一种生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法、由此制备的碳量子点及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物活性酶辅助微波法合成超强荧光碳量子点的方法，具体步骤为：（1）将碳前驱体和生物活性酶超声分散于去离子水中，制成透明的水溶液；（2）将步骤（1）中得到的溶液置于家用微波炉中进行微波加热，反应后得到棕黄色液体即为生物活性酶修饰的碳量子点；（3）将步骤（2）中反应得到的碳量子点溶液用透析袋透析，去除未反应的碳前驱体和生物活性酶。该方法产率高，制备的荧光碳量子点为生物活性酶修饰的，能够进入细胞核内，因而具有对癌症的诊疗功能；采用生物活性酶作为反应的活性剂和钝化试剂，以柠檬酸、柠檬酸盐、葡萄糖、果糖或者直链淀粉为碳前躯体，使得荧光碳量子点在制备和使用过程中生物安全性好；采用微波合成法成本低廉。
【专利说明】一种生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法、由此制备的碳量子点及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料科学和生物医学工程领域，具体涉及一种生物活性酶辅助微波法合成荧光碳量子点的方法。
【背景技术】
[0002]随着纳米技术及光学影像技术的快速发展，利用纳米材料独特的光学、磁学和电学等独特的性质，为临床医学中对重大疾病的早期诊断和治疗带来了新的契机。
[0003]分子影像学是目前临床医学肿瘤检测的重要手段之一。生物纳米探针技术的发展为分子影像技术的发展提供了新的思路，例如Alivisatos P.在《Nature Biotechnology》(自然，生物技术)(2004,22(1):47)期刊上发表了题为纳米晶体在生物监测中的应用(Theuse of nanocrystals in biological detection),该文章阐述了纳米生物探针技术的发展和应用前景。荧光量子点由于其独特的光学性质，在纳米生物探针技术的发展中起到重要作用。众所周知，镉系荧光纳米粒子就是量子点中的一种，由于含有重金属元素，在实际使用时将会给环境和生物体带来不可忽略的损害。因此寻找适合于生物标记、疾病探 测以及药物输送等生物化学领域中所需的高量子产率的荧光纳米材料具有重要意义。
[0004]碳元素是自然界最丰富的元素之一，也是生命体最重要的组成元素之一。自然界中存在的碳原子组成的碳材料也很多，形态各异，如炭黑、煤炭、石墨、金刚石等；今年来一直研究热点的新型纳米碳材料有碳纳米管、富勒烯、石墨烯、纳米钻石、纳米碳纤维等。Xu 等人在 J Am.Chem.Soc,《美国化学期刊》(2004,126: 12736)发表了 Electrophoreticanalysis and purification of fluorescent single—walled carbon nanotubefragments (电泳分析纯化荧光单壁碳纳米管片段)，首次证实了荧光碳量子点的存在。
[0005]荧光碳量子点，其直径一般在IOnm以下，具有发射波长可“调谐”，可以实现一元激发多元发射，发射波长跨度很大，吸收波长可以从可见光区延伸到近红外光区，斯托克位移比较宽，无荧光漂白和闪烁的性质，具有良好的生物安全性，是传统半导体量子点的理想替代材料。
[0006]根据其制备方法的不同，荧光碳量子点的荧光性质和表面结构也有所不同。目前荧光碳量子点的制备方法很多，如激光灼烧法、化学合成法、电化学合成法、高温氧化法、超声法、水热合成法和微波合成法，其中微波合成法具有操作简单、合成周期短、表面基团和颗粒尺寸可控等特点。
[0007]根据目前报道的微波合成法，荧光碳量子点的产率在I~10%左右，如果不做进一步靶分子修饰，基本进入不了细胞核内且不具有对癌症的诊疗功能。
【发明内容】
[0008]针对现有技术碳量子点制备方法产率低并且制备出的碳量子点，如果不做进一步靶分子修饰，基本进入不了细胞核内，不具有对癌症的诊疗功能等缺陷，本发明提供了一种产率高、生物安全性好、合成方法简单、成本低廉的制备碳量子点的方法。
[0009]本发明提供的生物活性酶辅助微波法合成荧光碳量子点的方法，采用生物活性酶作为反应的活性剂和钝化试剂，采用微波合成法制备碳量子点。
