专利名称：血液组分的深低温保藏和复苏改进的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及保存血液和血液组份，更具体地，本发明涉及一种在冷冻前向红细胞里添加深低温保藏液以及使用前将其从红细胞中洗去的改进系统。
背景技术：
人的血液主要包括三种特化细胞红细胞、白细胞和血小板。这些细胞悬浮在一种被称为血浆的蛋白质及其他化学物质混合物水溶液中。在过去，输血一直使用全血，但当前倾向于对特殊病人仅收集和输送他所需要的那些血液组份。这种方法能保存有效的血液供应，在多数情况下对病人有利，因为病人不接触不需要的血液组份。
血液组份一般从供血者采集的全血中获得。一种一次性使用的由器具(例如输液管和接头)、采血针和一个或多个收集袋组成的血液采集装置，用于从供血者采集全血。详细地说，将采血针扎入供血者的手臂，血液在重力的作用下流入装有抗凝剂的收集袋里。随后，用血液处理器将全血分成一种或多种要求的组份。血液处理器包括旋转的分离室，它使全血多次受到重力的作用，从而根据密度将各种血液组份分开。即密度大的组份如红细胞(RBCs)聚集在分离室里的外周，而密度小的组份通过一个出口流出。当分离过程完成后，分离室里的RBCs被移去。血液组份也可以通过单采血液成分术(apheresis)获得，来自供血者的全血直接提供给血液处理器进行分离和收集。对于这种方法，任何未收集的血液组份都可直接回输给供血者。
收集的血液组份在回输给供血者或输给其他病人之前可以保存。例如，单个的血液组份如RBCs可以在4℃左右冷藏数天。还有其它方法冷冻RBCs来进一步延长它们的储存时间。例如，根据RBCs的制备方法，RBCs能在-80℃或-160℃左右深低温保藏数年。
具体地说，RBCs通常与甘油一起保存，甘油在冷冻之前穿过细胞膜。没有甘油，RBCs在冷冻过程中不能存活。授予Valeti的名称为用于储存和处理血液的设备及方法的美国专利No.33,924中公开了一种保存和处理血液的方法和设备，在冷冻前使RBCs甘油化及输血前从融化的RBCs洗去甘油。尤其是在盛RBCs的袋子里分三步加入甘油。首先，将RBCs袋放在摇床上，以每分钟约180次的速度进行摇动，50ml的甘油溶液依靠重力加入袋中。将摇床关闭约5分钟，使RBCs和甘油达到平衡。下一步，打开摇床，再向袋中加入约50ml的甘油溶液。再次关闭摇床使RBCs和甘油溶液平衡约两分钟。然后将袋子从摇床上取下，操作员一边手工摇动袋子一边再加入约400ml的甘油溶液。
将袋子放在一种袋子离心装置上来浓缩甘油化的RBCs。结果袋子里含有浓缩的、甘油化的RBCs和上清甘油溶液。为了除去上清，将袋子置于血浆提取器里。然后将其封存于外包装纸的袋子里，放在-80℃冰箱里保存。正如‘924专利里注释的，整个处理过程必须在4小时内完成，获得的甘油化的RBCs有约60％的血细胞比容。
因此，现有技术的甘油化处理过程是费时、费力的工作。而且需要技术熟练的操作人员以确保甘油溶液在适当的时间有适合的量。不适当的给予甘油渗透压(osmolite)可能损伤RBCs。特别是，如果加入甘油的速度过快，RBCs将受到摩尔渗透压浓度的休克，而导致细胞损伤。
现有技术的在输血前洗涤融化的、冷冻保存的RBCs的方法很显然也是费时、费力的工作。更具体地，如‘924专利所描述的，将冷冻的RBCs袋子放在热水浴中20-25分钟融化RBCs。应用一种仪器，如Haemonetics Corp．的115型，包括摇床、离心装置和洗涤滚筒。首先，50ml 12％氯化钠溶液依靠重力流入袋里，通过摇床的摇动与融化的RBCs混合。关闭摇床两分钟使两种溶液达到平衡。然后再次，打开摇床，向袋子里加入100ml的0.9％氯化钠和0.2％葡萄糖溶液，摇动混合。然后关闭摇床约两分钟让溶液平衡。再次打开摇床，向袋子里加入150ml氯化钠/葡萄糖溶液。关闭摇床两分钟。对于甘油溶液，向融化的RBCs里加入每种体积的洗涤溶液也是一个必须谨慎处理的过程。特别是，洗涤溶液也是一种渗透压(osmolite)，如果加入过快可能导致RBCs细胞膜的破裂。
离心袋子里的内容物以除去洗涤溶液和甘油，将得到的RBCs转移到收集袋里。在输液前，洗涤后的RBCs通过离心进行浓缩并除去上清。最终的RBCs的血细胞比容低于40％。
如同‘924专利介绍的，RBCs对摩尔渗透压浓度休克敏感而需要重复、详细的步骤。不但在冷冻保藏时制备RBCs，而且在输血前复苏保藏的RBCs时都必须手工操作，以避免渗透压浓度的突然改变。这是一种昂贵的方法，限制了冷藏方法的使用，而且大量需要及时的血液采集。此外，由于化学物质和其他关系，商业上可买到的甘油溶液一般装在橡胶塞的玻璃瓶中，而不是有管子连接的塑料袋。为了获得这种甘油，必须使用针或刺，从而产生了一个开放系统，即潜在的污染空气和其他的杂质可能进入这个系统。此外，由于甘油的粘度高，不能依靠重力通过灭菌后的滤膜。所以，任何进入这个系统的污染物都可能接触到RBCs。尽管这不影响RBCs的冷冻保藏时间，但是它要求融化的红细胞必须在24小时内使用，否则只能废弃。
发明概述本发明的目的是提供一种制备冷冻保藏红细胞的改进方法。
本发明的另一个目的是提供一种快速释放深低温保藏液到红细胞而不引起摩尔渗透压浓度休克的改进方法。
本发明的再一个目的是快速洗涤融化的红细胞而不引起摩尔渗透压浓度休克的改进方法。
