剂单体和胶束的迁移非常缓慢，尽管它们的净运动仍然是在电渗流的方向上，即，朝向阴极。在mekc分离期间，分析物本身分布在胶束的疏水性内部和亲水性缓冲溶液之间。不溶于胶束内部的亲水性分析物以电渗流速u
oo
迁移，并且将在缓冲液的保留时间tm处检测到。完全溶解在胶束内的疏水性分析物以胶束速度uc迁移，并且在最终洗脱时间tc处洗脱。
[0134]
流动平衡毛细管电泳(fcce)：在一些情况下，分离技术可以包括流动平衡毛细管电泳，这是一种用于提高毛细管电泳的效率和分辨能力的方法，所述方法利用压力诱导的逆流来主动地延迟、中止或逆转通过毛细管的分析物的电动迁移。通过延迟、中止或来回移动分析物横过检测窗口，感兴趣的分析物被高效地限制在分离通道中长达比在正常分离条件下明显更久的时间段，从而提高分离的效率和分辨能力两者。
[0135]
色谱法：在一些情况下，分离技术可以包括色谱技术，其中样本流体(流动相)中的分析物混合物穿过柱或通道填充材料(固定相)，所述柱或通道填充材料(固定相)有差别地保留混合物的各种成分，从而使它们以不同的速度行进和分离。在一些情况下，会需要后续的洗脱或活动化步骤来置换对固定相具有高结合亲和力的分析物。可以结合到所公开的方法中的色谱技术的示例包括但不限于离子交换色谱、尺寸排阻色谱和反相色谱。
[0136]
分离的分析物类的活动化：在一些情况下，本文提供的是被配置为执行例如色谱分离技术(诸如反相色谱)的装置和系统。由所述装置或系统实施的方法还可以包括洗脱被保留在多个分离通道中的每个中的固定相上的分析物类(例如，通过同时地或独立地改变流过多个分离通道中的每个的缓冲液)，这可以被称为“活动化”步骤或反应。在一些情况下，由所述装置或系统实施的方法还可以包括同时地或独立地向多个分离通道中的每个施加压力，或同时地或独立地将电解质引入到多个分离通道中的每个中以破坏用于等电聚焦的ph梯度，并且从而触发分离的分析物峰迁移出分离通道，这也可以被称为“活动化”步骤。
在一些情况下，用于驱动分离反应的力(例如，用于反相色谱的压力，或用于电动分离或等电聚焦反应的电场)可以在活动化步骤期间被切断。在一些情况下，用于驱动分离反应的力会在活动化步骤期间被留下。在所公开的方法的一些实例(例如，包括等电聚焦步骤的那些)中，分离的分析物带可以被活动(例如，使用流体动力压力和/或化学活动技术)，使得分离的分析物带朝向与另一个流体通道连接的多个分离通道中的每个的端部(其可以是例如出口、废物贮器或第二分离通道)迁移。在一些情况下，例如，在采用毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、等速电泳、毛细管电动色谱、胶束电动色谱、流动平衡毛细管电泳或通过差速分离分析物混合物的组分的任何其它分离技术的那些实例中，分离步骤本身可以被视为活动化步骤。
[0137]
在一些情况下，分析物带的活动化可以通过同时地或独立地向多个分离通道中的每个的端部施加流体动力压力来实现。在一些情况下，分析物带的活动化可以通过将装置取向成使得多个分离通道处于竖直位置中来实现，使得可以采用重力。在一些情况下，分析物带的活动化可以使用eof辅助的活动化来实现。在一些情况下，分析物带的活动化可以使用化学活动化例如通过同时地或独立地将活动化电解质引入到多个分离通道中的每个中来实现，所述活动化电解质在用于等电聚焦的ph梯度中改变局部ph。在一些情况下，可以采用这些活动化技术的任何组合。
[0138]
在一个优选的实例中，用于等电聚焦的分析物带的活动化步骤包括化学活动化。与基于压力的活动化相比，化学活动化具有以下优势，即，通过克服通过使用压力引起的流体动力抛物线流动分布而表现出最小的谱带增宽。化学活动化可以通过将电解质(即，“活动化电解质”)引入到分离通道中以改变分离的分析物带(或两性离子缓冲液组分)上的局部ph值和/或净电荷来实现，使得分析物带(或两性离子缓冲液组分和相关联的水合壳)在所施加的电场中迁移。在一些情况下，用于使分离的分析物带活动的所施加的电场的极性可以使得分析物朝向与分离通道的出口或远侧端部电连通的阳极迁移(阳极活动化)。在一些情况下，用于使分离的分析物带活动的所施加的电场的极性可以使得分析物朝向与分离通道的出口或远侧端部电连通的阴极迁移(阴极活动化)。活动化电解质包含阴离子或阳离子，所述阴离子或阳离子与羟基(阴极活动化)或水合氢离子(阳极活动化)竞争以用于以引入到分离通道或毛细管中。可以用作用于阳极活动化的阴极液的碱的示例包括但不限于氢氧化钠、氢氧化铵(“氨”)、二乙胺、二甲胺、哌啶等。可以用作阴极活动化中的阳极液的酸的示例包括但不限于磷酸、乙酸、甲酸和碳酸等。在一些情况下，活动化可以通过向阳极液或阴极液中添加盐(例如，氯化钠)来引发。在一些情况下，阳极可以保持接地，并且负电压被施加到阴极。在一些情况下，阴极可以保持接地，并且正电压被施加到阳极。在一些情况下，可以将非零负电压施加到阴极，并且可以将非零正电压施加到阳极。在一些情况下，可以将非零正电压施加到阳极和阴极两者。在一些情况下，可以将非零负电压施加到阳极和阴极两者。
[0139]
在一些情况下，分离的分析物带的活动化可以在用户指定的时间点处发起，所述用户指定的时间点为在开启状态和关闭状态之间触发可切换电极(例如，与多个分离通道中的每个的远侧端部电连通的阴极和与多个活动化通道(例如，在每个分离通道的出口或远侧端部附近与分离通道相交的流体通道)中的每个的近侧端部电连通的阴极)以控制将活动化缓冲液或电解质电泳引入到分离通道中。
[0140]
在一些情况下，用于在针对多个分离通道中的每个的开启状态和关闭状态之间独立地触发一个、两个或三个或更多个可切换电极的转变的用户指定的时间对于任何活动化计划而言可以在从约30秒至约30分钟的范围内。在一些情况下，用户指定的时间可以是至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟或至少30分钟。在一些情况下，用户指定的时间可以是至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟、至多1分钟或至多30秒。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，用户指定的时间可以在从约2分钟至约25分钟的范围内。本领域的技术人员将认识到，用户指定的时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约8.5分钟。
[0141]
在一些情况下，用于在本文公开的任何活动化方案中实现活动化(或在执行此类分离技术的那些情况下执行电动分离或等电聚焦反应)的电场可以在从约0v/cm至约1000v/cm的范围内。在一些情况下，电场强度可以是至少0v/cm、至少20v/cm、至少40v/cm、至少60v/cm、至少80v/cm、至少100v/cm、至少150v/cm、至少200v/cm、至少250v/cm、至少300v/cm、至少350v/cm、至少400v/cm、至少450v/cm、至少500v/cm、至少600v/cm、至少700v/cm、至少800v/cm、至少900v/cm或至少1000v/cm。在一些情况下，电场强度可以是至多1000v/cm、至多900v/cm、至多800v/cm、至多700v/cm、至多600v/cm、至多500v/cm、至多450v/cm、至多400v/cm、至多350v/cm、至多300v/cm、至多250v/cm、至多200v/cm、至多150v/cm、至多100v/cm、至多80v/cm、至多60v/cm、至多40v/cm、至多20v/cm或至多0v/cm。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，电场强度时间可以在从约40v/cm至约650v/cm的范围内。本领域的技术人员将认识到，电场强度可以具有在该范围内的任何值，例如，约575v/cm。
[0142]
在一些情况下，分离的分析物带的活动化可以基于从独立地监测用于多个分离通道中的每个的电流(或电导率)得到的数据发起，其中例如在等电聚焦的情况下，通过分离通道的电流可以达到最小值。在一些情况下，最小电流值的检测或在指定时间段内保持恒定或低于指定阈值的电流值的检测可以用于判定等电聚焦反应是否已经完成，并且从而可以用于触发化学活动化步骤的发起。
[0143]
在一些情况下，最小电流值或阈值电流值可以在从约0μa至约100μa的范围内。在一些情况下，最小电流值或阈值电流值可以是至少0μa、至少1μa、至少2μa、至少3μa、至少4μa、至少5μa、至少10μa、至少20μa、至少30μa、至少40μa、至少50μa、至少60μa、至少70μa、至少80μa、至少90μa或至少100μa。在一些情况下，最小电流值或阈值电流值可以是至多100μa、至多90μa、至多80μa、至多70μa、至多60μa、至多50μa、至多40μa、至多30μa、至多20μa、至多10μa、至多5μa、至多4μa、至多3μa、至多2μa、至多1μa或至多0μa。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，最小电流值或阈值电流值可以在从约10μa至约90μa的范围内。本领域的技术人员将认识到，最小电流值或阈值电流值可以具有在该范围内的任何值，例如，约16μa。
[0144]
在一些情况下，指定的时间段可以是至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少20秒、至少25秒、至少30秒、至少35秒、至少40秒、至少45秒、至少50秒、至少55秒或至少60秒。在一些情况下，指定的时间段可以是至多约60秒、至多约55秒、至多约50秒、至多约45秒、至多约40
秒、至多约35秒、至多约30秒、至多约25秒、至多约20秒、至多约15秒、至多约10秒或至多约5秒。本文描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，指定的时间段可以在从约5秒至约30秒的范围内。本领域的技术人员将认识到，指定的时间段可以具有在该范围内的任何值，例如，约32秒。
[0145]
在一些情况下，分离的分析物带的活动化可以基于在执行分离反应时从多个分离通道的图像(例如，通过执行自动图像处理)得到的数据来发起。图像衍生数据可以用于监测一个或多个分析物峰的存在与否、一个或多个分析物峰的位置、一个或多个分析物峰的宽度、一个或多个分析物峰的速度、分离分辨率、一个或多个分析物峰的存在、位置、宽度或速度的变化率或其缺乏或其任何组合，并且可以用于判定分离反应是否完成和/或触发给定分离通道中的活动化步骤的发起。在一些情况下，分离步骤的完成可以通过监测分离性能参数(例如，峰位置或峰宽度)在一段时间内(例如，在10秒至60秒的时间段内)的变化率来确定。
[0146]
在所公开的方法的一个优选的方面中，化学活动化步骤可以在微流体装置内发起，所述微流体装置被设计为通过改变装置内的电场以将活动化电解质电泳到分离通道中来将cief与esi-ms集成。在一些情况下，可以基于从分离通道的全部或一部分的图像获得的数据触发活动化步骤的发起。在一些情况下，可以通过连接或断开与一个或多个电源附接的一个或多个电极来实现电场的变化，其中一个或多个电极被定位在装置上的试剂凹孔中或与装置的流体通道集成。在一些情况下，一个或多个电极的连接或断开可以使用由计算机实施的方法和可编程开关来控制，使得活动化步骤的定时和持续时间可以与分离步骤相协调。在一些情况下，改变装置内的电场可以用于使活动化缓冲液以电泳或电渗的方式流入包含固定相的分离通道中，使得保留的分析物从固定相释放。
[0147]
在一些情况下，用于每个分离通道的三个或更多个电极可以被连接到或集成到装置中。例如，第一电极可以被电联接到分离通道的近侧端部。类似地，第二电极继而可以被联接到分离通道的远侧端部，并且第三电极可以与活动化通道联接，所述活动化通道例如在分离通道的远侧端部处与分离通道相交并且连接至或包括容纳有活动化缓冲液的贮器。在如通过基于图像的方法所确定的分离步骤完成时，第二电极或第三电极与其相应的通道的电联接可以是可在“开”状态和“关”状态之间切换的。在一个这样的示例中，形成分离电路的阳极或阴极的第二电极可以切换到“关”模式，并且在分离期间会关闭的第三电极可以切换到“开”模式，以发起将活动化缓冲液引入到通道(例如，经由电泳)中。在一些情况下，“开”状态和“关”状态可以分别包括在电极和流体通道之间的电联接的完全连接或断开。在一些情况下，“开”状态和“关”状态可以包括将通过指定电极的电流分别夹持到非零安或零微安。
[0148]
在一些情况下，活动化步骤的触发或发起可以包括针对如上所述的一个或多个图像衍生分离参数检测到没有变化或小于指定阈值的变化。例如，在一些情况下，一个或多个图像衍生参数(例如，峰位置、峰宽度、峰速度等)中的小于20％、15％、10％或5％的变化可以用于触发活动化步骤。
[0149]
在一些情况下，活动化步骤的触发或发起可以包括针对如上所述的一个或多个图像衍生分离参数检测到没有变化或小于指定阈值的变化率。例如，在一些情况下，一个或多个图像衍生参数(例如，峰值位置、峰宽度、峰速度等)在至少10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、
35秒、40秒、45秒、50秒、55秒或60秒的时间段内的小于20％、15％、10％或5％(或这些百分比变化和时间段的任何组合)的变化可以用于触发活动化步骤。
[0150]
在一些情况下，可以在活动化步骤期间使用校准物来关联和/或校准来自质谱仪的信息。在一些情况下，校准物可以包括具有已知质量的肽、多肽、蛋白质或其它分子(天然的或合成的)。在一些情况下，校准物将与动员剂溶液混合。校准物可以用于校准质谱仪。在一些情况下，校准物可以用于将来自质谱仪的信息关联到活动化过程或分离过程。例如，可以在分离(例如，等电聚焦)或活动化期间监测校准物。
[0151]