[0010]该方法产率高，克服了现有技术的产率低的不足，使得制备的荧光碳量子点能够应用于生物标记、疾病探测；同时制备的荧光碳量子点为生物活性酶修饰的，能够进入细胞核内，因而具有对癌症的诊疗功能；采用生物活性酶作为反应的活性剂和钝化试剂，以低分子量的有机酸、有机酸盐或多糖为碳前躯体，使得荧光碳量子点在制备和使用过程中生物安全性好，不会环境和生物体造成的损害；采用微波合成法一步合成荧光碳量子点，合成方法简单、设备简单，因此合成成本低廉。
[0011]本发明提供的生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法，包括以下步骤:
[0012](I)将碳前驱体和生物活性酶分散于去离子水中，进行超声处理，制成透明的水溶液；
[0013](2)将步骤(1)中得到的水溶液进行微波加热，反应后得到生物活性酶修饰的碳量子点溶液；
[0014](3)将步骤(2)中反应得到的碳量子点溶液用透析袋透析，去除未反应的碳前驱体和生物活性酶。
[0015]进一步地，生物活性酶作为反应的活性剂和钝化试剂。
[0016]进一步地，生物活性酶为核糖核酸酶A。
[0017]核糖核酸酶A (Bovine Pancreatic Ribonuclease A,缩写为 Rnase A),是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶，控制着细胞内RNA的种类和数量，参与核酸调节和代谢过程。Rnase A是一个具有124个氨基酸序列的蛋白质，分子量13.64Dka，其空间结构由3个α螺旋、9个β折叠和四对分子内二硫键组成，并具有高温稳定性的特点。更重要的是，RNase A是第一个被用于动物肿瘤治疗的核糖核酸酶，一系列研究表明，RNase A具有的重要生理功能使其有望成为一类新型的抗肿瘤药物。本发明选用RNase A作为反应的活性剂和钝化试剂，使得制备出的生物活性酶修饰的碳量子点性质稳定，并且兼有对癌症影像和治疗的功能。
[0018]进一步地，碳前驱体为柠檬酸、柠檬酸盐、葡萄糖、果糖或者直链淀粉，所选的碳前躯体均为普通试剂，来源广泛，价格便宜。
[0019]进一步地，碳前驱体和生物活性酶的质量比为100:0.5~100:4。
[0020]进一步地，超声处理是指利用工作频率为40~200kHz，超声功率100~800W，超声时间为I~20min的超声作用。
[0021]进一步地，微波加热为在功率为200W~1000W的微波炉中，加热I~20min。
`[0022]进一步地，本发明提供的方法制备的碳量子点。颗粒分散性较好，没有团聚，有利于发光，因而稳定性好并且具有优异的单分散性和荧光性质。
[0023]进一步地，本发明提供的方法制备的碳量子点能够进入细胞核内，因而具有对癌症的诊疗功能。
[0024]进一步地，本发明提供的方法制备的碳量子点作为荧光标记在对胃癌MGC-803细胞的激光共聚焦成像中的用途。
[0025]与现有技术相比，本发明提供的生物活性酶辅助微波法合成荧光碳量子点的方法，具有以下有益效果:
[0026](I)制备的荧光碳量子点产率高达20~40%，产率高，克服了现有技术的产率低的不足，使得制备的荧光碳量子点能够应用于生物标记、疾病探测；
[0027](2)制备的荧光碳量子点为生物活性酶修饰的，能够进入细胞核内，具有对癌症的诊疗功能；因其对癌症具有影像和治疗功能，已成功地应用于细胞成像和胃癌靶向治疗，具有广阔的应用前景；
[0028](3)采用生物活性酶作为反应的活性剂和钝化试剂，以低分子量的有机酸、有机酸盐或多糖为碳前躯体，使得荧光碳量子点在制备和使用过程中生物安全性好，不会环境和生物体造成的损害；
[0029](4)采用微波合成法一步合成荧光碳量子点，合成方法简单、设备简单，因此合成成本低廉；
[0030](5)分离提纯简单，重复性好，在一般实验室均能完成，易于规模化和推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1a为核糖核酸酶A碳量子点的低分辨率扫描电镜图SEM图；
[0032]图1b为核糖核酸酶A碳量子点的高分辨率扫描电镜图SEM图；
[0033]图2a为核糖核酸酶A碳量子点的紫外吸收光谱；
[0034]图2b为核糖核酸酶A碳量子点的红外吸收光谱；
[0035]图3a为核糖核酸酶A碳量子点的荧光光谱图；
[0036]图3b为核糖核酸酶A碳量子点的光学照片；
[0037]图4a是核糖核酸酶A碳量子点作为生物标记对胃癌MGC-803细胞共聚焦成像2D照片；