简要地说，本发明涉及一种释放深低温保藏液到红细胞以便长期冷冻保藏和在红细胞复苏过程中除去深低温保藏液的系统。这个系统优选包括连接着摇床、离心装置和一个或几个速度可选的泵的控制器。显示器、打印机和输入设备也与控制器相连。深低温保藏装置用于将深低温保藏液运送到浓缩的红细胞的装置，它可以放在摇床上。控制器经过泵监测和控制深低温保藏液向红细胞的运送。尤其是，控制器定期地测定已经添加到红细胞的深低温保藏液的量，在此基础上，依据新的计算方法计算深低温保藏液的流速。这个计算方法提供了红细胞的摩尔渗透压浓度线性增加，用来选择降低休克的危险性和使处理时间最短。经过动态地调整泵的速度，控制器在整个深低温保藏处理过程中以计算所得流速运送深低温保藏液。
在复苏过程中，一种包括分离室和洗涤液的复苏装置，相似地安装在这个系统上。融化的红细胞优选地放在摇床上，通过两个泵不但与洗涤液相连而且与分离室相连。为了复苏红细胞，控制器监测和控制用于稀释红细胞的第一个体积洗涤液的运送。特别是，控制器依据第二个计算方法动态地调整稀释体积的洗涤液向红细胞运输的速度。第二个计算方法也是依据已释放的洗涤液的计算体积来提供红细胞摩尔渗透压浓度线性降低，以选择缩短稀释时间和减少休克的发生。通过动态地调整两个泵的速度，控制器在整个稀释过程中以计算出的流速运送洗涤液。红细胞在稀释后被转移至分离室，为了从红细胞洗去任何残留的深低温保藏试剂，可在分离室里另外加入洗涤液。
在优选实施方案中，深低温保藏液在接触红细胞之前优选地通过除菌的滤膜。通过过滤深低温保藏液除去潜在的污染物，使复苏后红细胞的储存时间显著延长。此外，在复苏过程中，在加入洗涤液之前复苏的红细胞首先用一定体积的高渗溶液稀释。高渗溶液有与融化的红细胞相近的摩尔渗透压浓度，进一步降低了休克的危险性。而且，额外的洗涤循环有利于除去在复苏过程中不能存活的衰弱细胞分解产生的碎片和将洗涤后的红细胞悬浮在保存液里，以便使它的储存时间更长。而且，深低温保藏和复苏过程中的每个步骤都在系统控制器的管理下自动执行，显著地减少误差和缩短整个处理时间。
附图简述本发明的上述和进一步的优点可以通过下面结合附图的描述得到更好的理解。
图1本发明中制备深低温保藏红细胞的改良系统的框图；图2A-B深低温保藏红细胞优选方法的流程图；图3是图1改良系统上复苏深低温保藏后红细胞的框图；以及图4A-D复苏上面深低温保藏红细胞优选方法的流程图。
发明详述图1是本发明中改进的深低温保藏/复苏系统100的框图。系统100由一个控制器102、一个摇床104、第一个泵106、一个离心驱动装置108和第二个泵110组成。离心驱动装置108有一个分离室，它与下面描述的洗涤红细胞有关。控制器102可操作与摇床104、两个泵106,110和离心驱动装置108连接，也可以与多个输入/输出设备连接。例如，控制器102优选可以与显示器112连接，将信息呈递给系统操作员；又可以与打印机114相连，打印报告和其他信息。系统操作员通过输入设备116(例如键盘和/或鼠标)将命令输入控制器102。泵106和泵110、离心驱动装置108、显示器112、输入装置116和控制器102都被安装在机箱118里。
在优选实施方案中，控制器102由一个或多个中央处理器(CPU)和有关的存储器组成，它装有象下面描述的执行本发明的各个步骤的可执行的软件指令。泵106和泵108优选都是双向蠕动泵，每个循环可供给约1ml的液体。每个泵106、108都含有一个光学空气监测器(未显示)来确定在与泵相连的管道中是否存在空气。本发明中适当的组成部分与Haemonetics公司的移动收集系统(MCS)No.8150的组成部分相似。
红细胞的深低温保藏首先，从供血者采集约450ml的全血，装在含有抗凝剂的原始袋中。应当理解采集全血的实际体积和其血细胞比容的水平由深低温保藏后复苏过程中使用的分离室的大小来决定。全血可以按常规方式在4℃左右保存。其次，用常规方法离心全血，使红细胞与其他血液组份分离。例如，全血以1615倍的重力离心4分钟来分离红细胞。离心红细胞的装置和程序为本领域中技术熟练的人员所周知，就不在此叙述了。分离的红细胞(RBCs)也可以在4℃左右短期保存。然而，在深低温保藏处理开始之前，RBCs和深低温保藏液优选加热至室温(如22-30℃)。
参考图1，冷冻装置优选安装在系统100上。更具体地，深低温保藏液瓶120通过第一根管线122与第一个泵106相连。常规的针式连接器和滴注室被用于连接管线122和瓶子120，一个可以从关到开状态转换的夹子或气动阀124被固定在管线122上来控制深低温保藏液向第一个泵106的流动。在优选实施方案中，深低温保藏液是按重量计算的浓度为57.1％的甘油溶液，通常保存在500ml的玻璃瓶里。深低温保藏液120被悬挂在与机箱118连接的输血(Ⅳ)架(未显示)上。第二根管线126连接第一个泵106和装红细胞的容器128。容器128包括通过无菌的连接装置(SCD)130与第二根管线126相连的管道部分128a。SCD130是一种象Terumo的312型一样的、使两根管线无菌焊接起来的众所周知的装置。
第二根管线126里安装有压力探针132和除菌滤膜134。滤膜134是优选0.2μm的亲水型滤膜，例如Pall/Gelman Sciences,Inc．高级Ⅳ-3空气净化滤膜。安装在滤膜134和SCD接头130之间的压力探针132将相应的压力信号传递给主控制器108来保证SCD接头不破裂和容器128不被灌注得太满。为确保流经导管126的深低温保藏液无菌，在压力探针132处也使用了0.2μm的亲水性滤膜136。在优选实施方案中，管线122和126都是通过第一个蠕动泵106的单个、连续的管线。