改变高和低分离/活动化电压以保持esi尖端电压恒定：在一些实施例中，质谱仪上的esi离子源将具有能够在质谱仪上设置负电压的可调电源。在一些实施例中，质谱仪上的esi离子源将具有能够在质谱仪上设置正电压的可调电源。在一些实施例中，质谱仪上的esi离子源将保持接地。在一些实施例中，毛细管或微流体装置上的esi尖端将保持接地或接近接地，以在esi尖端和质谱仪上的带电esi离子源之间产生电场。在一些实施例中，毛细管或微流体装置上的esi尖端将保持在正电压或负电压下以在esi尖端与质谱仪上的接地的esi离子源之间产生电场。
[0152]
图36提供计算机控制的反馈回路的示例性流程图，以在活动化期间在将esi尖端电压保持为0v的同时维持阳极和阴极之间的恒定电压降为3000v。在一些实施例中，当质谱仪esi离子源被设置为相对于地的正电压或负电压(例如，-3500v)时，可以实现该反馈回路。在该示例中，在图1b中，通过初始将阳极液端口108设置为+3000v并且将动员剂端口104设置为0v，将阳极液端口108和动员剂端口104之间的δv保持为3000v。在一些实施例中，可以通过将阳极液端口108设置为不同的值来设置不同的δv。在一些实施例中，可以使用阳极活动化，并且端口108将是阴极液端口，其被设置为例如-3000v。在图36中概述的示例中，在活动化期间，分离通道112中的电阻由于分离中的分析物和两性电解质重新获得电荷而下降。这导致横过通道112的电压降下降，从而引起esi尖端116处的电压增大，根据等式1：
[0153]v116
＝(δv
108-104
)*(r
105
)/(r
109
+r
112
+r
105
)
[0154]
然而，通过测量或计算esi尖端电压116，可以调整阳极液端口108和动员剂端口104处的电压设置。通过从阳极液端口108和动员剂端口104设置两者中减去esi尖端电压116，δv
110-104
保持为3000v，所以活动化不受影响，但是esi尖端116电压被设置为0，根据等式2：
[0155]v116
＝(δv
108-104
)*(r
105
)/(r
109
+r
112
+r
105
)+v
104
[0156]
该反馈回路继续运行，直到活动化完成为止，将esi尖端116电压以规则频率(例如，奈奎斯特速率或约0.2hz)调整为0。在一些情况下，esi尖端116处的电压可以以至少0.01hz、0.1hz、0.2hz、0.3hz、0.4hz、0.5hz、0.6hz、0.7hz、0.8hz、0.9hz、1hz、10hz、100hz、1000hz的速率调整为0。维持esi尖端116处的恒定的稳定电压对于在活动化过程期间维持稳定的电喷雾可以是至关重要的。
[0157]
在一些情况下，反馈回路操作以将esi尖端处的电压维持在预设值的指定百分比内。例如，在一些情况下，反馈回路操作以将esi尖端处的电压维持在预设值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％内。
[0158]
在一些实施例中，质谱仪esi离子源保持接地，并且esi尖端116将需要保持在恒定的正电压或负电压下，以便在esi尖端116和质谱仪之间产生电场。在一些实施例中，esi尖
端电压(例如，预设值)可以是约+5000v、约+4000v、约+3500v、约+3000v、约+2500v、约+2000v、约+1500v、约+1000v、约+500v或约-5000v、约-4000v、约-3500v、约-3000v、约-2500v、约-2000v、约-1500v、约-1000v或约-500v。图37提供计算机控制的反馈回路的示例流程图，以在活动化期间在将esi尖端电压电位保持在3000v的同时维持阳极和阴极之间的恒定电压降为3000v。该计算机控制的反馈回路的操作与图36中的相同。除了阳极液端口108和动员剂端口104处的电压偏移了+3000v之外，这将esi尖端116处的电压偏移到+3000v，仍然遵循等式2。在一些实施例中，可以使用模拟电路来实现电场强度的控制。在一些实施例中，可以通过使用一个、两个、三个或四个或更多个独立的高电压电源来控制在与基于毛细管或基于微流体装置的分离系统接触的一个或多个电极处的电压。在一些情况下，可以例如通过使用单个多路复用高电压电源来控制在与基于毛细管或基于微流体装置的分离系统接触的一个或多个电极处的电压。
[0159]
在一些情况下，反馈回路操作以将分离通道内的电场强度或在阳极和阴极之间的电压降维持在预设值的指定百分比内。例如，在一些情况下，反馈回路操作以将分离通道内的电场强度或在阳极和阴极之间的电压降维持在预设值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％内。在一些情况下，反馈回路操作以将esi尖端电压维持在预设值的1000v、500v、100v、75v、50v、25v、10v、5v或1v内。
[0160]
在一些实施例中，诸如锁定放大器、函数发生器、振荡器的交流(ac)信号发生器或其它ac信号发生器可以被电联接到一对电极。在一些实施例中，ac信号发生器可以是sr8-30(斯坦福研究系统)锁定放大器。在一些实施例中，多个ac信号发生器可以被电联接到多对电极。在一些实施例中，ac信号发生器可以被配置为将ac电压叠加在设置在两个电极之间的dc电压上。在一些实施例中，可以测量由ac信号发生器产生的ac电流。在一些实施例中，由ac信号发生器产生的ac电流可以用于计算微流体通道中的电阻。在一些实施例中，微流体通道的电阻可以随时间变化。在一些实施例中，微流体通道的电阻可以由于等电聚焦而随时间变化。在一些实施例中，微流体通道的电阻可以由于化学活动化而随时间变化。在一些实施例中，由于将新试剂引入到在一对电极之间的通道网络中，微流体通道的电阻可以随时间变化。在一些实施例中，ac信号发生器可以被连接到与分离通道的远侧端部电连通的电极和与同一分离通道的近侧端部电连通的电极。在一些实施例中，可以测量微流体通道中的电阻变化。在一些实施例中，在微流体通道中测量的电阻变化可以用于维持流体网络内的恒定电压电位。在一些实施例中，所产生的ac信号的频率可以是至少0.05hz、至少0.1hz、至少0.5hz、至少1hz、至少5hz、至少10hz、至少50hz、至少100hz、至少500hz、至少1000hz、至少5khz、至少10khz、至少50khz或至少100khz。在一些实施例中，锁定放大器ac电压的频率可以是至多0.05hz、至多0.1hz、至多0.5hz、至多1hz、至多5hz、至多10hz、至多50hz、至多100hz、至多500hz、至多1khz、至多5khz、至多10khz、至多50khz或至多100khz。
[0161]
在一些实施例中，所产生的ac信号的电压可以是至少0.1v、至少0.5v、至少1v、至少5v、至少10v、至少20v、至少50v、至少100v、至少500v、至少1000v、至少5kv或至少10kv。在一些实施例中，锁定放大器信号的电压可以是至多0.1v、至多0.5v、至多1v、至多5v、至多10v、至多50v、至多100v、至多500v、至多1000v、至多5kv或至多10kv。
[0162]
分离通道的成像：在一些情况下，所公开的装置和系统可以被配置为对至少一个分离通道的全部或一部分执行成像，以在执行分离和/或活动化反应的同时监测该分离和/
或活动化反应。在一些情况下，所公开的装置和系统可以被配置为对多个分离通道的全部或一部分执行成像，以在执行多个分离和/或活动化反应的同时监测多个分离和/或活动化反应。在一些情况下，可以使用本领域的技术人员已知的多种成像技术中的任一种对分离和/或活动化反应成像。示例包括但不限于紫外(uv)光吸收、可见光吸收、荧光(例如，天然荧光或由用荧光团标识的一个或多个分析物引起的荧光)、傅里叶变换红外光谱、傅里叶变换近红外光谱、拉曼光谱、光学光谱和类似物。在一些情况下，多个分离(或富集)通道可以是多个毛细管的管腔。在一些情况下，多个分离(或富集)通道可以是微流体装置内的多个流体通道。在一些情况下，分离(或富集)通道、将分离通道的端部和下游分析仪器或电喷雾孔或尖端连接的接头或连接通道、电喷雾孔或尖端本身或其任何组合中的一部分或全部可以被成像。在一些情况下，分离(或富集)通道可以是毛细管的管腔。在一些情况下，分离(或富集)通道可以是微流体装置内的流体通道。
[0163]
用于对分离的分析物带成像和检测分离的分析物带的一个或多个波长范围将典型地取决于成像技术的选择和制造装置或其部分的一种或多种材料。例如，在uv光吸光度用于对分离通道的全部或一部分或微流体装置的其它部分成像的情况下，在约220nm(由于肽键的天然吸光度)和/或约280nm(由于芳香族氨基酸残基的天然吸光度)下的检测可以允许人们在分离和/或活动化期间观察蛋白质带，前提是该装置的至少一部分(例如，分离通道或其一部分)对在这些波长下的光是透明的。在一些情况下，待分离的分析物可以在分离之前用例如荧光团、生色团、化学发光标签或其它合适的标志标识，使得它们可以使用荧光成像、uv吸光度成像或其它合适的成像技术成像。在一些情况下，例如，其中分析物包括由商业制造过程产生的蛋白质，蛋白质可以被基因改造以并入绿色荧光蛋白(gfp)结构域或其变体，使得它们可以使用荧光被成像。在一些情况下，可以使用一种方法来执行对蛋白质或其它分析物分子的标识，以确保标签本身不干扰或不扰乱由所选分离技术所基于的分析物特性。
[0164]
在一些情况下，成像(或源自其的数据)可以用于触发例如活动化步骤或分离的分析物级分或其部分从第一多个分离通道到另一多个分离通道或从第一多个分离通道到与第一多个分离通道的出口端部流体连通的多个通道的其它转移。例如，在一些情况下，所公开的方法可以包括将分析物混合物注入微流体装置中，所述微流体装置包含第一多个分离通道和第二多个分离通道。第一多个分离通道可以包含介质，所述介质被配置为结合来自样本分析物混合物的分析物。因此，当样本分析物混合物被加载或注入装置例如微流体装置中时，每个样本分析物混合物中的分析物的至少一级分可以被结合到基质和/或被阻碍流过第一多个分离通道。例如，将分析物混合物注入微流体装置中可以实现第一多个分离通道中的色谱分离。然后，可以将洗脱液注入微流体装置中，使得分析物(如果存在的话)的至少一级分从每个分离通道中的介质活动。在一些情况下，可以在分析物被活动化的同时对第一多个分离通道成像。在一些情况下，第一多个分离反应的成像可以包括全柱(例如，全通道)成像和/或对分离通道的一部分成像。在一些情况下，当成像检测到分析物级分被布置在第一多个分离通道和第二多个分离通道的相交部处时，可以将电场施加到第二多个分离通道，使得分析物级分被电动地注入到第二多个分离通道中。例如，在一些情况下，第一多个分离通道和第二多个分离通道可以形成一系列t形接头。在一些情况下，成像可以用于检测分析物级分(例如，感兴趣的级分)何时位于该一系列t形接头中的一个或多个处。施
加电场可以将感兴趣的分析物级分(以及任选地，并非其它不位于该一系列t形接头处的分析物级分)电动地注入第二多个分离通道中以用于第二分离阶段。在一些情况下，依据是否在t形接头中的一个或多个处检测到感兴趣的分析物级分，电场可以被独立地施加到第二多个分离通道中的一个或多个。
[0165]
在一些情况下，可以在活动化期间执行成像以监测活动化反应。在一些情况下，用于监测分离反应的成像系统也可以用于监测活动化反应。在一些情况下，可以仅对通道或多个通道的一部分成像以监测活动化反应。在一些情况下，可以对整个通道或多个通道成像，并且仅成像的通道或多个通道的一部分可以用于监测活动化反应。例如，可以以给定的采样率对通道成像，并且对于所生成的每个图像而言，与一个或多个通道的远侧端部相对应的图像的部分可以用于生成淌度色谱图。淌度色谱图可以提供关于例如作为时间函数的某个像素宽度(例如，8个像素)的平均吸光度的信息。在一些情况下，用于生成淌度色谱图的图像的像素宽度(例如，其与通道的远侧端部相对应)可以包括至少1个像素、至少2个像素、至少3个像素、至少4个像素、至少5个像素、至少6个像素、至少7个像素、至少8个像素、至少9个像素、至少10个像素、至少15个像素、至少20个像素、至少25个像素、至少30个像素，至少35个像素、至少40个像素、至少50个像素、至少60个像素、至少70个像素、至少80个像素、至少90个像素、至少100个像素。
[0166]
淌度色谱图可以用于确定活动化反应的参数。例如，淌度色谱图可以用于校准质谱仪，以确定一个或多个分析物的飞行时间信息、峰宽度、峰速度、峰活动、峰位置等。在一些情况下，淌度色谱图可以实时地生成。在一些情况下，淌度色谱图可以以采样率(例如，奈奎斯特采样率，1hz-2hz，或与质谱仪的采样率相匹配的频率)生成。在一些情况下，色谱图可以用于产生关于作为时间函数的通道片段的吸光度的信息。
[0167]
动态光散射：在一些情况下，本公开的系统和方法包括一种或多种包括动态光散射(dls)的检测方法。在一些情况下，dls可以用于提供分析物的信息，例如，确定在至少一个分离通道中的分离的分析物的尺寸分布曲线、分析物的聚集、分析物的流体动力学半径等。可以在分析物分离之前、期间或之后执行dls。dls可以与本文描述的一种或多种方法协同使用，例如，用于样本分离、活动化和/或分析物尺寸分布曲线的交错检测。例如，在本文描述的一个或多个过程(例如，分离、活动化、喷射)期间，除了对一个或多个通道成像之外，还可以使用dls。
[0168]
系统和系统部件：在一些情况下，本公开的系统可以包括一个或多个所公开的装置(例如，微流体装置)、一个、两个、三个、四个或更多个高电压电源(或允许独立地控制两个或更多个通道的单个多路复用高电压电源)、自动取样器和/或流体装卸系统、流体流量控制器、成像模块、动态光散射模块、微板装卸机器人模块、废物管理模块(例如，去除或防止液滴积聚在电喷雾尖端的外部上)、电极接口单元、处理器或计算机或它们的任何组合。
[0169]