[0038]图4b是核糖核酸酶A碳量子点作为生物标记对胃癌MGC-803细胞共聚焦成像3D照片。
【具体实施方式】
[0039]实施例1
[0040]以柠檬酸为碳前驱体，RNase A为生物合成模板，制备超强荧光碳量子点。
[0041]步骤一:在室温下，称取Ig柠檬酸和20mg RNase A，量取5mL H2O,全部移入25mL玻璃反应瓶中，把该反应瓶放在工作频率为40kHz，功率200W的超声中处理lmin，得到均匀的水溶液；
[0042]步骤二:将步骤一中得到的水溶液置于家用微波炉中，在800W功率下进行微波加热4min,反应后得到棕黄色液体；
[0043]步骤三:使用截留分子量为5000的透析袋，透析步骤二中得到的棕黄色液体，透析时间为24h，透析过程中不间断的更换超纯水，以除去未反应的柠檬酸和RNase A，即可得到RNase A修饰的超强荧光碳量子点，RNase AiC-dots产率为24.2%。
[0044]图1a和图1b为实施例1的方法制备的碳量子点的扫描电镜图SEM图，从中可以看出，RNase A@C-dots颗粒分散性较好，没有团聚，有利于发光，因而稳定性好并且具有优异的单分散性和荧光性质。[0045]图2a是实施例1的方法制备的碳量子点的紫外吸收光谱，表征紫外吸收性质；图2b是实施例1的方法制备的碳量子点的红外光谱，表征表面化学基团。
[0046]图3a是RNase A@C-dots的荧光光谱图，为吸收和激发光谱，表明碳量子点的荧光发射性质；图3b为RNase AiC-dots光学照片，左边为自然光照射，右边为紫外光照射，反映了溶液的发光现象。
[0047]图4a和图4b是核糖核酸酶A碳量子点作为生物标记对胃癌MGC-803细胞共聚焦成像2D和3D照片，从中可以看出，RNase AiC-dots能够进入细胞核，对胃癌MGC-803细胞具有影像，加之RNase A本身对癌症有治疗功能，因而RNase AiC-dots已成功地应用于细胞成像和胃癌靶向治疗，具有广阔的应用前景。
[0048]实施例2
[0049]以葡萄糖为前驱体，RNase A为生物合成模板，制备高强荧光碳量子点。
[0050]步骤一:在室温下,称取Ig葡萄糖和IOmg RNase A,量取5mL H2O,全部移入25mL玻璃反应瓶中，把该反应瓶放在工作频率为40kHz，功率200W的超声中处理lmin，得到均匀的水溶液。
[0051]步骤二:将步骤一中得到的水溶液置于家用微波炉中，在800W功率下进行微波加热4min,反应后得到棕黄色液体。
[0052]步骤三:使用截留分子量为5000的透析袋，透析步骤二中得到的棕黄色液体，透析时间为36h，透析过程中不间断的更换超纯水，以除去未反应的葡萄糖和RNase A，即可得到RNase A修饰的碳量 子点，RNase AiC-dots产率为18.6%。
[0053]碳前驱体也可以使用果糖或低分子量的直链淀粉等多糖小分子，所选的碳前躯体均为普通试剂，来源广泛，价格便宜。
[0054]实施例3
[0055]采用RNase AiC-dots为荧光标记对胃癌MGC-803细胞的激光共聚焦成像。
[0056]步骤一:制备BRCAAl抗体标记的多功能突光RNase A@C_dots探针。由于RNaseA@C-dots表面同时富含羧基和氨基，因此用交联剂碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对RNase AiC-dots颗粒表面的-C00H进行活化，通过BRCAAl抗体表面的-NH2与量子点表面-C00H的缩合反应2h，实现BRCAAl抗体与量子点的偶联。经过三次PBS缓冲液清洗后，得到的BRCAAl抗体标记的量子点并保存在4°C下备用。
[0057]步骤二:肿瘤细胞的靶向富集。运用常规的体外培养方法培养胃癌MGC-803细胞，具体方法如下:取对数生长期的胃癌MGC-803细胞。每个35mm的培养皿中加入2mL胰蛋白酶，放置于37°C细胞培养箱中消化5min，加入RP1640培养液5mL后用枪头进行吹打，然后将细胞悬液转移至离心管中，在1000rpm条件下离心5min，去除上清液后得到聚集的细胞，将聚集的细胞中再次加入5mL RP1640培养液，并用ImL枪头进行吹打，从而使聚集的细胞均匀分散于整个悬液中。利用白细胞计数器进行胃癌MGC-803细胞计数。最后将细胞均匀稀释至107个/mL。取上述浓度的细胞悬液各lmL，加入前面准备好的120 μ M的步骤一中的偶联有BRCAAl抗体的荧光碳量子点。在37°C条件下反应12h，采用多聚甲醛对细胞固定，并用4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色，初步在荧光显微镜下观察细胞荧光照片。