图2A-B是本发明深低温保藏处理步骤200的流程图。如上所述，在低温保藏装置安装到系统100上以后，系统操作员按图202所示将容器128里的RBCs净重和血细胞比容水平记入系统100，按图204所示将容器128放在摇床104上。然后，按图206和图208所示，控制器102计算容器128内RBC浓缩物的体积，并将适当体积的深低温保藏液运送到RBC浓缩物。RBC浓缩物的体积Vi根据下面的公式来确定。
Vi=NWi/[1.1*Hcti/100+1.026*(1-Hcti/100)](1)其中NWi指深低温保藏前浓缩后红细胞的净重(克)和Hcti指深低温保藏前红细胞的血细胞比容水平(％)。
与浓缩红细胞混合的深低温保藏液的总体积Vg按下面的公式来计算。
Vg=Cf/(Ci-Cf)*Vi*(1-Hcti/100+Hcti*W/100)(2)其中Cf指深低温保藏处理过程中浓缩红细胞里深低温保藏试剂的预计浓度(％)，Ci指深低温保藏液里深低温保藏试剂的浓度(％)和W指浓缩红细胞里水的体积百分比(％)。
W、Ci和Cf的数值由操作员通过输入设备116输入系统100，控制器102按常规的相应缺值方式进行预构造。在优选实施方案中，主控制器102按W为72％,CI为57.1％(最通常可得到的甘油的百分比)和Cf为40％(在-80℃保存的浓缩红细胞中甘油的理想浓度)来进行预构造。
其次，操作员按图210所示从瓶子120的滴注室向起始管122中压入起始体积的深低温保藏液。然而，此时阀门124仍保持关闭状态。操作员按图212所示通过输入设备116启动控制器(如按“开始”键)。按图214所示，控制器102启动第一个泵106和摇床104，以3Hz的频率和1.5英寸的双振幅进行工作。如图216所示，第一个泵106以30ml/分钟的起始流速启动。控制器102通过监测相应的空气检测器的空气输出量来检查到达泵106的液体。如图218所示，如果泵工作10ml以后还没检测到液体，控制器102关闭泵106并发送出错信息到显示器112，指示操作员应检查导管122的闭合状况。如图220所示如果检测到液体，控制器102就通过压力探针132监测容器128里压力的增加。
如图222所示，当压力超过100mmHg，控制器102开启阀门124，并根据泵的循环数计算通过泵106运送到容器128的深低温保藏液的体积。如图224所示，在液体检测过程中如果检测到泵出了约5ml的液体后，压力还没有达到100mmHg，控制器102将关闭泵106并发送出错信息到显示器112。出错信息要求操作员检查导管122,126的渗漏情况。假定压力达到适合的水平并开启阀门124，控制器102就开始运送预定体积(Vg)的深低温保藏液给容器128里的红细胞。
由于在57.1％的甘油溶液(例如约7230mOsm/KgH2O)和容器128中浓缩的红细胞(例如约320mOsm/KgH2O)之间存在较大的摩尔渗透压浓度差别，红细胞在深低温保藏过程中极易受到高渗刺激和细胞损伤的影响。也就是，尽管甘油确实通过细胞膜扩散，然而在严格意义上这不是真正的等渗(osmdite),RBCs和甘油溶液之间的高摩尔渗透压浓度差别导致水分从RBCs“泵出”的速度远高于从甘油溶液扩散到细胞内的速度。这样细胞膜受到较大的应激，特别是在处理的开始阶段可能导致细胞的破裂。当越来越多的甘油扩散到红细胞里时，它们的摩尔渗透压浓度上升，从而减少了深低温保藏液的摩尔渗透压浓度差别和后来受刺激的危险。在本领域现有技术中，甘油开始以小的、固定的量加入来限制可能的RBC损伤。然而，这种方法费时、费力并容易出错。
在本发明中，深低温保藏液优选连续地运送到RBCs。特别是，深低温保藏液按红细胞的摩尔渗透压浓度随时间线性增加(例如dOsmolarity/dt=常数)的方式运送。这样，本发明通过利用增加红细胞的摩尔渗透压浓度来增加深低温保藏液运送的速度。而且，通过增加深低温保藏液添加到RBCs里的速度，显著地减少了完成整个处理过程的时间。
尤其是，主控制器102连续地计算深低温保藏液合适的流速和动态地调整泵106的工作速度以达到理想的流速。深低温保藏液的流速Fg按照下面的公式进行计算。
Fg=K[Vi*(W*Hcti/100)+Vg]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Og)](3)其中K指红细胞摩尔渗透压浓度增加的选定速率(mOsm/Kg H2O/min。)，Vi指深低温保藏前红细胞的体积(ml)，Vg指现时流速计算之前已加入到红细胞的深低温保藏液的体积(ml)，Oi指深低温保藏前红细胞的摩尔渗透压浓度(mOsm/Kg H2O)和Og指深低温保藏液的摩尔渗透压浓度(mOsm/Kg H2O)。
既然深低温保藏液的流速是依据已添加到红细胞的深低温保藏液的体积(Vg)来确定，起始流速应由控制器102不同于公式(1)单独来确定。起始流速Fo由下面公式确定。
Fo=K*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Og)(4)此外，在任何假设时间t处理红细胞的深低温保藏液的体积按下面公式计算。
Vg=K*Vi*(1-0.28*Hcti/100)*t/(Oi-Og-K*t)(5)将要求体积的深低温保藏液运送至红细胞所需要的总时间T计算如下。
T=Vg*(Oi-Og)/K/[Vi*(1-0.28*Hcti/100)+Vg](6)主控制器102按以上定义的公式(3)-(6)确定的数值以常规方式进行预构造。应当理解参数K,Oi和Og由操作员输入或在控制器102的存储器里预构造。在优选实施方案中，控制器102按K约为500,Oi为320和Og为7230进行预构造。