高电压电源：在一些情况下，所公开的系统的两个或更多个高电压电源(或允许独立地控制两个或更多个通道的单个多路复用高电压电源)被配置为提供对多个分离通道的同时且独立的电气控制，例如，同时地且独立地向多个分离通道或辅助流体通道(例如，用于在等电聚焦反应完成后将化学动员剂输送到分离通道的活动化通道)中的每个施加指定的电压或电流。在一些情况下，所公开的系统的两个或更多个高电压电源(或允许独立地控制两个或更多个通道的单个多路复用高电压电源)被配置为监测和/或记录流过多个分离
通道中的每个分离通道的电流(不仅仅是总电流)。如本文所描述的，分离通道可以包含不同的样本或相同的样本(例如，样本的等分试样)。在一些情况下，流过每个分离通道的电流可以用于例如确定等电聚焦反应何时完成和/或检测故障(例如，在分离通道中引入或形成气泡)。
[0170]
在一些情况下，该系统可以包括两个独立的高电压电源、三个独立的高电压电源、四个独立的高电压电源、五个独立的高电压电源、六个独立的高电压电源、七个独立的高电压电源、八个独立的高电压电源、九个独立的高电压电源、十个独立的高电压电源、十一个独立的高电压电源、十二个独立的高电压电源、十三个独立的高电压电源、十四个独立的高电压电源、十五个独立的高电压电源、十六个独立的高电压电源、十七个独立的高电压电源、十八个独立的高电压电源、十九个独立的高电压电源或二十个独立的高电压电源。在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被集成或封装为单个多路复用高电压电源，所述单个多路复用高电压电源为多个分离通道或辅助流体通道(例如，用于在等电聚焦反应完成后将化学动员剂输送到分离通道的活动化通道)中的每个提供电压和/或电流的同时且独立的控制。
[0171]
在一些情况下，所公开的系统的两个或更多个高电压电源是可编程的，例如，它们可以包括内部微处理器和/或存储器，所述内部微处理器和/或存储器允许将施加到多个分离通道或辅助通道中的每个的电压和/或电流由下载到高电压电源的软件控制。在一些情况下，所公开的系统的两个或更多个高电压电源可以被配置为用于由外部处理器或计算机控制。
[0172]
在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被编程或以其它方式被配置为在恒定电压模式下运行，例如，其中横过多个分离通道和/或辅助通道中的每个所施加的电压在分离反应的持续时间内或在指定的时间段内保持固定。在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被编程或以其它方式被配置为使横过多个分离通道和/或辅助通道中的每个所施加的电压在一个或多个指定的时间下从第一指定电压逐步变化到至少第二指定电压。在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被编程或以其它方式被配置为在分离反应的进程上使电压进行两个、三个、四个、五个或多于五个的逐步变化。
[0173]
在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被编程或以其它方式被配置为在恒定功率模式下运行，例如，以便当在分离反应期间由于电导率变化而导致电流下降时升高施加到给定的分离通道的电压，从而允许人们增大电压以在未引起过度焦耳加热的情况下使分离时间最小化。
[0174]
如上所述，在一些情况下，用于执行电泳分离或等电聚焦反应(或其它电动注入或分离过程)的电场可以在从约0v/cm至约1000v/cm的范围内。因此，在一些情况下，所公开的系统的两个或更多个高电压电源可以被配置为提供在从约0伏至约5000伏的范围内的可调电压(例如，对于5cm长的分离通道而言)。在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被配置为提供至少0伏、至少5伏、至少10伏、至少50伏、至少100伏、至少500伏、至少1000伏或至少5000伏的可调电压。在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被配置为提供至多5000伏、至多1000伏、至多500伏、至多100伏、至多50伏、至多10伏或至多5伏的可调电压。在本段落中描述的下限值和上限值中的任一者可以被组合以形成包含在本公开内的范围，例如，在一些情况下，两个或更多个高电压电源可以被配置为提供在从约100伏至约1000伏的
范围内的可调电压。本领域的技术人员将认识到，两个或更多个高电压电源可以被配置为提供在该范围内的任何值的可调电压，例如，约1250伏。
[0175]
电极接口单元/固定器：在一些情况下，所公开的系统可以包括一个或多个固定器，所述一个或多个固定器可以包括电极接口单元(例如，高电压电极接口单元或固定器)，其被配置为将一个或多个电极接口与所述系统的一个或多个部件(例如，微流体装置的一个或多个入口)接合。如本文所描述的，所公开的微流体装置可以包括两个或更多个集成电极，其被配置为沿着与分离通道相交的分离通道或互连通道施加电压梯度。电极可以与多个入口端口、出口端口、样本和/或试剂引入通道、互连通道、样本和/或试剂废物通道、贮器(例如，样本贮器、试剂贮器或废物贮器)、微型泵、微型阀、通风口、捕集器、过滤器、膜和类似物或它们的任何组合集成，或者电极可以被配置为与多个入口端口、出口端口、样本和/或试剂引入通道、互连通道、样本和/或试剂废物通道、贮器(例如，样本贮器、试剂贮器或废物贮器)、微型泵、微型阀、通风口、捕集器、过滤器、膜和类似物或它们的任何组合接合。在一些情况下，固定器可以包括一个或多个膜，其允许用于电极和微流体装置的电和/或流体连通。在一些情况下，膜可以与一个或多个贮器(例如，阳极液贮器或阴极液贮器)和/或微流体装置流体和/或电连通。在一些情况下，膜可以被联接到微流体装置。在一些情况下，当装置与一个或多个贮器建立流体连通时，膜可以用于防止气泡引入微流体装置(例如，通道或入口)。可替代地或另外地，膜可以用于防止气泡(例如，通过在电极处电解所形成的气泡)进一步引入到微流体装置中。在一些情况下，固定器内的电极贮器(例如，与电极进行电接触的任何贮器)的容积可以足够大以最小化或消除容纳在其中的缓冲液由于电极处的电解所导致的ph变化。在一些情况下，固定器的几何形状可以被配置为定位膜以与微流体装置建立流体和/或电连通。膜和/或电极贮器可以被定位成与微流体装置相邻(例如，被定位在微流体装置上、被定位在微流体装置旁边、被定位成联接到微流体装置、被定位成与微流体装置正交，等等)。在一些情况下，膜可以被联接到微流体装置(例如，经由装配机构)。在一些情况下，固定器的几何形状可以被用于防止膜的弯曲、折叠或非平面运动或配置，例如，以防止在膜与装置接合时形成气泡或施加流体动力压力。例如，固定器可以包括插入物，例如，u形结构，其中膜可以被放置在u形结构的底部(例如，平坦部分)处。在这样的示例中，u形结构可以被联接到贮器(例如，可以与电极接合的电极贮器)并且允许与膜和微流体装置流体连通。u形结构的臂可以包括入口流体路径和出口流体路径。在另一个示例中，固定器可以包括插入物，例如，y形结构，其中膜可以被放置在y形结构的顶部处。在这样的示例中，y形结构可以包括贮器(例如，电极贮器)并且允许与膜和微流体装置流体连通。
[0176]
在一些情况下，膜经由出口流体路径和端口(例如，u形结构的平坦部分)来与装置接合。端口的至少一个维度可以采取多种几何形状并且被配置为防止膜的弯曲、折叠等。例如，端口可以是圆形的并且可以具有至多约5mm、至多约4mm、至多约3mm、至多约2mm、至多约1mm或至多约500μm的直径。膜可以覆盖端口的全部或一部分，并且可以包括任何有用的尺寸；例如，膜可以具有约0.001平方毫米(mm2)、约0.005mm2、约0.01mm2、约0.05mm2、约0.1mm2、约0.5mm2、约1mm2、约5mm2、约10mm2、约50mm2、约100mm2或约500mm2的横截面积。膜可以包括至少0.001(mm2)、至少0.005mm2、至少0.01mm2、至少0.05mm2、至少0.1mm2、至少0.5mm2、至少1mm2、至少5mm2、至少10mm2、至少50mm2、至少100mm2或至少500mm2的横截面积。在一些情况下，膜可以包括至多500mm2、至多100mm2、至多50mm2、至多10mm2、至多5mm2、至多1mm2、至多
0.5mm2、至多0.1mm2、至多0.05mm2、至多0.01mm2、至多0.005mm2或至多0.001mm2的横截面积。膜可以包括在面积范围内的横截面积，例如，在约0.001mm2和约100mm2之间。
[0177]
在一些情况下，固定器可以包括：电极贮器；入口流体通道，其包括第一端部和第二端部；出口流体通道，其包括与入口流体通道的第二端部流体联接的第一端部和与分离通道(例如，在微流体装置中)流体联接的第二端部，所述入口流体通道和所述出口流体通道在限定或平行于电极贮器的表面的平面处彼此相交并且彼此流体地联接。膜可以在供入口流体通道和出口流体通道相交的平面处或附近被布置在电极贮器内，使得膜覆盖开口的全部或基本全部，所述开口包括入口流体通道和出口流体通道的相交部(参见例如图13a至图13f)。在固定器包括插入物的情况下，所述插入物包括入口流体路径和出口流体路径，膜和/或入口流体路径和出口流体路径可以被配置为有助于当电极贮器(例如，用强电解质、缓冲液、试剂等)填充时基本无气泡地润湿膜的表面。
[0178]
可以通过期望的材料特性来选择膜。例如，可以针对期望的孔隙大小、亲水性、疏水性、两亲性、浸润性、带电或不带电、惰性、机械性能(例如，刚性、顺应性、柔性、韧性)等来选择膜。在一些情况下，膜可以包括天然或合成材料。膜可以包含一种或多种聚合物。在优选的实施例中，膜包含纤维素或再生纤维素并且是亲水性的。在另一个优选的实施例中，膜包括聚合物，例如，聚四氟乙烯(ptfe)。在使用聚合物的情况下，可以制造或处理聚合物(例如，ptfe)以获得有用的特性(例如，编织、处理以使表面亲水等)。在又一个优选的实施例中，膜包括刚性材料，例如，玻璃或陶瓷。在一些实施例中，膜可以被处理为亲水性的和/或不带电的。
[0179]
在一些情况下，膜在位于电极贮器内的高电压电极与容纳在入口流体通道和出口流体通道内的流体(例如，液体、缓冲液等)之间提供高流体动力阻力和低电阻连接。入口流体通道和出口流体通道的相交部与贮器之间的流体动力阻力可以是约0.01((n/mm2)/(mm3/s))、约0.1((n/mm2)/(mm3/s))、约1((n/mm2)/(mm3/s))、约10((n/mm2)/(mm3/s))、约100((n/mm2)/(mm3/s))、约1000((n/mm2)/(mm3/s))、约10000((n/mm2)/(mm3/s))、约100000((n/mm2)/(mm3/s))或约1000000((n/mm2)/(mm3/s))。入口流体通道和出口流体通道的相交部与贮器之间的流体动力阻力可以是至少0.01((n/mm2)/(mm3/s))、至少0.1((n/mm2)/(mm3/s))、至少1((n/mm2)/(mm3/s))、至少10((n/mm2)/(mm3/s))、至少100((n/mm2)/(mm3/s))、至少1000((n/mm2)/(mm3/s))、至少10000((n/mm2)/(mm3/s))、至少100000((n/mm2)/(mm3/s))或至少1000000((n/mm2)/(mm3/s))。入口流体通道和出口流体通道的相交部与贮器之间的流体动力阻力可以是至多1000000((n/mm2)/(mm3/s))、至多100000((n/mm2)/(mm3/s))、至多10000((n/mm2)/(mm3/s))、至多1000((n/mm2)/(mm3/s))、至多100((n/mm2)/(mm3/s))、至多10((n/mm2)/(mm3/s))、至多1((n/mm2)/(mm3/s))、至多0.1((n/mm2)/(mm3/s))或至多0.01((n/mm2)/(mm3/s))。入口流体通道和出口流体通道的相交部与贮器之间的流体动力阻力可以在值的范围内，例如，在1((n/mm2)/(mm3/s))和10000((n/mm2)/(mm3/s))之间。
[0180]
在一些情况下，可以使用哈根-泊肃叶等式来计算膜的一部分(例如，孔隙)的流体动力阻力，等式3：
[0181]r流体动力
＝8*粘度*膜厚度/(πr
孔隙4
)
[0182]
其中，r
流体动力
是一个孔隙的流体动力阻力，粘度是散装液体的粘度，r
孔隙
是单个孔隙的半径。横过整个膜的流体动力阻力可以等于由r
流体动力
除以孔隙数量。例如，如果使用具有
3nm直径的孔隙和100μm的厚度的膜来抑制在25℃下的水溶液的流体动力流动(粘度＝0.89cp)，则通过此等式r
流体动力
等于8*(0.89cp)*(100μm)/((π)*(1.5nm)4)，或者，4.48*10
13
((n/mm2)/(mm3/s))。如果膜的表面积为1mm2并且孔隙面积分数为5％，则孔隙数量等于(1mm2)*(0.05)/((π)*(1.5nm)2)，或者，7.1*109个孔隙，并且总流体动力阻力等于(4.48*10
13
((n/mm2)/(mm3/s)))/7.1*109，或者6330((n/mm2)/(mm3/s))。
[0183]
在一些实施例中，孔隙的电阻可以使用等式4来计算：
[0184]r电
＝(溶液电阻率)*(膜厚度)/(πr
孔隙2
)
[0185]
其中，r
孔隙
是单个孔隙的半径。例如，如果溶液电阻率为500(ω)(cm)、膜厚度为100μm并且孔隙直径为3nm，则r
电
将等于(500ω*cm)*(100μm)/((π)*(1.5nm)2)，或者7.1*10
13
ω。如果孔隙数量为7.1*109个孔，则膜的总电阻在该示例中等于10000ω。
[0186]