[0058]步骤三:激光共聚焦显微镜对细胞进行二维和三维成像。本实验选择型号为TCS SP5激光共聚焦显微镜(莱卡，显微系统，德国曼海姆；LeicaMicrosystems, Mannheim, Germany)。米用405激发光作为光源，对胃癌MGC803细胞进行2D和3D成像，如图4a和图4b所示，可以看到碳量子点通过细胞的包吞作用进入细胞内，并且可以观察到少量碳量子点已经进入了细胞核，这也是本发明优越特性之一。
[0059]综上所述，本发明的生物活性酶辅助微波法合成超强荧光碳量子点的方法，完全在水相中进行，操作安全、快捷方便、生物安全性好并且产率高。
[0060]本发明提供的生物活性酶辅助微波法合成荧光碳量子点的方法，制备的荧光碳量子点产率高达20~40%，产率高，克服了现有技术的产率低的不足，使得制备的荧光碳量子点能够应用于生物标记、疾病探测；制备的荧光碳量子点为生物活性酶修饰的，能够进入细胞核内，具有对癌症的诊疗功能；因其对癌症具有影像和治疗功能，已成功地应用于细胞成像和胃癌靶向治疗，具有广阔的应用前景；采用生物活性酶作为反应的活性剂和钝化试剂，以低分子量的有机酸、有机酸盐或多糖为碳前躯体，使得荧光碳量子点在制备和使用过程中生物安全性好，不会环境和生物体造成的损害；采用微波合成法一步合成荧光碳量子点，合成方法简单、设备简单，因此合成成本低廉；分离提纯简单，重复性好，在一般实验室均能完成，易于规模化和推广。
[0061]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据 本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本【技术领域】中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将碳前驱体和生物活性酶分散于去离子水中，进行超声处理，制成乳白色的水溶液； (2)将步骤(1)中得到的所述水溶液进行微波加热，反应后得到生物活性酶修饰的碳量子点溶液； (3)将步骤(2)中得到的所述碳量子点溶液用透析袋透析，去除未反应的所述碳前驱体和所述生物活性酶。
2.如权利要求1所述的生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法，其特征在于，所述生物活性酶作为反应的活性剂和钝化试剂。
3.如权利要求2所述的生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法，其特征在于，所述生物活性酶为核糖核酸酶A。
4.如权利要求1所述的生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法，其特征在于，所述碳前驱体为柠檬酸、柠檬酸盐、葡萄糖、果糖或者直链淀粉。
5.如权利要求1所述的生物活性酶辅助微波法合成荧光碳量子点的方法，其特征在于，所述碳前驱体和所述生物活性酶的质量比为100:0.5~100:4。
6.如权利要求1所述的生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法，其特征在于，所述的超声处理是指利用工作频率为40~200kHz，超声功率100~800W，超声时间为I~20min的超声作用。
7.如权利要求1所述的生物活性酶辅助微波法合成碳量子点的方法，其特征在于，所述微波加热为在功率为200W~1000W的微波炉中，加热I~20min。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法制备的碳量子点。
9.如权利要求8所述的碳量子点，其特征在于，所述碳量子点能够进入细胞核。
10.如权利要求8所述的碳量子点作为荧光标记在对胃癌MGC-803细胞的激光共聚焦成像中的用途。
【文档编号】B82Y20/00GK103771390SQ201410005216
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】沈广霞, 刘慧旸, 王青, 崔大祥 申请人:上海交通大学