如图226所示，控制器102通过设置泵106相应的工作速度以起始流速Fo开始从瓶子120运送深低温保藏液。此后，按图228所示，控制器102用公式(5)连续确定已加入容器128里的深低温保藏液的量Vg。然后，按图230所示，控制器102确定深低温保藏液的计算体积是否等于为获得选定浓度所要求的体积。如果不等，按图232所示，控制器102以公式(3)计算出一个新的流速Fg。然后如图234所示，调整泵106以获得这个新的流速。控制器102将等到以起始流速Fo泵出至少1ml的深低温保藏液后，才进行第一次计算和相应的调整。
在优选实施方案中，控制器102依据执行上述处理过程的软件包来实时地计算新流速Fg的数值和调整泵的速度。根据控制器102的处理器和存储部分的操作特点，每隔约200ms就计算和调整泵的速度。然而，应当理解控制器102可以按任何设定的时间间隔编制计算新流速Fg的程序。也应当理解如果流速的变化基本上小于泵可被调整的最小增量(例如低于1/2ml/min，因为泵可调整的增量是1ml/min)时，泵的速度没有改变。
如框236所示，当前面确定的总体积(Vg)的深低温保藏液被运送到容器128，控制器102就关闭泵106和随后(例如约30秒后)关闭摇床104。容器128的导管部分128a被从导管126切断和被加热封闭。如图238所示，标有浓缩RBCs单位、操作员、捐赠中心、日期、原始血液净重、原始血液的血细胞比容、原始血液体积和加入的深低温保藏液体积，深低温保藏处理所用时间和其他信息的标签由控制器102的打印机114打印出来。将标签贴在容器128上作为鉴定说明。
深低温保藏处理之后，容器128里的液体总体积约为700-800ml，包括约200ml的“纯”RBCs(含有少量的血浆)悬浮在约400-500ml的深低温保藏液里。按图240所示，容器128由系统操作员直接进行袋式离心，按常规方法除去上清深低温保藏液，将剩下的约200ml纯RBCs(总体积约300ml)进行冷冻。袋式离心涉及将容器在高转速下离心，这是本领域中技术熟练人员所周知的，在此不再详细介绍。深低温保藏处理过程完成后，甘油化的RBCs在-80C深低温保藏。
应当理解依据系统100使用的除菌滤膜134的类型，导管126里的压力应保持在特定的限度内。例如，用Pall/Gelman Sciences,Inc.的除菌滤膜，压力应不超过310kN/m2(或45磅/平方英寸)。为保持滤膜134的压力在此限度内，控制器102允许的最大流速应不超过80ml/min。这样，如果由公式(3)计算的深低温保藏液流速要求相应泵的速度超过80ml/min，控制器102也不会超过80ml/min。
本发明提供了一种制备深低温保藏红细胞的改进方法。应当理解除甘油外的其他深低温保藏液如羟乙基淀粉(HES)、二甲基亚砜(DMSO)等也能由本发明使用。应当进一步理解除红细胞外的其他血液组分也可以使用上述的深低温保藏程序。也应当理解可以选用深低温保藏试剂的其他理想浓度Cf在其他温度下保存(如30％，在-160℃保存)。
冷冻红细胞的复苏图3是图示复苏预先冷冻红细胞的系统100的框图。如上所述，系统100包括一个可任选连接到两个泵106和108上的控制器102、离心驱动单元108、振荡平台104、显示器112以及打印机114。操作者可以通过输入装置116把数据及其他信息输入系统100中。为了复苏容器128中预先冷冻的红细胞，优选在系统100上安装一个单独的复苏装置(harness)。具体地，通过一段起始管线150和一个三相接头152，将3个不同的溶液袋144、146和148连接到泵110上。优选在袋144中盛装防腐溶液，例如购自Haemonetics公司的AS-3。优选在袋146中盛装洗液(例如，0.9％氯化钠和0.2％葡萄糖溶液)以及优选在袋148中盛装高渗溶液(例如，12％氯化钠溶液)。袋148中盛装的高渗溶液优选具有与容器128中融化RBCs近乎相等的摩尔渗透压浓度。与袋144、146和148分别相连的是充汽阀门154、156和158，这些阀门可以在开和关两种状态之间切换。
第二段管线160将泵110连接到Y-形接头162上，优选包括一个除菌滤器164，可以是0.22μm的亲水滤膜。第三段管线166包括一个两相阀门168，它连接到泵106的一侧。通过SCD130与阀门168的一个接口相连的是容器128的管口部分128a，而容器128再被放置到振荡平台104上。众所周知，容器128中的红细胞在放上平台104之前优选先在水浴中融化。位于终端用来收集复苏后的RBC的袋170可以预先连接到两-相阀门168的另一接口上。在第三段管线166中插入压力探头132以及与其相连的滤器136。第四段管线172将泵106与Y-形接头162连接。Y-形接头162的出口通过第五段管线174与分离筒178的入口176相连，分离筒178位于离心驱动装置108内。离心筒178的出口180可以通过第六段管线184与废液袋182相连，管线184上装有一充气阀门185。优选在第六段管线184中插入第二个压力探头186以及与其相连的除菌滤器188。优选实施方案中，管线150、160、172和166都是经由相应泵110和106安装的单向连续管线。
分离筒178可以是一个带有分流器和缩短血浆核心(plasma core)的275ml离心容积(spun volume)吹塑筒，与Haemonetics公司生产的275ml吹塑筒系列类似。分流器(未画出)把上述筒体分成2个腔室(一个分离腔和一个洗涤腔)，这样有助于红细胞的洗涤。