入口流体通道和出口流体通道的相交部与电极贮器之间的电阻可以是约10000000欧姆、约1000000欧姆、约100000欧姆、约10000欧姆、约1000欧姆、约100欧姆、约10欧姆、约1欧姆、约0.1欧姆或约0.01欧姆。入口流体通道和出口流体通道的相交部与电极贮器之间的电阻可以是至多10000000欧姆、至多1000000欧姆、至多100000欧姆、至多10000欧姆、至多1000欧姆、至多100欧姆、至多10欧姆、至多1欧姆、至多0.1欧姆或至多0.01欧姆。入口流体通道和出口流体通道的相交部与电极贮器之间的电阻可以在值的范围内，例如，在约100000欧姆和10000000欧姆之间。
[0187]
在一些情况下，流体动力阻力与电阻(所述电阻为在入口流体通道和出口流体通道的相交部与电极贮器之间的电阻)的比率可以是约0.001((n/mm2)/(mm3/s))/ω、约0.01((n/mm2)/(mm3/s))/ω、约0.1((n/mm2)/(mm3/s))/ω、约1((n/mm2)/(mm3/s))/ω、约10((n/mm2)/(mm3/s))/ω、约100((n/mm2)/(mm3/s))/ω、约1000((n/mm2)/(mm3/s))/ω、约10000((n/mm2)/(mm3/s))/ω。在一些情况下，流体动力阻力与电阻(所述电阻为在入口流体通道和出口流体通道的相交部与电极贮器之间的电阻)的比率可以是至少0.001((n/mm2)/(mm3/s))/ω、至少0.01((n/mm2)/(mm3/s))/ω、至少0.1((n/mm2)/(mm3/s))/ω、至少1((n/mm2)/(mm3/s))/ω，至少10((n/mm2)/(mm3/s))/ω、至少100((n/mm2)/(mm3/s))/ω、至少1000((n/mm2)/(mm3/s))/ω、至少10000((n/mm2)/(mm3/s))/ω或更大。在一些情况下，流体动力阻力与电阻(所述电阻为在入口流体通道和出口流体通道的相交部与电极贮器之间的电阻)的比率可以在值的范围内，例如，在1000((n/mm2)/(mm3/s))/ω和1000000((n/mm2)/(mm3/s))/ω之间。
[0188]
在一些情况下，电极贮器可以被填充有浓度为约0.1毫摩尔(mm)、约0.5mm、约1mm、约5mm、约10mm、约50mm、约100mm、约500mm或约1摩尔(m)的电解质溶液。电解质溶液浓度可以是至少0.1毫摩尔(mm)、至少0.5mm、至少1mm、至少5mm、至少10mm、至少50mm、至少100mm、至少500mm或至少1摩尔(m)。电解质溶液浓度可以是至多约1m、至多约500mm、至多约100mm、至多约50mm、至多约10mm、至多约5mm、至多约1mm、至多约0.5mm或至多约0.1mm。电解质溶液浓度可以在浓度的范围内，例如，在约1毫摩尔(mm)至约500mm之间。在一些情况下，在操作期间，电极贮器被填充有浓度在约10mm至约150mm之间的电解质溶液。
[0189]
在一些情况下，在操作期间，电极贮器被填充有ph范围在约1.5和约14之间的电解质溶液。例如，在分离通道的近侧端部处的一个电极贮器可以包含约1.5个ph单位的电极溶液，并且在分离通道的远侧端部处的另一个电极贮器可以包含约14个ph单位的电极溶液，
或者在分离通道的远侧端部处的一个电极贮器可以包含约1.5个ph单位的电极溶液，并且在分离通道的近侧端部处的另一个电极贮器可以包含约14个ph单位的电极溶液。将应理解，可以基于对分离分析物类有用的ph范围来调谐电极贮器之间的ph范围或ph差异。例如，如果分析物混合物包括在窄ph范围内的预期pi值，则可以将电极贮器的ph范围或差异调整为更窄的，以便为给定的分析物混合物实现更高的分离分辨率。
[0190]
在一些情况下，电解质溶液包含强酸、强碱或高溶解性盐。强酸的示例包括但不限于高氯酸、盐酸、硫酸和类似物。强碱的示例包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和类似物。高溶解性盐的示例包括但不限于氯化钠、硝酸钾、氯化镁和类似物。在一些情况下，可以使用弱酸或弱碱作为电解质溶液。弱酸的示例包括但不限于磷酸、甲酸、乙酸、碳酸和类似物。弱碱的示例包括但不限于氢氧化铵、二乙胺、二甲胺、哌啶和类似物。在一些情况下，电解质溶液的ph值可以是约1.5个ph单位和约14个ph单位。在一些情况下，电解质溶液的ph可以是约2个ph单位和约11个ph单位。在一些情况下，电解质溶液的ph值可以是约3个ph单位和约9个ph单位。在一些情况下，电解质溶液的ph可以是约5个ph单位和约8个ph单位。
[0191]
流体流量控制器：在一些情况下，所公开的系统可以包括一个或多个可编程流体流量控制器，其被配置为提供例如通过两个或更多个分离通道的独立受控的压力驱动流动(例如，用于单独使用或用于与施加到两个或更多个分离通道的电压梯度结合使用)或与分离通道相交的辅助通道。在一些情况下，压力驱动流动可以用于使分离的分析物峰从分离通道活动出来。在一些情况下，压力驱动流动可以用于例如将化学动员剂引入到分离通道中(例如，破坏用于等电聚焦的ph梯度的电解质)，由此使分离的分析物峰从分离通道活动出来。在一些情况下，压力驱动流动可以用于例如将化学动员剂引入到分离通道中(例如，用于从限制在分离通道内的固定相洗脱分析物的洗脱缓冲液)，由此使分离的分析物峰从分离通道活动出来。在一些情况下，可以通过将限流器集成到装置中来控制流动，例如，长毛细管或通道长度，以增加流体动力阻力和提供均匀的流动分布和电喷雾性能。
[0192]
通过所公开的装置和系统的压力驱动流体流动的控制将典型地通过使用泵(或其它流体致动机构)和阀来执行。合适的泵的示例包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵、活塞泵和类似物。在一些实施例中，通过系统的流体流动可以借助于在装置上的一个或多个流体入口或样本或试剂贮器处施加正气压来控制。在一些实施例中，通过系统的流体流动可以借助于在一个或多个流体出口或废物贮器处抽真空来控制。合适的阀的示例包括但不限于止回阀、机电二通或三通阀、气动二通和三通阀和类似物。在一些情况下，一个或多个微型泵或(例如，蠕动泵、压电泵)、微型阀(例如，计量喷射阀、压电阀、旋塞阀、滑阀)可以被集成在装置内。在某些情况下，通过所公开的装置和系统的控制或压力驱动流体流动可以使用球囊、泡罩包装、活塞、螺钉、玻璃料或它们的组合来执行。在一些情况下，压力驱动流体流动可以是无脉冲的。
[0193]
在一些实施例中，可以使用一个或多个装置或系统参数来控制通过系统的流体流动。在一些情况下，可以通过改变系统的温度(例如，改变装置的区域中的气体压力)或通过引入温度梯度来在装置中产生流动。在一些情况下，可以改变贮器高度以驱动流动通过装置的一个或多个通道(例如，经由液体静压力)。在一些情况下，装置的一部分(例如，入口或出口)可以被暴露并且允许蒸发，由此驱动流体流动通过通道。在一些情况下，流体流动可
以是无脉冲的。
[0194]
在一些情况下，可以电力地执行通过所公开的装置和系统的流体流动。例如，可以使用例如电渗泵来执行装置的一个或多个通道中或通道外的电渗流。
[0195]
在执行所公开的分析物分离方法期间，可以在不同的点处利用流体流动控制的不同模式，例如，可以全部使用正向流(相对于用于给定装置或分离通道的入口和出口)、反向流、振荡流或脉动流或其组合。例如，在一些情况下，例如，在装置起动步骤期间，可以使用振荡流或脉动流，以促进可以被困在装置内的任何气泡的移动。在一些情况下，可以使装置经受真空(例如，脱气)以用于装置灌注，例如，以促进流体或试剂的无气泡引入。
[0196]
在执行所公开的分析物分离方法期间，可以在不同的点处利用不同的流体流动速率。例如，在所公开的装置和系统的一些实例中，体积流动速率可以从-100ml/s到+100ml/s变化。在一些情况下，体积流动速率的绝对值可以是至少0.001ml/s、至少0.01ml/s、至少0.1ml/s、至少1ml/s、至少10ml/s或至少100ml/s。在一些情况下，体积流动速率的绝对值可以是至多100ml/s、至多10ml/s、至多1ml/s、至多0.1ml/s、至多0.01ml/s或至多0.001ml/s。在给定时间点处的体积流动速率可以具有在该范围内的任何值，例如，2.5ml/s的正向流动速率、-0.05ml/s的反向流动速率或0ml/s的值(即，停止流动)。在一些情况下，压力驱动流体流动模式和/或通过每个分离通道和/或辅助流体通道的流体流动速度可以被彼此独立地编程以遵循指定的时间进程。
[0197]
自动取样器和流体装卸系统：在一些情况下，所公开的系统还可以包括自动取样器或流体装卸系统，所述自动取样器或流体装卸系统被配置为用于将样本等分试样和/或其它分离反应试剂自动地且独立地控制加载到通向分离通道的多个样本或试剂入口端口中。在一些情况下，可以将定制的自动取样器或流体装卸模块并入所公开的系统中。在一些情况下，可以将可商购的自动取样器或流体装卸模块集成到所公开的系统中。合适的可商购的自动取样器的示例包括但不限于安捷伦1260无限双回路自动取样器和1260无限高性能微型自动取样器(美国加利福尼亚州，圣克拉拉市，安捷伦科技)、ht1500l hplc自动取样器(意大利，布雷西亚市，hta)、spark holland alias(荷兰，埃曼，spark-holland)以及sil-20a/ac hplc自动取样器(美国马里兰州，哥伦比亚市，岛津制作所)。合适的可商购的流体装卸系统(或液体装卸系统)的示例包括但不限于tecan系统(瑞士，tecan贸易公司)、汉密尔顿麦蓝star和麦蓝nimbus系统(美国内华达州，里诺，汉密尔顿)以及安捷伦布拉沃自动液体装卸平台和安捷伦竖式移液站(美国加利福尼亚州，圣克拉拉市，安捷伦科技)。
[0198]
在一些情况下，一个或多个流体流量控制器或流体装卸系统可以用于填充或补充一个或多个贮器。如本文所描述的，贮器可以与膜(例如，被包含在固定器和/或电极接口单元中)流体连通，所述膜可以与微流体装置接合并且防止在装置与膜的界面处形成气泡。可以使用各种流体控制器或流体装卸系统来填充贮器。例如，流体控制器可以用于将缓冲液或试剂分配到每个贮器。在一些情况下，流体控制器可以包括移液管尖端(例如，1000微升的移液管尖端)，并且贮器可以被配置为接收移液管尖端。在一些情况下，贮器可以包括从底部填充贮器的进入端口。在一些情况下，贮器可以包括用于在不形成气泡的情况下进入移液管尖端的侧端口。在一些情况下，贮器可以包括法兰，所述法兰可以帮助流体流量控制器的集成或接合。
[0199]
废物管理：在一些实施例中，系统还可以包括废物管理模块，所述废物管理模块可以与微流体装置集成(即，附接至微流体装置)或与微流体装置分离。废物管理模块可以用于从微流体装置收集废弃产物。在一些情况下，另外地或可替代地，废物管理模块可以用于管理微流体装置的出口或表面处的液滴形成。例如，废物管理模块可以用于防止在装置的出口(例如，电喷雾尖端)处形成液滴和/或防止液滴芯吸到装置的不同分段或部分(例如，入口、接口电极等)。在一些情况下，废物管理模块可以包括施加正压或负压(例如，真空)。在这种情况下，可以对微流体装置的一部分(例如，出口或电喷雾尖端)施加真空。例如，可以将法兰或适配器应用于芯片，从而在对装置的放置或对任何下游分析单元(例如，质谱仪)的干扰最小的情况下允许真空待与装置接合。然后，随着从出口或电喷雾尖端驱排液滴或废弃产物，真空可以用于抽吸液滴或废弃产物。
[0200]
可以通过多种设备施加真空，所述多种设备可以被形成为一种或多种形状。例如，通过其施加真空的设备可以被成形为如同喇叭或漏斗。喇叭或漏斗可以被配置为向尖端施加真空。在一些情况下，该设备可以被配置为回旋或运动到不同的位置中。在另一个实施例中，可以通过管状设备施加真空。该管可以是圆锥形的、圆柱形的或任何其它形状。在一些情况下，管还可以包括开口模块，所述开口模块可以用于施加真空并且将废弃产物引导至废物容器。例如，管可以被放置在芯片(例如，使用法兰接合)和质谱仪之间，并且管可以包括开口模块，例如，从电喷雾尖端引导废弃产物的真空套管，使得废弃产物没有到达质谱仪。在一些情况下，管可以以一定角度取向，例如，垂直于出口或电喷雾尖端。在这种情况下，真空可以被施加到管并且可以在液滴离开装置时抽吸液滴。在一些情况下，管可以是透明的，使得如本文所述的一个或多个成像系统可以用于对电喷雾尖端成像。在另一个实施例中，真空可以通过模块化装置施加，所述模块化装置可以被配置为附接至真空。例如，模块化装置可以被配置为夹持或附接至装置的一部分。一旦将模块化装置固定到装置，就可以对模块化装置施加真空，从而引导废弃产物远离微流体装置。
[0201]
在一些情况下，废物管理模块可以包括使用正压。例如，气刀可以用于引导液滴远离电喷雾尖端。在这样的示例中，气刀可以被连接到空气或氮气源和/或加压器以产生空气(或氮气)压力来喷射液滴或引导液滴远离装置或其部分(例如，电喷雾尖端)。在一些情况下，废物管理模块可以包括雾化单元。例如，雾化器可以被配置为固定到芯片。雾化器可以包括对于将空气朝向芯片引导所必需的几何形状，使得液滴或废弃产物被引导远离电喷雾尖端或出口(例如，到达废物容器)。雾化器可以包括密封机构并且可以被连接到空气源和/或加压器以产生气压来喷射液滴或引导液滴远离电喷雾尖端。在一些情况下，雾化器可以包括喷嘴。雾化器可以由聚合物、金属或陶瓷材料构成。
[0202]
在一些情况下，废物管理模块可以包括使用机械方法来从出口或电喷雾尖端去除废物和/或液滴。例如，可以使用一个或多个擦拭器来使液滴从装置机械地运动(例如，扫掠)。可替代地或另外地，吸收性材料可以被集成到废物管理模块中，以从出口或电喷雾尖端吸走或芯吸掉废物材料。
[0203]
在一些情况下，废物管理模块可以与其它用于废物管理的方法协同使用。例如，该装置可以包括几何形状或化学/材料特性，其允许用于控制在出口处的液滴形成和/或将液滴和流体到装置的不同分段或部分(例如，电极或入口)的芯吸最小化。在一些情况下，涂层可以用于允许在装置的尖端或出口处形成液滴并且可以帮助防止流体芯吸到装置的其它