用高渗溶液稀释融化的红细胞如果融化的红细胞具有40％深低温保藏液(例如，甘油)浓度，那么融化红细胞的摩尔渗透压浓度应该设定为5200mOsm/KgH2O。常用洗涤溶液的摩尔渗透压浓度(例如0.9％氯化钠/0.2％葡萄糖溶液)大约为300mOsm/KgH2O。复苏过程中，这种高摩尔渗透压浓度差别使红细胞发生低渗休克(即，它们快速出现在水上)以及因而引发的细胞破坏。为了减小低渗休克的危险，优选首先用具有与融化红细胞同一数量级摩尔渗透压浓度的高渗溶液稀释红细胞。通过用高渗溶液稀释融化后的红细胞，一些深低温保藏溶液被从细胞中抽取出来，RBC上清液体积增加，从而减小了复苏过程中RBC低渗休克发生的可能。
加入高渗溶液还可以轻微的减小红细胞摩尔渗透压浓度。更特异地，融化后的红细胞用高渗溶液稀释后，摩尔渗透压浓度Oph可以用下列公式表示。
Oph=(Vt*Ot+Vh*Oh)/(Vt+Vh)(7)其中，Vt是融化后的红细胞的体积(ml),Ot融化后的红细胞的摩尔渗透压浓度(mOsm/KgH2O)，Vh是加入到融化后红细胞中的高渗溶液的体积(ml)，以及Oh是高渗溶液的摩尔渗透压浓度(mOsm/KgH2O)。
优选实施方案中，取摩尔渗透压浓度约4000mOsm/KgH2O的12％氯化钠高渗溶液50ml，用来实现稀释后红细胞的理想摩尔渗透压浓度4800-5300mOsm/KgH2O以及理想的上清缓冲溶液体积。因此，复苏过程第一步中的一项操作就是将约50ml高渗溶液与融化后的红细胞混合。
图4A-D是对应于优选的红细胞复苏过程的步骤400的流程图。当复苏装置一旦正确地安装而且容器128被放上振荡平台104时，系统操作者就可以优选按照模块402所示启动系统100。如模块404所示，作为响应，控制器102启动振荡平台104，优选的操作条件为3Hz和1.5英寸峰间振幅。另外，如模块406所示连接到高渗溶液(优选50ml 12％氯化钠溶液载荷)袋148上的阀门158处于开放状态，泵110被启动，以泵速约60ml/min使得溶液从右到左(相对于图3)向滤器164流动。控制器102还监测着与泵110相连的空气检测器。具体地，如模块408所示，尽管在泵110上约有5个泵循环，但是控制器102可以检查空气是否正被检测。如果是这样，如模块410所示控制器102优选关闭泵110并在显示器112上发出错误信息。如模块412所示，当一旦在泵110检测到液体，控制器102就会对流经泵110的液体进行计量，用约5ml高渗溶液灌注滤器164。
接下来，如模块414所示，控制器102以从右向左的流向启动泵106(相对图3而言)，并且调节阀门168向容器128提供液体流通。来自袋148的高渗溶液流到泵110，经由滤器164和Y-形接头162到达泵106。从泵106流出后，高渗溶液流经阀门168，流入容器128。优选地，控制器102以150ml/min的流速操纵泵110，以比泵110小约5％的操纵速度操纵泵106。通过以来自泵110的5％delta运行泵106，控制器102能确保几乎或根本没有空气进入容器128中。控制器102还监测泵110的压力以确保其保持在特定的限度内，如模块416所示。如果泵110的压力超过范围±150mmHg，例如，控制器102优选将泵106和110二者都去-启动并发送出错误信息，如模块418所示。当预期量的高渗溶液已经流过泵100时(例如，50ml把各段管线中的体积都考虑在内)，关闭高渗溶液袋148上的阀门158，如模块420所示，这样就完成了用高渗溶液对融化红细胞的最初稀释。
用洗涤液稀释融化后的红细胞另外，还用预期体积的来自溶液袋146中的洗涤溶液稀释融化后的红细胞。但是，用高渗溶液稀释后融化红细胞的摩尔渗透压浓度约为4900mOsm/KgH2O，而洗涤溶液，例如0.9％氯化钠/0.2％葡萄糖溶液的摩尔渗透压浓度约为300mOsm/KgH2O，因而把洗涤液加入到红细胞中时，存在高渗休克的危险(因为洗涤液中的水进入细胞的速度比深低温保藏液扩散出细胞的速度快，从而导致细胞膨胀)。为了将发生上述情况的可能性和洗涤时间最小化，控制器102动态调节洗涤液的流速，使洗涤液以适当的稀释体积输送给RBCs，从而使RBC的摩尔渗透压浓度随时间而线性减小(例如，d摩尔渗透压浓度/dt=恒量)。当补加洗涤液时保持红细胞摩尔渗透压浓度恒定减小，从而使红细胞避免低渗休克，但仍还有一些深低温保藏液扩散出细胞。
根据下列公式可以测定出流速Fs，作为已被红细胞处理后的洗涤液的一项功能。
Fs=KD[Vi*(W*Hcti/100)+Vs]2/[Vi(W*Hcti/100)*(Oi-Os)(8)其中KD是期望的摩尔渗透压浓度减小速度(mOsm/KgH2O/min)，Vi为高渗溶液稀释后融化红细胞的体积(ml)，Hcti为用高渗溶液稀释后融化红细胞的血细胞比容水平(％)，Vs为已经释放到融化红细胞的洗涤液的体积(ml)，Oi为高渗溶液稀释后融化红细胞的摩尔渗透压浓度(mOsm/KgH2O)，以及Os为洗涤液的摩尔渗透压浓度(mOsmlKgH2O)。由于洗涤液流速的测定取决于已经释放到红细胞的洗涤液体积Vs，因此初始流速必须脱离公式(8)独立测定。初始的洗涤液流速Fs0优选用下列公式测定Fso=KD*Vi*Hcti/100)/(Oi-Os)(9)任一给定时间点t时已被融化红细胞处理的洗涤液体积用下列公式计算。
Vs=KD*Vi*(W*Hcti/100)*t/(Oi-Os-KD*t)(10)类似地，释放预期稀释体积的洗涤液所需的总时间T用下列公式计算。
T=Vs*(Oi-Os)/KD/[Vi*(W*Hcti/100)+Vs] (11)
用预期体积Vsl的洗涤液稀释后红细胞的摩尔渗透压浓度Osl用下列公式计算。
Osl=(Vh*Oph+Vsl*Os)/(Vh+Vsl)(12)为了获得约2835mOsm/KgH2O的最终摩尔渗透压浓度，应该用约340ml洗涤液稀释红细胞，这仅仅是容器128的体积功能。更特异地，如果容器128的容积为800ml并且已经装有350ml的深低温保藏RBCs和50ml的高渗溶液，那么就只可以再加入340ml左右的洗涤液而不超过容器的容积。因此，控制器102以用公式(8)周期确定的流速继续把总体积为340ml的洗涤液释放给红细胞。
具体地，当关闭阀门158时，控制器10打开阀门156流出洗涤液，如模块422所示。然后，如模块424所示当其余的高渗溶液已到达容器128后，而且洗涤液也快要进入容器128(即，有足够体积已经流过泵110充满了连通管线及组件)时，控制器102优选地开始以用公式(9)确定的初始流速Fso将洗涤液释放到容器128。控制器102并开始计算已输送到容器128的洗涤溶液的点体积。并且可以把该运行数值显示到显示器112上。控制器102不断地测定释放到融化红细胞的洗涤液量，如模块426所示，并且决定这个量是否等于预期量(例如340ml)，如模块428所示。如果不是这样，控制器102根据已经释放到红细胞的现有体积用公式(8)重新计算洗涤液的流速，如模块430所示，并调节泵110和106的速度从而实现新的流速，如模块432所示。另外，控制器102优选地计算出新的流速数值Fs，并且以实时(real time basis)调节泵速(例如，每200ms调节一次)。
控制器102还监测泵106的压力以确保其保持在选定范围内(例如，±150mmHg)。如果压力超过了选定范围，控制器102优选使泵106和110关停并向显示器112发送警告或错误信息。
当预期量的洗涤液已经释放到容器128中的红细胞时，控制器102优选使泵106和110关停，并关闭阀门156中断袋146中的洗涤液的供应，如模块434所示。使泵106和110关停后，优选控制器102让平台104再继续运行10秒钟，如模块436所示。
上清液的去除现在，容器128中包括了融化红细胞的体积以及分别来自袋148和146的高渗溶液和洗涤液稀释体积。系统100优选通过离心把该溶液中较轻的相(即，上清液)从红细胞中分离出来。具体地，控制器102启动离心驱动单元108以约8000rpm旋转离心筒178，如模块438所示。接下来控制器102启动泵106以从左到右的方向(相关于图3)把红细胞从容器128泵入到离心筒178中，如模块440所示。泵106可以最大的筒178填充速度运行(例如，200ml/min.)。控制器102还可以根据泵循环计算出进入离心筒178的液体体积。离心筒178旋转驱动较重的红细胞向外贴靠到筒的内表面上，而红细胞中的上清液(包括高渗和洗涤溶液)则收集在一个呈向内辐射状分布的环状区域内。上清液受迫流出筒178的出口180，并收集于废液袋182中。筒178优选包括一个光线传感器(未显示)，用它来监测存在于筒178的液体以确保更多的光吸收红细胞不被废弃到废液袋182中。
第一次清洗阶段当筒178还在旋转时，优选地通过操作泵110以恒定的流速(例如，50ml/min)加入一定体积(例如，100ml)的洗涤液，如模块442所示。相应体积(例如，100ml)的上清液，包括高渗及洗涤溶液被移去。然后，控制器102使离心驱动单元108关停，停止筒178，并且让RBCs与剩余上清液重混合约45秒，如模块444所示。
用洗涤液第二次洗涤融化红细胞接下来，优选地通过操作泵106把分离筒178中的内容物(约280ml)沿从右到左的方向(相对于图3)泵回到容器128中，如模块446所示。泵速可以为约200ml/min。当筒178中的内容物返回到容器128时，优选地控制器102启动平台104，并把第二批洗涤液从洗液袋146中释放到容器128中，如模块448所示。更特异地，控制器102优选地释放约410ml的洗液，分别根据初始及动态流速公式(9)和(8)，如上面与步骤424及432有关的描述。另外，410ml洗液只是容器128容积的一个指标。具体地，由于容器128具有约250～260ml(即，筒体积)液体，另加入410ml仍保持总体积低于其容积(例如，800ml)。向红细胞中加入第二批洗液后，控制器关停振荡平台104，如模块450所示。现在，RBCs已经被1倍体积的高渗溶液和2倍体积的洗涤液所稀释，RBCs摩尔渗透压浓度应该接近于洗涤液的摩尔渗透压浓度。下述步骤将把剩余的深低温保藏液从红细胞中洗脱出来。
应该理解的是，对融化红细胞的补充稀释可以重复上述操作来完成。
洗涤阶段优选实施方案中，系统100在离心筒178中对稀释后的红细胞进行5个独立的洗涤阶段。通过洗涤阶段使RBCs中的深低温保藏液完全去除，并且除去来自不能完整耐受冷冻和复苏过程的弱势细胞的任意碎片(例如，破裂的细胞膜、游离的血红蛋白等)。就每个洗涤阶段而言，下面按照讨论的那样，对洗涤溶液的体积、其进入筒178中的流速以及平衡时间进行选择以使RBCs的摩尔渗透压浓度随时间线性变化。首先，控制器102启动离心驱动单元108以约8000rpm旋转筒178，如模块452所示，通过泵106把容器128中的稀释后的红细胞泵入到离心筒178中，如模块454所示。转移开始和结束时的泵速可以设定为150ml/min和50ml/min。接下来，控制器102继续把约150ml的洗涤溶液从袋146中释放到旋转筒178，如模块456所示。洗涤液可以约50ml/min的流速释放。凭经验确定这些数值为RBC摩尔渗透压浓度提供通常的线性变化。除去筒178中产生的上清液并收集于废液袋182，如模块458所示。加入预期体积的洗涤液并除去上清液后，控制器102启动离心驱动单元108的制动机制并关停筒178，如模块460所示。典型地，使筒178停止旋转需要约15秒。优选地，筒178在预先设定的平衡延续时段(例如，45秒)内保持静止。平衡延续使得RBC摩尔渗透压浓度继续发展。