分段或部分。在一些情况下，涂层可以是疏水性涂层。
[0204]
在一些情况下，装置的几何形状或取向可以用于控制出口处的液滴形成和/或将液滴到装置的不同分段或部分的芯吸最小化。例如，出口或电喷雾尖端可以被形成为三角形尖端以允许用于最佳的液滴形成。在一些情况下，装置的空间取向可以用于控制废物管理。例如，该装置可以成一条角度，使得出口(例如，尖端)被向下取向，并且废物可以通过重力流出微流体装置而被驱动。可以使用任何合适的角度来引导重力流出微流体装置。例如，该角度可以是约30
°
、31
°
、32
°
、33
°
、34
°
、35
°
、36
°
、37
°
、38
°
、39
°
、40
°
、41
°
、42
°
、43
°
、44
°
、45
°
、46
°
、47
°
、48
°
、49
°
、50
°
、51
°
、52
°
、53
°
、54
°
、55
°
、56
°
、57
°
、58
°
、59
°
、60
°
等。在一些情况下，该系统还包括与用于收集废弃产物的装置分离的废物容器。
[0205]
在一些情况下，废物管理模块可以消除对装置上的废物贮器的需要。例如，废物可以以液滴或流的形式从装置中驱排出，并且可以例如经由使用真空抽吸来去除。
[0206]
成像模块：在一些情况下，该系统还可以包括成像模块，所述成像模块被配置为获取两个或更多个分离通道或其一部分的一系列一个或多个图像。在一些情况下，图像的视场可以包括两个或更多个分离通道的全部或一部分。在一些情况下，成像可以包括在执行分离和/或活动化反应的同时对两个或更多个分离通道的全部或一部分连续成像。在一些情况下，成像可以包括在执行分离和/或活动化反应的同时对两个或更多个分离通道的全部或一部分间歇或周期成像。在一些情况下，成像可以包括获取uv吸光度图像。在一些情况下，成像可以包括获取荧光图像，例如，天然荧光或由于附着于分析物的外源荧光标签的存在而产生的荧光。在一些情况下，成像模块可以被配置为例如确定等电聚焦反应何时完成和/或检测故障(例如，分离通道中的气泡的引入或形成)。
[0207]
多种成像系统或系统部件中的任一种可以用于实现所公开的方法、装置和系统的目的。示例包括但不限于一种或多种光源(例如，发光二极管(led)、二极管激光器、光纤激光器、气体激光器、卤素灯、弧光灯等)、聚光透镜、物镜、反射镜、滤光片、分束器、棱镜、图像传感器(例如，ccd图像传感器或照相机、cmos图像传感器或照相机)和类似物或它们的任何组合。在一些情况下，一个或多个光源可以包括光源阵列。例如，led阵列可以用于照亮装置的一个或多个区域。依据所使用的成像模式，光源和图像传感器可以被定位在微流体装置的相对侧上，例如，以便可以获取基于吸光度的图像。在一些情况下，光源和图像传感器可以被定位在微流体装置的同一侧上，例如，以便可以获取落射荧光图像。
[0208]
如上所述，可以在分离和/或活动化步骤期间连续地获取图像，或者可以以随机或指定的时间间隔获取图像。在一些情况下，连续地或以随机或指定的时间间隔获取一系列一个或多个图像。在一些情况下，快速地(例如，毫秒时间尺度)获取一系列短曝光图像(例如，10张到20张图像)，然后它们被平均化以提供具有改进的信噪比的“单幅图像”。在一些情况下，每1秒、5秒、10秒、20秒、30秒或以更长的时间间隔获取“单幅图像”。在一些情况下，可以使用更长的曝光时间来改进信噪比。在一些情况下，一系列一个或多个图像可以包括视频图像。
[0209]
图像处理：在一些情况下，如上所述，该系统可以包括处理器、控制器或计算机，其被配置为运行图像处理软件以用于检测分析物峰的存在、确定pi标记或分离的分析物带的位置、确定峰宽度，确定峰形状(例如，高斯拟合或其它曲线拟合算法)或这些参数中的任一者随时间的变化。在一些情况下，图像处理可以用于检测故障，例如，在两个或更多个分离
reference product:guidance for industry”)。对于蛋白质产品而言会需要的结构表征数据的示例包括一级结构(即，氨基酸序列)、二级结构(即，形成α螺旋结构或β片状结构的折叠程度)、三级结构(即，通过折叠多肽骨架和二级结构域所产生的蛋白质的三维形状)和四级结构(例如，形成活性蛋白质复合物或蛋白质的聚集状态所需的亚基数量)。在许多情况下，在不采用费力、耗时且成本高昂的技术(诸如x射线晶体学)的情况下会无法获得此信息。因此，为了在候选生物药物和参考药物之间建立生物相似性的目的，需要允许用于方便、实时且相对高通量地表征蛋白质结构的实验技术。
[0215]
在一些情况下，所公开的方法、装置和系统可以用于为候选生物药物(例如，单克隆抗体(mab))和参考生物药物提供结构比较数据，以用于建立生物相似性的目的。例如，在一些情况下，确定用于候选药物和参考药物的等电点可以提供重要的证据来支持证明生物相似性。在一些实施例中，用于在相同反应条件下均已用位点特异性蛋白酶处理的候选药物和参考药物的等电点数据可以提供重要的证据来支持证明生物相似性。在一些实施例中，所公开的方法、装置和系统可以用于监测生物药物制造过程(例如，以实时监测生物反应器过程)以通过分析在生产过程中的不同点处抽取的样本或从不同的生产运行抽取的样本来确保产品的质量和一致性。
[0216]
所公开的用于并行地执行多个独立受控的分离反应的装置和系统提供优于当前可用技术的许多优点，例如，在不同通道中执行不同等电聚焦反应(或其它分离反应)(例如，使用不同的ph梯度、不同的聚焦时间、不同的聚焦电压等)以用于更详细和准确的样本表征(例如，更准确确定pi)的能力，或者同时地使用相同的一组分离反应条件并行地处理多个样本以用于更高通量样本表征的能力。此外，当试图证明生物相似性等时，独立监测和/或记录用于每个分离通道的电流迹线和/或电压设置可以有利于满足对fda提交的数据跟踪要求。如前所述，在一些情况下，所公开的装置和系统可以被配置为识别样本运行故障(例如，微流体装置中的气泡的存在或形成)并且开启恢复步骤(例如，通过从微量滴定板或其它样本源自动地重新加载样本并且重复分离反应)。
[0217]
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选的实施例，但是对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，这样的实施例仅作为示例提供。本发明并不意欲受本说明书中提供的具体示例的限制。尽管已经参照前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施例的描述和说明并不意味着被解释为限制意义。在没有背离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将想到许多变型方案、改变方案和替代方案。此外，将应理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。将应理解，在实践本发明时，可以采用本文描述的本发明的实施例的各种可替代方案。因此，预料到，本发明还应涵盖任何这样的可替代方案、修改方案、变型方案或等同方案。所附权利要求书意欲限定本发明的范围，并且在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物由此被覆盖。
[0218]
示例
[0219]
提供这些示例仅用于说明的目的，而不是限制本文提供的权利要求书的范围。
[0220]
示例1
–
包括四个分离通道的微流体装置
[0221]
图1a提供用于执行多个分离反应(例如，等电聚焦反应)的微流体装置的一个非限制性示例的视图。该装置包括下基底101，所述下基底101可以是基本平面的，包括熔融石英，其中使用例如压印、激光微加工或光刻和湿法化学蚀刻来制造测量为210微米的宽度和
100微米的深度的流体通道。通过将基底101粘合到透明盖玻片102来密封流体通道。在一些情况下，例如，在uv吸光度成像用于监测分离和/或活动化反应的情况下，基底101可以由光学透明材料制造。在一些情况下，例如，在使用落射荧光成像来监测分离和/或活动化反应的情况下，基底101可以由光学不透明材料制造。尽管该装置被图示为矩形，但是将应理解，该装置可以采用任何有用的形状。在一些实施例中，所述微流体装置可以包括尖端(例如，在远侧端部处)，其可以允许用于将流体指引远离该装置(例如，指引到废物容器或分析单元，例如，质谱仪)。
[0222]
通过样本入口端口103、阳极凹孔104、阴极凹孔106、样本出口端口107和化学动员剂入口端口109提供对该装置内的流体通道的接近。一个阳极凹孔104和阴极凹孔106分别与每个分离通道105的近侧端部和远侧端部流体和电连通(在该非限制性示例中示出四个分离通道)。在一些情况下，电极可以被放置成与阳极凹孔104和阴极凹孔106接触。分离通道延伸超出阴极凹孔106到样本出口端口107(仅标记出图中所示的四个分离通道中的两个)。化学动员剂入口端口109经由化学活动化通道108连接到分离通道105的远侧端部(仅标记出图中所示的四个分离通道中的两个)。如图1a所示，入口端口109和出口端口107可以被配置为加载通过该装置的侧，这可以促进全通道或全装置成像。
[0223]
为了用于执行多个等电聚焦反应以分离蛋白质混合物，蛋白质样本与两性电解质ph梯度和pi标记预混合，并且继而被放入小瓶中和加载到自动取样器上。样本由自动取样器经由样本入口端口103被逐次地加载到装置中，通过分离通道105被加载到微流体装置上，并且通过样本出口端口107排出装置以浪费。
[0224]
将阴极液流体(例如，在h2o中的1％n4oh)加载到阴极凹孔106中，将阳极液(例如，10mm的h3po4)加载到阳极凹孔104中，并且将动员剂溶液(例如，49％的meoh，49％的h2o，1％的乙酸)连接到动员剂入口端口109。
[0225]
在加载所有试剂之后，通过将电极连接到阳极凹孔104和阴极凹孔106而将例如+600v/cm的电场从一个或多个阳极凹孔104施加到相对应的阴极凹孔106来发起等电聚焦。如上所述，施加到每个分离通道105的电压和/或电流可以被独立控制并且也可以作为时间的函数被记录。在一些情况下，用于阳极和阴极的电极可以与装置集成。对于uv吸收度成像，由uv光源提供的准直光束与分离通道105对准，并且图像传感器(例如，ccd照相机或cmos照相机)被放置在分离通道105的另一侧上以测量通过每个分离通道105透射的光量，由此借助于聚焦的蛋白质(或其它分离的分析物)的吸光度来对它们成像和检测。在一些情况下，聚焦的蛋白质可以是未标识的，并且通过在220nm、280nm或将供蛋白质吸光的任何其它波长下的天然吸光度来检测。对于荧光成像，即，落射荧光成像，借助于包括合适的二向色反射器和带通滤光片的光学组件将合适波长的激发光传送到分离通道105，并且通过相同的光学组件从分离通道105收集发射的荧光，并且将发射的荧光成像到图像传感器上。在一些情况下，可以使用天然荧光对聚焦的蛋白质(或其它分离的分析物)成像和检测。在一些情况下，可以使用非共价结合的荧光标签、显色标签、发荧光标签或发色团标签(例如，红宝石、考马斯亮蓝和类似物)来检测聚焦的蛋白质。在一些情况下，装置的多个部分可以由光学不透明的材料构造，使得光可以仅通过分离通道105传输，由此阻止任何杂散光在没有通过分离通道105的情况下到达图像传感器并且增加uv吸光度测量的灵敏度。
[0226]
随着在多个分离通道105中执行等电聚焦反应，可以连续地和/或周期性地捕获分离通道105的全部或部分中的聚焦蛋白质的图像。在一些情况下，分离通道105的图像中的pi标记的位置检测可以用于确定作为沿着分离通道的位置的函数的局部ph，并且通过外推法针对分离的蛋白质(或其它分析物)进行更准确的pi的确定。在一些情况下，当聚焦完成时，在样本入口端口103和/或阳极凹孔104处施加正压，以使分离的蛋白质(或其它分析物)混合物朝向样本出口107活动。在一些情况下，当聚焦完成时，连接到阴极凹孔106的电极被断开，并且与动员剂通道108电连通的电极用于将600v/cm的电场从阳极凹孔104施加到化学动员剂入口109以将动员剂电泳式地引入到分离通道105中。在一些情况下，代替化学动员剂的电泳引入或除了化学动员剂的电泳引入以外，可以使用施加到动员剂入口109的轻微正压。
[0227]
在电泳引入动员剂的情况下，动员剂溶液中的乙酸通过电场被吸引到分离通道105中，在分离通道105中乙酸使蛋白质和两性电解质离子化并且破坏用于等电聚焦的ph梯度。富集的蛋白质级分的离子化促使它们朝向样本出口107迁移出分离通道105。在活动化过程期间对分离通道105的继续成像可以用于对用于每个分离的蛋白质的pi的确定细化。
[0228]
示例2使用所公开的装置和系统以证明生物相似性的预测示例
[0229]
所公开的装置和系统的实用性的一个非限制性示例是在生物制品的领域中和生物相似性的证明。如上所述，fda和其它监管机构要求使用逐步方法来证明生物相似性，其可以包括在结构、功能、动物毒性、人体药代动力学(pk)和药效学(pd)、临床免疫原性和临床安全性和有效性方面比较拟定产品和参考产品。对于蛋白质产品而言会需要的结构表征数据的示例包括一级结构(即，氨基酸序列)、二级结构(即，形成α螺旋结构或β片状结构的折叠程度)、三级结构(即，通过折叠多肽骨架和二级结构域所产生的蛋白质的三维形状)和四级结构(例如，形成活性蛋白质复合物或蛋白质的聚集状态所需的亚基数量)。蛋白质等电点的准确确定可以为候选生物药物与参考药物的比较提供重要的数据，以便证明生物相似性。制造的候选生物仿制药和参考药物的样本等分试样可以被加载到所公开的装置或系统中，并且在一组或多组等电聚焦反应条件下(例如，使用不同的缓冲物、ph梯度、施加的电压和/或电流等)被表征，以确定在一组或多组反应条件下的准确pi值并且为候选生物仿制药物和参考药物提供有价值的比较数据。此外，监测和记录用于每个单独的分离反应的电流迹线(以及用于执行等电聚焦反应的其它操作参数)有助于与fda数据提交要求相符。
[0230]
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选的实施例，但是对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，这样的实施例仅作为示例提供。在没有背离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将想到许多变型方案、改变方案和替代方案。将应理解，在实践本发明时，可以以任何组合采用本文描述的本发明的实施例的各种可替代方案。所附权利要求书意欲限定本发明的范围，并且在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物由此被覆盖。
[0231]
示例3包含侧端口的微流体装置
[0232]
图2提供用于执行一个或多个分离反应(例如，等电聚焦反应)的微流体装置的一个非限制性示例的示意性自上而下的视图。该装置包括基底201，其可以是基本平面的，其中使用例如压印、激光微加工或光刻和湿法化学蚀刻来制造测量为210微米的宽度和100微米的深度的流体通道。可以通过将基底201粘合到透明盖玻片(未示出)来密封流体通道。在一些情况下，例如，在uv吸光度成像用于监测分离和/或活动化反应的情况下，基底201可以
由光学透明材料制造。在一些情况下，例如，在使用落射荧光成像来监测分离和/或活动化反应的情况下，基底201可以由光学不透明材料制造。
[0233]
通过样本入口端口207提供对该装置内的流体通道的接近，所述样本入口端口207可以位于芯片的侧上。芯片还可以包括电极贮器(例如，阳极凹孔206、阴极凹孔204)、样本出口端口203和化学动员剂入口端口209。一个阳极凹孔206和阴极凹孔204分别与分离通道205的近侧端部和远侧端部流体和电连通。化学动员剂入口端口209经由化学活动化通道被连接到分离通道205的远侧端部。
[0234]
为了用于执行多个等电聚焦反应以分离蛋白质混合物，蛋白质样本与两性电解质ph梯度和pi标记预混合，并且继而被放入小瓶中和加载到自动取样器上。样本由自动取样器经由样本入口端口207被逐次地加载到装置中，通过分离通道205被加载到微流体装置上，并且通过样本出口端口203排出装置以浪费。
[0235]
将阴极液流体(例如，在h2o中的1％n4oh)加载到阴极凹孔204中，将阳极液(例如，10mm的h3po4)加载到阳极凹孔206中，并且将动员剂溶液(例如，49％的meoh，49％的h2o，1％的乙酸)连接到动员剂入口端口209。膜(未示出)可以与任何阳极凹孔或阴极凹孔(206和204)接合，以提供装置与电极的电和流体连通。在3中示出样本出口或esi尖端203的等距剖视示意图。
[0236]
参照图2，在加载所有试剂之后，通过将电极连接到电极贮器(阳极凹孔206和阴极凹孔204)而将例如+600v/cm的电场从一个或多个阳极凹孔孔206施加到相对应的阴极凹孔204来发起等电聚焦。如上所述，施加到每个分离通道205的电压和/或电流可以被独立控制并且也可以作为时间的函数被记录。在一些情况下，用于阳极和阴极的电极可以与装置集成。对于uv吸收度成像，由uv光源提供的准直光束与分离通道205对准，并且图像传感器(例如，ccd照相机或cmos照相机)被放置在分离通道205的另一侧上以测量通过每个分离通道205透射的光量，由此借助于聚焦的蛋白质(或其它分离的分析物)的吸光度来对它们成像和检测。在一些情况下，聚焦的蛋白质可以是未标识的，并且通过在220nm、280nm或将供蛋白质吸光的任何其它波长下的天然吸光度来检测。对于荧光成像，即，落射荧光成像，借助于包括合适的二向色反射器和带通滤光片的光学组件将合适波长的激发光传送到分离通道205，并且通过相同的光学组件从分离通道205收集发射的荧光，并且将发射的荧光成像到图像传感器上。在一些情况下，可以使用天然荧光对聚焦的蛋白质(或其它分离的分析物)成像和检测。在一些情况下，可以使用非共价结合的荧光标签、显色标签、发荧光标签或发色团标签(例如，红宝石、考马斯亮蓝和类似物)来检测聚焦的蛋白质。在一些情况下，装置的多个部分可以由光学不透明的材料构造，使得光可以仅通过分离通道205传输，由此阻止任何杂散光在没有通过分离通道105的情况下到达图像传感器并且增加uv吸光度测量的灵敏度。
[0237]
随着在多个分离通道205中执行等电聚焦反应，可以连续地和/或周期性地捕获分离通道205的全部或部分中的聚焦蛋白质的图像。在一些情况下，分离通道205的图像中的pi标记的位置检测可以用于确定作为沿着分离通道的位置的函数的局部ph，并且通过外推法针对分离的蛋白质(或其它分析物)进行更准确的pi的确定。在一些情况下，当聚焦完成时，在样本入口端口207和/或阳极凹孔206处施加正压，以使分离的蛋白质(或其它分析物)混合物朝向样本出口203活动。在一些情况下，当聚焦完成时，连接到阴极凹孔204的电极被
断开，并且与动员剂通道208电连通的电极用于将600v/cm的电场从阳极凹孔206施加到化学动员剂入口209以将动员剂电泳式地引入到分离通道205中。在一些情况下，代替化学动员剂的电泳引入或除了化学动员剂的电泳引入以外，可以使用施加到动员剂入口209的轻微正压。
[0238]
在电泳引入动员剂的情况下，动员剂溶液中的乙酸通过电场被吸引到分离通道205中，在分离通道205中乙酸使蛋白质和两性电解质离子化并且破坏用于等电聚焦的ph梯度。富集的蛋白质级分的离子化促使它们迁移出分离通道205。在活动化过程期间对分离通道205的继续成像可以用于对用于每个分离的蛋白质的pi的确定细化。
[0239]
示例4使用真空设备的废物管理
[0240]
图4提供示例性废物管理系统的示意图。在一些情况下，废物管理系统可以用于引导废物远离微流体装置401。在一些情况下，废物管理系统还可以用于防止液滴芯吸到装置401的另一部分。如图4所示，装置401可以被联接到台架405。在一些情况下，微流体装置401可以被插入盒筒中，所述盒筒可以继而联接到台架405。台架和/或盒筒可以包括管道和附件以流体地和/或电地连接到装置401。废物管理系统可以包括真空设备407。真空设备407可以具有如同喇叭的形状，并且可以被配置为向装置401的尖端施加真空。在一些情况下，设备407可以被配置为使用适配器(例如，法兰403)附接至装置401的一部分。法兰403可以包括狭缝，通过所述狭缝可以装配装置401的一部分(被示意性地示出为尖头)。真空设备407可以被配置为回旋或运动到不同的位置中。例如，在第一配置中，设备407可以被引导朝向废物容器，由此在施加真空409时将废弃产物引导至废物容器。在第二配置中，设备407可以旋转，使得样本或分析物可以例如被引导至分离的分析单元，例如，质谱仪。
[0241]
在一些情况下，台架405可以被配置为使装置401运动。例如，台架可以允许用于使装置401在可以基本平行于装置401的一个或多个通道的方向上平移。在一些情况下，台架405可以允许用于使装置401在一个或多个方向上平移。例如，台架405可以允许用于使装置401在基本平行于装置401的一个或多个通道的方向上以及在基本垂直于或正交于装置401的一个或多个通道的方向上平移。台架405可以被配置为调整装置401的位置，使得装置401可以与下游分析单元(例如，质谱仪)集成。
[0242]
图5提供另一个示例性废物管理系统的示意图。与图4所示的示例类似，废物管理系统可以用于引导废物远离微流体装置501和/或防止液滴芯吸到装置501的另一部分。装置501可以被联接到台架505。在一些情况下，微流体装置501可以被插入盒筒中，所述盒筒可以继而联接到台架505。台架和/或盒筒可以包括管道和附件以流体地和/或电地连接到装置501。废物管理系统可以包括真空设备507。真空设备507可以具有如同圆柱体的形状，并且可以被配置为向装置501的尖端施加真空。在一些情况下，设备507可以被配置为使用适配器(例如，法兰503)附接至装置501的一部分。法兰503可以包括狭缝，通过所述狭缝可以装配装置501的一部分(被示意性地示出为尖头)。真空设备507可以用于施加真空509并且将废弃产物引导至废物容器。例如，真空设备507可以被放置在芯片(例如，使用法兰503接合)和质谱仪之间，并且真空设备507可以包括开口模块，例如，引导废弃产物远离装置501的真空套管511，使得废弃产物不会到达质谱仪。真空509可以被施加到真空设备507并且可以在液滴离开装置501时抽吸液滴。在一些情况下，真空设备507可以是透明的，使得可以使用如本文所述的一个或多个成像系统对电喷雾尖端成像。
[0243]
在另一个实施例中，可以通过模块化装置施加真空，所述模块化装置可以被配置为附接至真空。例如，图6示意性地示出包括夹持模块615的废物管理系统的又一个示例。夹持物可以被固定到装置601，并且真空609可以被施加到夹持装置615，从而引导废弃产物远离微流体装置。在一些情况下，装置601可以被联接到台架605或被插入到盒筒中，所述盒筒可以联接到台架605。在另一个示例中，图7示意性地示出包括管式真空设备707的废物管理系统的又一个示例。管可以被定位在装置701附近，从而引导废弃产物远离微流体装置701。真空709可以被施加到管式真空设备707以引导废弃产物远离微流体装置。在一些情况下，管可以被定位成与装置701基本正交，使得废弃产物可以被引导远离微流体装置而不干扰下游分析单元，例如，质谱仪。装置701可以被联接到台架705或被定位在台架705上。
[0244]
示例5使用正压的废物管理
[0245]
在一些情况下，废物管理模块可以包括使用正压。例如，在图8中，气刀807可以用于引导液滴远离装置801。在这样的示例中，气刀807可以被连接到空气源和/或增压器以产生气压来喷射液滴或引导液滴远离装置801。在一些情况下，该系统还可以包括真空单元(未示出)，所述真空单元可以用于收集被引导远离装置801的液滴。类似于图4至图7，装置801可以被联接到台架805或可以被联接到盒筒，所述盒筒可以联接到台架805。
[0246]
在一些情况下，废物管理模块可以包括雾化单元。例如，雾化器可以被配置为固定到芯片。雾化器可以包括对于将空气朝向芯片引导所必需的几何形状，使得液滴或废弃产物被引导远离电喷雾尖端或出口(例如，到达废物容器)。
[0247]
图9示意性地示出示例性雾化器907，其可以被配置为联接到或固定到装置901。雾化器907可以包括腔室和入口，所述入口可以将空气或氮气引导至雾化器907的内部。雾化器可以另外地包括狭缝以将空气或氮气(例如，经由喷嘴、漏斗等)引导出雾化器。雾化器可以被配置为将空气或氮气朝向装置901的出口引导，并且由此引导废弃产物远离装置901。在一些实施例中，雾化器907可以用于雾化废弃产物。
[0248]
图10a至图10d示意性地示出用于雾化器1007的设计的额外示例。雾化器1007可以被配置为联接到或固定到装置1001。类似于图9，雾化器1007可以包括腔室和入口，所述入口可以将空气或氮气引导至雾化器1007的内部。雾化器可以另外地包括狭缝以将空气或氮气(例如，经由喷嘴、漏斗等)引导出雾化器。雾化器可以被配置为将空气朝向装置1001的出口引导，并且由此引导废弃产物远离装置1001。在一些实施例中，雾化器1007可以用于雾化废弃产物。
[0249]
图11a至图11d示意性地示出又一个示例雾化器1107。雾化器1107可以被配置为联接到或固定到装置1101。类似于图9至图10，雾化器1107可以包括腔室和入口，所述入口可以将空气或氮气引导至雾化器1107的内部。雾化器可以另外地包括狭缝以将空气或氮气(例如，经由喷嘴、漏斗等)引导出雾化器。雾化器可以被配置为将空气朝向装置1101的出口引导，并且由此引导废弃产物远离装置1101。在一些实施例中，雾化器1107可以用于雾化废弃产物。雾化器1107还可以包括诸如螺钉的紧固件1113，以将雾化器1107固定到台架1105，或在某些实施例中固定到盒筒(未示出)。
[0250]
示例6带膜的固定器(电极接口单元)
[0251]
图12示意性地示出固定器1200的示例，例如，本文描述的那些。固定器1200可以被配置为将一个或多个电极与系统的一个或多个部件(例如，微流体装置的一个或多个入口)
接合。电极可以被配置为与多个贮器1203接合，所述多个贮器1203可以经由通过包括装置的阀1205的连接而与装置或盒筒流体和电连通。贮器1203可以包括用于用在分离反应和/或活动化反应中的试剂和/或缓冲液。在一些情况下，固定器1200可以包括一个或多个膜(未示出)，其允许用于电极和微流体装置或盒筒经由通过阀1205的连接而电连通。例如，膜可以被定位在每个贮器1203的底部处，所述膜可以允许用于贮器和电极经由通过阀1205的连接而与装置或盒筒流体和电连通，并且经由通过阀1205的连接减少在贮器和装置或盒筒的接口处形成气泡的发生率。
[0252]
在一些情况下，固定器的几何形状可以被配置为定位膜以与微流体装置建立流体和/或电连通。图13a至图13f示意性地示出包括膜(未示出)的固定器1300的一部分。在图13a中，固定器1300的该部分可以包括插入物，例如，u形结构1305，其可以被连接到贮器1303并且允许与膜和微流体装置(未示出)流体和电连通。固定器1300包括入口流体通道1304，所述入口流体通道1304被流体地联接到出口流体通道1306，所述出口流体通道1306被联接到分离通道(未示出)。入口流体通道1304和出口流体通道1306在平面1308处相交，所述平面1308限定或平行于贮器1303的表面。在平面1308处或邻近平面1308处，可以定位膜(未示出)。膜可以覆盖开口的全部或基本全部，所述开口包括入口流体通道1304和出口流体通道1306的相交部(例如，平面1308)。
[0253]