平衡延续过程中，可以通过泵106把设定体积(例如，20ml)的筒内容物泵入容器128中，如模块462所示。这样可以使筒顶部可被再抽入并且限制后续洗涤阶段中的红细胞损失。控制器102接着启动离心驱动单元108，在预先设定的时段(例如，60秒)内以约8000rpm旋转筒178，把此前去除体积的液体返回到筒178，如模块464所示。这样就完成了第一次洗涤阶段。
接下来控制器102确定是否执行另一个洗涤阶段，如模块466所示。如果是这样，控制器102优选重复步骤456至466。如显示的那样，在优选实施方案中，对稀释后的红细胞进行5个洗涤阶段。第二个洗涤阶段优选使用约300ml以约100ml/min释放的洗涤液，而第三到第五洗涤阶段各使用300ml以150ml/min释放的洗涤液。
用保藏液悬浮复苏后的红细胞洗涤循环完成后，控制器102用保藏液悬浮洗涤后的红细胞。洗涤后的红细胞的悬浮可以分多个阶段进行。更具体地，随着筒178以约8000rpm旋转，优选以恒定的流速把袋144中预定体积(例如，80ml)保藏液释放到筒178，如模块468所示。如模块470所示，然后制动离心驱动单元108，停止筒178。为了增加RBCs的最终血细胞比容，优选在制动过程中关闭废液袋182上的阀门185，除最后保藏循环时它是开放的，从而除去另外的上清液并收集于废液袋182中。在预先设定的驻留时间(dwell time)(例如，45秒)内使筒178还保持静止，如模块472所示。这段驻留时段使得筒内容物(即，洗涤后的红细胞和保藏液)相互混合，并且得到一种均匀的红细胞悬液。驻留时段后，重启动离心驱动单元108，以约8000rpm旋转筒178足够长的时间(例如，60秒)从而实现足够的红细胞沉积，如模块474所示。
控制器102接下来确定洗涤后的红细胞的悬浮是否完成，如模块476所示。如果不是这样，控制器102优选重复上述步骤468～476。优选实施方案中，控制器102执行1个保藏循环。此刻，已经洗去了红细胞的深低温保藏液，并被悬浮于保藏液中。控制器102关停离心驱动单元108，如模块478所示，然后把洗涤并悬浮后的RBCs泵入最终收集袋170，如模块480所示。通过操作泵106使RBCs以约20ml/min的流速沿从右到左的方向流动(相对于图3)。
用保藏液取代上清洗涤液，在深低温保藏过程中过滤深低温保藏液并洗涤RBCs(除去弱势细胞)，最终复苏的RBCs可以在使用前在4℃保藏约2周。这一延长后的保藏时间远远超过了现有技术装置所能实现的保藏时间，后者典型地不超过24小时。
应该理解的是本发明中所述的深低温保藏及复苏过程可以分别完成和执行。
上面的描述仅是本发明的特定实施方案。但是，显然可以对上述实施方案进行其他变动及改进，而仍保留它们的部分或全部优点。因此，下面所附的权利要求是为了覆盖落在本发明范围之内的所有此类变动或改进。
权利要求
1．一种通过混合血液组分和一定体积深低温保藏液制备出可深低温保藏血液组分的设备，该深低温保藏液使所述血液组分有出现摩尔渗透压浓度休克的可能，所述设备包括至少一个能将一定体积深低温保藏液与所述血液组分联系在一起的变速泵，使得以特定速度操作泵时可将深低温保藏液以相应流速限定给所述血液组分；以及一个可操作地连接到至少一个上述泵上的控制器，从而控制深低温保藏液释放到血液组分的流速，所述控制器设计成动态地调节深低温保藏液的流速，从而减少血液组分发生摩尔渗透压浓度休克的可能。
2．权利要求1所述的设备，进一步包括一个安装在深低温保藏液和血液组分之间的除菌滤器。
3．权利要求2的设备，其中所述控制器能动态地调节深低温保藏液的流速，从而能保持血液组分摩尔渗透压浓度基本上呈线性增大。
4．权利要求3的设备，其中所述控制器进一步设计成能够反复测定加入到血液组分中深低温保藏液的量，根据深低温保藏液的测定量计算新的流速，并调节至少一个上述泵从而以新的流速释放深低温保藏液。
5．权利要求4的设备，其中所述控制器能测定深低温保藏液的量，计算出新流速并且以实时调节至少一个泵。
6．权利要求5的设备，其中所述控制器进一步被设计成能测定出为实现血液组分中预期深低温保藏液浓度所需深低温保藏液的体积。
7．权利要求6的设备，其中一个导管把深低温保藏液与血液组分连通，并且在至少一个上述泵的下游导管中安装一个压力探针，该压力探针向控制器提供相应的压力信号，控制器进一步被设计成能在压力信号超过预定阈值时关停所述的至少一个泵。
8．权利要求1的设备，其中所述的血液组分是红细胞，所述控制器被设计成调节至少一个泵的速度从而使深低温保藏液的流速基本上是下列公式给定的速度K[Vi*(W*Hcti/100)+Vg]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Og)]其中K指红细胞摩尔渗透压浓度增加的选定速率，Vi指红细胞的体积，W是红细胞中水的体积百分比，Hcti是深低温保藏前红细胞的血细胞比容水平，Vg指现时流速计算之前已加入到红细胞的深低温保藏液的体积，Oi指深低温保藏前红细胞的摩尔渗透压浓度和Og指深低温保藏液的摩尔渗透压浓度。
9．权利要求8的设备，其中所述控制器被设计成初始调节至少一个泵的速度从而使深低温保藏液的初始流速基本上是下列公式给定的速度K*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Og).