图13b示意性地示出固定器的可以定位膜的部分的底部的视图。图13c提供包括u形结构1305的插入物的剖视图。插入物的u形结构1305包括入口流体路径1310和出口流体路径1312，其可以促进膜的基本无气泡的润湿。图13d提供固定器的该部分的底部的示意图。膜可以流体地和/或电地连接两个端口1307，所述两个端口1307可以被连接(例如，经由流体入口路径1310和/或流体出口路径1312)到固定器1300的贮器1303。图13e提供u形结构1305的另一个视图。u形结构1305可以包括或被联接到膜1309。可以使用端口1307经由入口流体路径1310和/或出口流体路径1312来与贮器1303和膜1309建立流体和电连通。图13f示出u形结构1305的又一个视图。膜1309可以被联接到或连接到端口1311，所述端口1311可以被连接到通道1315。在一些情况下，通道1315可以包括入口流体通道(在u形结构之前的区域)和出口流体通道(在u形结构之后的区域)，其可以连接到微流体装置或分离通道。该连接可以与贮器(未示出)和通道1315建立流体和电连通。
[0254]
示例7贮器填充
[0255]
图14示意性地示出向本文描述的系统的一个或多个贮器1403提供试剂的示例性方法。可以为固定器(例如，1200和1300)的一部分的贮器1403可以被填充有例如用于分离反应和/或活动化反应的缓冲液或试剂。在一些情况下，会期望的是从贮器的底部填充贮器。试剂和/或缓冲液可以经由入口流体通道1404引入。在一些情况下，贮器1403可以被配置为运动(例如，经由平移)，使得贮器1403可以运动到向上配置、被填充并且继而通过使贮器1403运动回到起始配置来被重新密封。出口流体通道1406可以与装置或分离通道流体地和/或电地连接(例如，经由端口和/或入口或出口流体通道)。
[0256]
在一些情况下，可以使用常规方法填充贮器。图15示意性地示出向一个或多个贮器1503提供试剂的示例性方法。在这样的示例中，移液管(例如，移液管、微型移液管等)1519可以用于将缓冲液或试剂引入到贮器1503中。在一些实施例中例如，贮器1503还可以包括侧端口1521。经由侧端口1521引入缓冲液或试剂可以帮助防止在贮器1503的底部处的
膜的顶部上捕集气泡。
[0257]
示例8盒筒设计
[0258]
图16示意性地示出包括盒筒的示例性系统，如本文的某些实施例中所描述的。盒筒1600可以包括微流体装置1601，其可以包括多个入口端口1602。端口1602可以与端口1623电和流体连通，所述端口1623可以被连接到高电压电源(例如，经由电极连接到高电压电源，所述电极被连接到一个或多个贮器1603)。端口可以与包含试剂或缓冲液(例如，阳极液、阴极液、动员剂和背景电解质)的贮器1603流体和电连通。可以使用阀1625控制来自贮器1603的试剂或缓冲液的流动。在一些情况下，一个或多个贮器1603也可以被连接到限流器1627(例如，长管道)，这可以稳定流动速率和/或从贮器1603到阀1625到端口1623的流动分布。每个贮器1603都可以包括不同的试剂或缓冲液；例如，一个贮器可以包含阳极液缓冲液，另一个贮器可以包含阴极液缓冲液，并且又一个贮器可以包含活动化缓冲液。盒筒1600或装置1601也可以被连接到样本线，所述样本线可以用于将样本经由阀1625供应到盒筒1600或装置1601。
[0259]
图17至图20示出盒筒的示例性实施例。在图17中，盒筒1700可以包括：贮器1703，其可以被联接到膜1709；管1711；和塞子1713，其可以密封贮器并且包括例如用于插入电极或用于填充贮器的孔。盒筒1700可以另外地包括通道1718，其用于插入样本和/或注射样本。装置1701可以使用桩特征部1715被固定到盒筒1700。图18示出盒筒的另一个示例。适配器1817可以被联接到盒筒，以便容易地填充贮器1803。图19a至图19b示出包括阀的盒筒的又一个示例。在图19a中，旋塞阀1921可以与每个贮器1903集成，这可以允许用于流动速率控制。在图19b中，滑阀1923可以与每个贮器1903集成。图20示出盒筒的又一个示例性实施例。装置2001可以被固定到盒筒2000并且经由若干端口2002和/或入口流体通道或出口流体通道流体地和/或电地连接到贮器(未示出)和/或样本。流体连接可以使用垫圈2030或o型环固定。
[0260]
图21示意性地示出可以用于将装置固定到盒筒的固定特征部的示例。盒筒2100可以包括螺钉2129，所述螺钉2129可以用于将装置2101紧固到盒筒2100。盒筒2100可以包括一个、两个、三个或更多个螺钉2129。在一些情况下，可以使用尼龙头螺钉。在一些情况下，可以在螺钉2129和装置2101之间添加压力板(例如，垫圈)，这可以帮助均匀地分布应力并且防止装置2101或盒筒2100的应力集中。
[0261]
图22示出可以用于产生盒筒对装置的流体密封的固定特征部的示例性示意图。盒筒2200可以包括螺钉2229，所述螺钉2229可以用于将装置2201紧固到盒筒2200。盒筒2200可以包括一个、两个、三个或更多个螺钉2229。在一些情况下，盒筒2200可以包括垫圈2231。垫圈2231可以与装置2201接合并且围绕装置2201的入口或出口端口2202形成密封。在一些实施例中，入口或出口端口2202可以使用o型环固定到盒筒2200。
[0262]
图23示意性地示出一个或多个贮器与装置的电连接。电极2333可以包括铂丝，并且可以使用例如粘合剂或其它紧固机构被固定在适当位置中，如本文其它地方所描述的。电极2333可以与贮器2303接触，从而与贮器建立电连通，所述贮器可以与微流体装置接触，如本文所描述的。
[0263]
图24示意性地示出仪器与盒筒的联接。盒筒2400可以被联接到仪器，所述仪器可以用于将试剂经由流体通道2435提供到盒筒的贮器。
[0264]
图25至图27示出具有不同的贮器结构的额外的示例性盒筒。图25示出其中盒筒包括多个长圆形贮器2503的实施例。图26示出其中盒筒包括长圆形贮器2603的实施例。贮器2603可以以一定角度歪斜，使得贮器2603被定位成远离装置2601的出口或尖端足够远。装置2601可以使用膜2609被连接到高电压贮器2605。在一些情况下，膜2609可以被机械地加压在高电压贮器2605和装置2601之间。在一些情况下，装置2601可以使用垫圈被密封到一个或多个流体通道2631。图27示出其中盒筒包括附加的歧管单元2735的实施例。歧管单元可以包括贮器2703。歧管单元2735可以使用本文描述的紧固机构(例如，螺钉和螺纹)被联接到盒筒。
[0265]
如本文所描述的，盒筒可以包括贮器、试剂、膜、阀、固定装置或特征部(例如，螺钉、销(例如，弹簧针)、粘合剂、杠杆、开关、凹槽、形状配合对、钩和圈、闩锁、螺纹、夹子、夹持物、插脚、环、橡皮筋、铆钉、索环、系结、按扣、胶带、真空、密封件)、垫圈、o型环、电极或它们的组合。盒筒可以是整体构建的或者可以是模块化的并且包括可去除的零件。例如，微流体装置可以被配置为可去除地联接到盒筒。类似地，贮器、膜、阀等均可以是可从盒筒去除的。在一个或多个部件可以是可去除的情况下，盒筒可以被配置为使得各个部件中的每个都可以通过使用者在足够的容差下对准就位。例如，盒筒可以包括凹槽和销，使得微流体装置可以通过使该装置一直沿着盒筒滑动到盒筒到达用于对准的销为止来集成。在一些情况下，该装置可以被配置为与盒筒或其一部分齐平定位。在一些情况下，该装置可以定位到盒筒中，使得一个或多个入口、出口等可以被连接(例如，流体地和/或电地)到贮器、电极、膜和/或其它有用的接口单元。在一些情况下，装置和贮器、电极等的接合可以由使用者在没有任何附加测量或调整的情况下执行。例如，贮器可以被配置为接收电极，所述电极咬合到位或经由弹簧针固定，从而建立电连通和/或流体连通。将应理解，盒筒和装置的这些示例性配置并不意味着限制性的，并且定位微流体装置或盒筒的其它部件的许多不同配置可以被实现。
[0266]
示例9成像系统
[0267]
图28a至图28d示出本文所公开的示例性成像系统的不同透视图。该成像系统可以用于全通道成像或全装置成像或装置的多个通道的成像。在一些情况下，该装置可以被固定到盒筒2800。盒筒可以包括透明的部分。在一些情况下，盒筒2800可以被定位在照明源例如uv照明器2850附近。可以使用uv照明器2850来照明该装置，并且可以经由检测器2857例如照相机来收集光。在一些情况下，可以使用镜2855例如转向镜将光引导至检测器2857。成像系统还可以包括第二检测器2859，其可以包括可以用于对电喷雾成像的照相机。在一些情况下，成像系统可以包括照明环2861。该装置可以被配置为将样本或分析物经由电喷雾离子化而引导至下游分析单元，例如，质谱仪，如本文所描述的。
[0268]
示例10系统配置
[0269]
图29至图31示意性地示出本文描述的系统的示例。图29示出被配置为执行本文描述的一个或多个反应的仪器的示例，例如，经由等电聚焦的分析物的分离、分析物峰的活动化和经由质谱的下游分析。在某些实施例中，该系统可以包括自动取样器2901，所述自动取样器2901可以用于处理和/或检测样本，所述样本可以位于分离单元2903中，所述分离单元2903可以包括用于等电聚焦、活动化等的装置。该系统可以包括顺应机构2905和下游分析单元2907，所述顺应机构2905可以帮助分离单元2903中的装置接合。在一些情况下，下游分
析单元2907是质谱仪。在一些情况下，该系统可以位于机动提升臂2909上，所述机动提升臂2909可以用于使本文描述的任何部件运动。例如，提升臂2909可以用于提升和降低自动取样器2901、分离单元2903、顺应机构2905和/或分析单元2907(例如，质谱仪接口板)。
[0270]
图30示出被配置为执行本文描述的一个或多个反应的仪器的另一个示例，例如，经由等电聚焦的分析物的分离、分析物峰的活动化和经由质谱的下游分析。类似于图29的系统，该系统可以包括自动取样器3001，所述自动取样器3001可以用于处理和/或检测样本，所述样本可以位于分离单元3003中，所述分离单元3003可以包括用于等电聚焦、活动化等的装置。该系统可以包括顺应机构3005和下游分析单元3007，所述顺应机构3005可以帮助分离单元3003中的装置接合。在一些情况下，下游分析单元3007是质谱仪。在一些情况下，该系统可以位于机动提升臂3009上，所述机动提升臂3009可以用于使本文描述的任何部件运动。例如，提升臂3009可以用于提升和降低自动取样器3001、分离单元3003、顺应机构3005和/或分析单元3007(例如，质谱仪接口板)。在一些情况下，该系统还可以包括一个或多个计算机或计算机处理器3011。
[0271]
图31示出被配置为执行本文描述的一个或多个反应的仪器的示例，例如，经由等电聚焦的分析物的分离、分析物峰的活动化和经由质谱的下游分析。在某些实施例中，该系统可以包括自动取样器3101，所述自动取样器3101可以用于处理和/或检测样本，所述样本可以位于分离单元3103中，所述分离单元3103可以包括用于等电聚焦、活动化等的装置。第二系统可以与该系统相邻地布置或离该系统较远地布置，并且可以包括分离单元3103、可以帮助分离单元3103中的装置接合的顺应机构3105和下游分析单元3107。在一些情况下，下游分析单元3107是质谱仪。在一些情况下，该系统还可以包括一个或多个计算机或计算机处理器3111，其可以被联接到自动取样器3101。
[0272]
实施例11-淌度色谱图
[0273]
图32a至图32b示出活动化反应和淌度色谱图的示例性数据。全通道成像可以在包含蛋白异构体的样本的分离(例如，经由等电聚焦)期间执行。例如，生物治疗剂(例如，抗体治疗剂)可以使用等电聚焦沿着ph梯度(例如，ph 5梯度至ph 10.5梯度)分离。在分离反应之后，可以执行活动化反应(例如，将分离的分析物引导至诸如质谱仪的下游分析单元)。活动化反应的全通道成像可以随时间执行，并且每个图像的一部分都可以用于生成色谱图。图32a示出作为沿通道的像素数(或距离)的函数的、装置的通道的吸光度测量。每个像素都对应于沿着分离通道的长度的约25微米。图32b示出通过绘制作为时间的函数的、图32a的图像或吸光度图的3像素宽的段3205的吸光度测量值(例如，平均吸光度)而生成的示例性淌度色谱图。在这样的示例中，绘制3像素宽的段3205可以起到点检测器的功能，从而产生关于作为时间的函数的分析物峰的活动的信息，并且允许用于更好地对应和/或验证从下游分析单元(例如，质谱仪)获得的数据。
[0274]
示例12计算机系统
[0275]
图33示出示例性软件架构系统。软件架构系统可以与本文公开的系统集成并且可以包括一个或多个计算机处理器。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被配置为收集和/或分析数据。软件架构系统可以包括计算机处理单元，所述计算机处理单元包括控制器服务，所述控制器服务可以与先进先出(fifo)数据库通信。在一些情况下，fifo数据库可以与第二计算机处理器通信，所述第二计算机处理器可以包括图形用户界面和服务器数
据库。第二计算机处理器可以例如经由云与客户数据库通信。在一些情况下，计算机处理单元可以与系统的一个或多个硬件单元通信(例如，经由有线或无线连接)。例如，计算机处理单元可以经由usb集线器连接到台架、一个或多个照相机、高电压电源、自动取样器、流量控制系统(例如，用于微流体流量控制的软件和硬件，例如，fluigent inc.)和/或其它实验室装备。
[0276]
示例13集成系统
[0277]
图34示出集成系统的示例性框图。集成系统可以包括本文公开的一个或多个系统。该系统可以包括接口盒筒3407，所述接口盒筒3407可以与多个贮器3403流体和/或电连通。例如，接口盒筒3407可以被连接到阳极液贮器、阴极液贮器、动员剂贮器和自动取样器单元。可替代地或除此之外，接口盒筒3407可以与压力控制歧管3405流体和/或电连通，所述压力控制歧管3405可以被联接到流体驱动机构，例如，泵。接口盒筒3407可以被联接到盒筒3400，所述盒筒3400可以包括装置3401。装置3401可以与阳极液高电压贮器、阴极液高电压贮器、动员剂高电压贮器和样本线电和/或流体连通。阳极液高电压贮器、阴极液高电压贮器、动员剂高电压贮器和样本线可以各自与接口盒筒3407流体和/或电连通。装置3401也可以被联接到废物管理单元3409，所述废物管理单元3409可以用于引导废物离开装置3401，并且在一些情况下，还用于将样本引导至下游分析单元3411。在一些实施例中，废物管理单元3409可以包括雾化器。在一些情况下，下游分析单元3411可以包括质谱仪。