10．权利要求9的设备，其中所述控制器进一步被设计成基本上根据下列公式来确定红细胞的体积ViNWi/[1.1*Hcti/100+1.026*(1-Hcti/100)]其中NWi指深低温保藏前红细胞的净重。
11．权利要求10的设备，该设备进一步包括一个振荡平台，该平台的作用在于当向血液组分中释放深低温保藏液时振荡所述血液组分。
12．权利要求1的设备，该设备进一步包括一个振荡平台，该平台的作用在于当向血液组分中释放深低温保藏液时振荡所述血液组分。
13．权利要求2的设备，其中所述的除菌滤器具有一定的压力操作范围，而且所述控制器被进一步设计成能防止除菌滤器上的深低温保藏液压力超过所述操作范围。
14．一种通过混合血液组分和一定体积深低温保藏液制备出可深低温保藏血液组分的方法，所述深低温保藏液使所述血液组分有出现摩尔渗透压浓度休克的可能，该方法包括下述步骤测定出为获得血液组分中预期深低温保藏浓度所需深低温保藏液的体积；通过至少一个变速泵将一定体积的深低温保藏液与所述血液组分连通，以确保特定速度操作泵时能将相应流速的深低温保藏液限定给所述血液组分；以及通过周期性地改变至少一个泵的速度，动态地调节深低温保藏液的流速，从而减少血液组分发生摩尔渗透压浓度休克的可能。
15．权利要求14的方法，其中所述的动态调节的步骤包括下述步骤改变至少一个泵的速度，从而使深低温保藏液的流速基本上为下列公式给定的流速K[Vi*(W*Hcti/100)+vg]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Og)]其中K指红细胞摩尔渗透压浓度增加的选定速率，Vi为红细胞的体积，W为血细胞中水的体积百分比，Hcti指深低温保藏前红细胞的血细胞比容水平，Vg指现时流速计算之前就已加入到红细胞的深低温保藏液的体积，Oi指深低温保藏前红细胞的摩尔渗透压浓度，以及Og指深低温保藏液的摩尔渗透压浓度。
16．权利要求15的方法，该方法进一步包括向血液组分中释放深低温保藏液时振荡血液组分的步骤。
17．一种可以用一定体积稀释液稀释融化后的深低温保藏血液组分的设备，所述稀释液使所述血液组分在其复苏过程中有出现摩尔渗透压浓度休克的可能，该设备包括用于将所述稀释液与血液组分连通的器具；至少一个安装在上述连通器具中的变速泵，使得以特定速度操作上述至少一个泵时可将稀释液以相应流速限定给所述血液组分；以及一个可操作地连接到至少一个上述泵上的控制器，从而控制稀释液释放到血液组分的流速，所述控制器被设计成能动态地调节稀释液的流速，从而减少血液组分发生摩尔渗透压浓度休克的可能。
18．权利要求17的设备，其中所述控制器能动态地调节稀释液的流速，从而能保持血液组分摩尔渗透压浓度基本上呈线性减小。
19．权利要求18的设备，其中所述的血液组分是红细胞，所述控制器被设计成调节至少一个泵的速度从而使稀释液的流速基本上是下列公式给定的速度KD[Vi*(W*Hcti/100)+Vs]2/[Vi*(W*Hcti/100)*(Oi-Os)其中KD是期望的摩尔渗透压浓度减小速度，Vi为高渗溶液稀释后融化红细胞的体积，W为红细胞中水的体积百分比，Hcti为用高渗溶液稀释后融化红细胞的血细胞比容水平，Vs为已经释放到融化红细胞的洗涤液的体积，Oi为高渗溶液稀释后融化红细胞的摩尔渗透压浓度，以及Os为洗涤液的摩尔渗透压浓度。
20．权利要求19的设备，其中所述控制器被设计成初期调节至少一个泵的速度，以使稀释液的初始流速基本满足下列公式KD*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Os)．
21．权利要求20的设备，该设备进一步包括一个振荡平台，该平台的作用在于当向血液组分中释放稀释液时振荡所述血液组分。
22．一种用一定体积的稀释液稀释融化的，深低温保藏血液组分的方法，所述稀释液使血液组分在其复苏过程中有发生摩尔渗透压浓度休克的可能，该方法包括下述步骤通过至少一个变速泵将一定体积的稀释液与融化的血液组分连通，以确保特定速度操作泵时能将相应流速的稀释液限定给所述血液组分；以及通过周期性地改变至少一个泵的速度，动态地调节稀释液的流速，从而减少融化的血液组分发生摩尔渗透压浓度休克的可能。
23．权利要求22的方法，该方法进一步包括下述步骤在释放稀释液之前用一定体积的高渗溶液稀释融化后的血液组分，所述高渗溶液具有与所述血液组分基本相同的摩尔渗透压浓度。
24．权利要求23的方法，其中所述的血液组分是红细胞，以及所述的动态调节步骤包括改变至少一个泵的速度的步骤以使稀释液的流速基本上为下列公式给定的速度KD[Vi*(W*Hcti/100)+Vs]2/[Vi*Hcti/100)*(Oi-Os)其中KD是期望的摩尔渗透压浓度减小速度，Vi为高渗溶液稀释后融化红细胞的体积，W为红细胞中水的体积百分比，Hcti为用高渗溶液稀释后融化红细胞的血细胞比容水平，Vs为已经释放到融化红细胞的洗涤液的体积，Oi为高渗溶液稀释后融化红细胞的摩尔渗透压浓度，以及Os为洗涤液的摩尔渗透压浓度。
25．权利要求24的方法，其中所述的动态调节步骤进一步包括初期调节至少一个泵的速度，以使稀释液的初始流速基本满足下列公式KD*Vi*(W*Hcti/100)/(Oi-Os)．
26．权利要求25的方法，该方法进一步包括下述步骤在向血液组分中释放稀释液时振荡融化的血液组分。
27．一种通过下述操作制备可稀释的血液组分的设备混合血液组分和一定体积稀释液，该稀释液使所述血液组分有发生摩尔渗透压浓度休克的可能，以及用一定体积稀释液稀释融化后的稀释血液组分，所述稀释液也使所述血液组分在其复苏过程中有发生摩尔渗透压浓度休克的可能，所述设备包括至少一个变速泵，该变速泵不仅连通着血液组分，而且选择性地连通着一定体积的深低温保藏液或一定体积的稀释液，这样使得以特定速度操作泵时可将深低温保藏液或稀释液以相应流速限定给所述血液组分；以及一个可操作地连接到至少一个上述泵上的控制器，从而控制稀释液或稀释液释放到血液组分的流速，所述控制器被设计成能动态地调节稀释液或稀释液的流速，从而减少血液组分发生摩尔渗透压浓度休克的可能。
全文摘要
一种可动态调节深低温保藏液释放到红细胞从而实现冷冻的系统。所述释放速度优选由公式确定,该公式能保持红细胞摩尔渗透压浓度随时间线性变化从而防止红细胞摩尔渗透压休克。在优选实施方案中,该系统包括一个被预先设计成根据上述公式将深低温保藏液自动释放到红细胞中的控制器。该系统还可以通过稀释红细胞以及洗脱出其中的深低温保藏液来支持融化红细胞的复苏。另外,该系统优选地调节稀释液的流速从而防止复苏过程中的红细胞摩尔渗透压休克。复苏后,复苏红细胞可以悬浮于一种保藏液中以进一步增加它们的储存寿命。
文档编号B01D17/038GK1290124SQ99802743
公开日2001年4月4日 申请日期1999年12月6日 优先权日1998年12月7日
发明者E·帕格斯 申请人:赫默内蒂克斯公司