[0278]
该系统还可以包括多个成像系统。例如，该系统可以包括成像系统3415，所述成像系统3415可以包括照相机、照明器、废物容器和/或适配器，所述适配器可以用于与分析单元3411接合。该系统还可以包括成像系统3417，所述成像系统3417可以包括照明器(例如，uv照明源)、镜和/或照相机或其它合适的检测器。在一些情况下，检测器(例如，照相机)可以被连接到冷却源，例如，风扇或其它温度控制平台。
[0279]
图35示出集成系统的示例性框图。该系统可以包括：样本3501、样本和试剂保持器和/或处理器3503，其可以被配置为存储样本和处理样本(例如，混合、添加试剂、抽吸或分配样本等)；样本注射器3505；和样本尖端清洁器3507。样本尖端清洁器可以包括用于清洗样本和/或系统的机构。该系统还可以包括分离单元3509，所述分离单元3509可以包括包含该装置的盒筒、成像系统(例如，uv照明器和照相机)。分离单元可以被联接到多个控制器3511，所述多个控制器3511可以包括使用负压(例如，真空)或正压(例如，旋转或隔膜泵、阀等)的流体控制。控制器3511和/或分离单元3509可以被联接到流体歧管3513，所述流体歧管3513可以包括一个或多个包含试剂的贮器。
[0280]
分离单元3509可以用于执行分离反应(例如，等电聚焦)和/或活动化反应。分离单元3509可以被连接到或被联接到通信接口3515(例如，rfid)、高电压电源3517、废物管理单元3519(例如，真空和废物容器)、另一个成像单元3521和/或下游分析单元3523(例如，质谱仪)。在一些情况下，分离单元3509可以被联接到温度控制单元3525。在一些情况下，本文描述的一个或多个系统可以包括温度控制单元3527和/或其它控制单元，例如，用于仪器控制3529。
[0281]
示例14在分析物峰离开微流体芯片而进入质谱仪时的分析物的跟踪速度
[0282]
在图1b所示的装置中的微流体通道网络100是在250微米厚的不透明环烯烃聚合物层中制造的。通道112的深度为250微米，所以通道112一直穿过250微米的层。所有其它通
道的深度为50微米。通道层被夹在两个透明环烯烃聚合物层之间，以制造平面微流体装置。端口102、104、106、108和110提供对通道网络的接近，用于从外部贮器和电接触引入试剂。端口102被连接到真空源，允许通道103充当废物通道，从而能够通过通道网络灌注其它试剂以“浪费”。酸(例如，1％的甲酸)通过端口108灌注到通道109、112、114和103并且排出端口102。样本(例如，在4％的pharmalyte3-10中稀释的肽或蛋白质，12.5mm的pi标准物3.38(纯化肽，序列：trp-asp-asp-asp)，12.5mm的pi标准物10.17(纯化肽，序列：trp-tyr-lys-arg))通过端口106灌注到通道107、112，114和103中并且排出到端口102。这留下了包含样本分析物的通道112。碱(例如，1％的二甲胺)通过端口104灌注到通道105、114和103中并且排出到端口102。动员剂(例如，1％的甲酸、49％的甲醇)通过端口110灌注到通道111、114和103中并且从通道103排出到端口102。
[0283]
通道112中的分析物样本的电泳通过向端口108施加4000v并且将端口110接地来执行。分析物样本中的两性电解质建立跨越通道112的ph梯度。使用对准到通道112的280nm的光源并且用ccd照相机测量穿过通道112的280nm的光的透射来执行分离的吸光度成像。软件通过将在分离或活动化期间的光透射与在分析物运行之前在没有聚焦的分析物的情况下采取的“空白”参考测量值进行比较来计算吸光度，并且继而显示通道112的长度上的每个像素的吸光度。由标准物或已经聚焦的分析物的所在之处被显示为源自图像数据的吸光度迹线中的峰值。
[0284]
一旦已经完成对分析物的聚焦，就捕获最终聚焦的吸光度图像。软件将识别pi标记的空间位置并且插入标记之间以计算聚焦的分析物级分峰的pi。此时，控制软件将触发继电器以断开端口110处的接地并且将端口104接地，以及在连接到端口104的动员剂贮器上设置压力，以建立通过端口104流入通道105和114中并且在孔口116处流出芯片的100nl/min的动员剂溶液的流动。在入口电压为-3500v至-4500v的情况下，孔口116被定位在远离质谱仪esi入口2mm处。
[0285]
虽然压力驱动流动将动员剂从端口104引导至孔口116，但是在动员剂试剂中的一些甲酸将以甲酸盐的形式从通道105通过通道112电泳至在端口108处的阳极。随着甲酸盐行进穿过通道112，甲酸将破坏等电ph梯度，促使两性电解质、标准物和分析物样本增加电荷和以电泳方式从通道112迁移出到通道114中，其中来自端口110的压力驱动流动将携带它们进入从孔口116出来的esi喷雾中。
[0286]
当发生活动化时，软件继续捕获吸光度图像并且识别峰，跟踪它们的从成像通道112迁移出到通道114中的迁移。通过跟踪由每个峰离开成像通道112的时间、其速度以及在通道114中的流动速率，软件可以计算由峰横穿通道114并且经由孔口116引入质谱仪中的时间，从而允许原始聚焦的峰与所得的质谱之间的直接关联。
[0287]
示例15用于电喷雾和样本处理的微流体装置
[0288]
图2提供用于执行一个或多个分离反应(例如，等电聚焦反应)的微流体装置的一个非限制性示例的示意性自上而下的视图。该装置包括基底201，其中使用例如压印、激光微加工或光刻和湿法化学蚀刻来制造测量为210微米的宽度和100微米的深度的流体通道。可以通过将基底201粘合到透明盖玻片(未示出)来密封流体通道。在一些情况下，例如，在uv吸光度成像用于监测分离和/或活动化反应的情况下，基底201可以由光学透明材料制造。在一些情况下，例如，在使用落射荧光成像来监测分离和/或活动化反应的情况下，基底
201可以由光学不透明材料制造。
[0289]
通过样本入口端口207提供对该装置内的流体通道的接近，所述样本入口端口207可以位于芯片的侧上。芯片还可以包括阳极凹孔206、阴极凹孔204、样本出口端口203和化学动员剂入口端口209。一个阳极凹孔206和阴极凹孔204分别与分离通道205的近侧端部和远侧端部流体和电连通。化学动员剂入口端口209经由化学活动化通道被连接到分离通道205的远侧端部。
[0290]
为了用于执行多个等电聚焦反应以分离蛋白质混合物，蛋白质样本与两性电解质ph梯度和pi标记预混合，并且继而被放入小瓶中和加载到自动取样器上。样本由自动取样器经由样本入口端口207被逐次地加载到装置中，通过分离通道205被加载到微流体装置上，并且通过样本出口端口203排出装置以浪费。
[0291]
将阴极液流体(例如，在h2o中的1％n4oh)加载到阴极凹孔204中，将阳极液(例如，10mm的h3po4)加载到阳极凹孔206中，并且将动员剂溶液(例如，49％的mecn，49％的h2o，1％的甲酸)连接到动员剂入口端口209。膜(未示出)可以与任何阳极凹孔或阴极凹孔(206和204)接合，以提供装置与电极的电和流体连通。在3中示出样本出口或esi尖端203的等距示意图。
[0292]
参照图2，在加载所有试剂之后，通过将电极连接到阳极凹孔206和阴极凹孔204而将例如+600v/cm的电场从一个或多个阳极凹孔孔206施加到相对应的阴极凹孔204来发起等电聚焦。如上所述，施加到每个分离通道205的电压和/或电流可以被独立控制并且也可以作为时间的函数被记录。在一些情况下，用于阳极和阴极的电极可以与装置集成。对于uv吸收度成像，由uv光源提供的准直光束与分离通道205对准，并且图像传感器(例如，ccd照相机或cmos照相机)被放置在分离通道205的另一侧上以测量通过每个分离通道205透射的光量，由此借助于聚焦的蛋白质(或其它分离的分析物)的吸光度来对它们成像和检测。在一些情况下，聚焦的蛋白质可以是未标识的，并且通过在220nm、280nm或将供蛋白质吸光的任何其它波长下的天然吸光度来检测。对于荧光成像，即，落射荧光成像，借助于包括合适的二向色反射器和带通滤光片的光学组件将合适波长的激发光传送到分离通道205，并且通过相同的光学组件从分离通道205收集发射的荧光，并且将发射的荧光成像到图像传感器上。在一些情况下，可以使用天然荧光对聚焦的蛋白质(或其它分离的分析物)成像和检测。在一些情况下，可以使用非共价结合的荧光标签、显色标签、发荧光标签或发色团标签(例如，红宝石、考马斯亮蓝和类似物)来检测聚焦的蛋白质。在一些情况下，装置的多个部分可以由光学不透明的材料构造，使得光可以仅通过分离通道205传输，由此阻止任何杂散光在没有通过分离通道105的情况下到达图像传感器并且增加uv吸光度测量的灵敏度。
[0293]
随着在多个分离通道205中执行等电聚焦反应，可以连续地和/或周期性地捕获分离通道205的全部或部分中的聚焦蛋白质的图像。在一些情况下，分离通道205的图像中的pi标记的位置检测可以用于确定作为沿着分离通道的位置的函数的局部ph，并且通过外推法针对分离的蛋白质(或其它分析物)进行更准确的pi的确定。在一些情况下，当聚焦完成时，在样本入口端口207和/或阳极凹孔206处施加正压，以使分离的蛋白质(或其它分析物)混合物朝向样本出口203活动。在一些情况下，当聚焦完成时，连接到阴极凹孔204的电极被断开，并且与动员剂通道208电连通的电极用于将600v/cm的电场从阳极凹孔206施加到化
学动员剂入口209以将动员剂电泳式地引入到分离通道205中。在一些情况下，代替化学动员剂的电泳引入或除了化学动员剂的电泳引入以外，可以使用施加到动员剂入口209的轻微正压。
[0294]
在电泳引入动员剂的情况下，动员剂溶液中的甲酸通过电场被吸引到分离通道205中，在分离通道205中甲酸使蛋白质和两性电解质离子化并且破坏用于等电聚焦的ph梯度。富集的蛋白质级分的离子化促使它们迁移出分离通道205。在活动化过程期间对分离通道205的继续成像可以用于对用于每个分离的蛋白质的pi的确定细化。
[0295]
随着蛋白质级分和两性电解质经过阴极凹孔204迁移出分离通道205，蛋白质级分和两性电解质在相交部210处与来自通道208的动员剂混合(参见图38)。动员剂以限定的流动速率(例如，7.5nl/s)被输送到样本出口203，并且在通道208中的该流动速率对应于线速度(例如，1.4mm/s)。随着富集的蛋白质级分和两性电解质在动员剂中混合，新的环境(试剂)促使它们的电泳淌度发生变化。这针对两性电解质和蛋白质级分朝向与动员剂通道208电连通的电极(即，在与朝向尖端的动员剂线速度的方向相反的方向上)产生了线性电泳速度。在一些情况下，芯片网络被设计为使得富集的蛋白质级分的电泳速度将小于动员剂流动速度，使得富集的蛋白质级分迁移出样本出口(电喷雾尖端)203而进入电喷雾中并且进入质谱仪中以用于检测。在一些实施例中，芯片网络被设计为使得两性电解质中的一些或全部的电泳速度大于动员剂线速度，使得两性电解质中的一些或全部朝向与动员剂通道208电连通的电极迁移并且未被引入到尖端203。在一些情况下，以这种方式稀释两性电解质浓度以减少电喷雾中的可离子化材料的量，这可以促使富集的蛋白质级分的离子化得以改善。在一些情况下，通道网络可以被设计为使富集的蛋白质级分引入到电喷雾中最大化并且使其它样本组分引入到电喷雾中最小化。在一些情况下，通道网络可以被设计为使富集的蛋白质级分引入到电喷雾中最大化并且使两性电解质引入到电喷雾中最小化。
[0296]
例如，nist单克隆抗体(nist mab)标准物(pn 8671，nist参考材料)在49％的水、1％的甲酸、50％的mecn动员剂中的电泳淌度已经被测量为1.5
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10-4
cm2/vs。在强度为675v/cm的电场中，这将引起朝向与动员剂通道208电连接的电极的线速度(1.5
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10-4
cm2/vs)
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(675v/cm)＝1.0
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10-1
cm/s，或者，1mm/s。在该示例中，如果动员剂通道208被蚀刻到50微米的深度
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110微米的宽度，则通道208将具有5.5nl/mm的容积，所以7.5nl/s的动员剂流动速率将对应于1.4mm/s的线性流动速率。这将克服1mm/s的nist mab电泳速度，并且nist mab将通过样本出口203离开芯片到电喷雾中。
[0297]
pharmalyte品牌的两性电解质梯度ph 8-10.5已经被测量为在动员剂中具有平均为2.7
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10-4
cm2/vs的电泳淌度，其对应于在我们的示例性675v/cm电场中的1.8mm/s的平均线速度。在示例中，通道208如上所述具有50微米的深度和110微米的宽度，这将克服动员剂的1.4mm/s的线速度，并且两性电解质中的大部分将朝向与动员剂通道208电连通的电极迁移，并且不通过电喷雾尖端203离开芯片，从而减少会干扰电喷雾中的富集的蛋白质级分的离子化的两性电解质的量。