专利名称：精子荧光染色计算机检测系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学数字图像技术领域，特别涉及精子荧光染色的动态图象可视化计算机检测系统。
目前对精子的动静态分析检测有以下许多方法一、在显微镜上用眼睛直视，对其动态特性难以取得定量，只能定性地划上几个“+”号予以评定。
二、利用多次曝光技术，对其动态特性虽然比上述好一些，能取得几项指标，但速度很慢，数据量小，精度差也难以适应临床的需要。
三、利用光散射法，这种方法采样速度快，分析计算也很快，但直接取得的检测参数很少，所以不适于临床。
四、利用计算机及数字图象技术配以快速显微摄象的相应的软件包所形成的随机图象检测分析装置。申请人先期完成的一项题为“精子动(静)态图像检测与病案图象可视化及其管理装置”的实用新型专利(96222683.1)就是这类装置。该装置由显微摄像部件、图象采集部件、微机处理部件、图像贮存及病案管理(VCD)部件、显示打印部件、恒温防尘部件构成。此装置的主要特点是采样(抓拍)、处理快、数据量大，可视化性强，客观性好，精度高，功能全，所测参数多，是目前精液检查分析、临床、科研所需的较为理想装置。但该装置仍有一些不足之处，其一，采用黑白摄像头(CCD)，使检测人员在镜下观测的图像存在差别，判断不易准确；其二，该图像卡只能工作在微机时钟频率较低的状态下，低速状态，与之所匹配的微机最高为586/166，并且还得将CPU的内部高速缓存和外部高速缓存关闭，才能使图像卡正常工作，造成计算机资源的浪费，且处理速度较慢。
本发明的目的是提供一种对精液标本进行染色的方法，以及基于此法而设计的计算机检测系统，以利提高检测准确度，使其具有动静态自检测速度快、分辨率高、精度高、客观性好及功能强的特点，使其更适合临床、教学和科研的需求。
本发明提出的精子自分析系统，包括将被检样品的静态图像随机拍摄下来的显微摄像部件；将所说的显微摄像部件发送来的图像信号进行识别予处理贮存，并进一步将成熟的信号进行一系列算处理和结果的输出以及进行人机对话的病案的教学、学术交流的微机处理部件；图像贮存及病案管理(VCD)部件、显示打印部件、对被检样品进行加热、保温及防尘的恒温防尘部件；所说的显微摄像部件由显微、高分辨率彩色CCD组成；所说的图像采集部件是由将动态或静态信号进行抓拍和预处理的黑白和彩色图像卡构成所说的微机处理部件是由586微机及其多媒体单元构成；所说的显示打印部件由彩色图监视器及打印机组成；所说的恒温防尘部件由有机玻璃密封罩及空调式加温器组成；还包括由全彩色卡及相应的软件组成的静态图像专用分析部件。
计算机辅助精液分析系统是近20～30年发展起来的一项检测男性精液参数的新技术，它将显微摄像技术和计算机系统进行有机的结合，这项技术的诞生，解决了手工检测精液的繁锁等不足，能客观快速地将精液参数计算出并通过计算机打印出结果，受到了从事生殖医学、男科学等科研工作者的欢迎。经过近30年的临床运用，发现目前使用的计算机辅助精液分析仪(CASA)还存在一些未能解决的技术问题，例如，在图象处理过程中，如何准确识别精子，如何排除精液中除精子外，对一些其它细胞，如白细胞、红细胞和脱落的生殖细胞及杂质等的误判，现行的灰度识别方法很可能把这些成份当作精子识别，而出现精子密度过高的假象，有时候图象中真正的精子又未能识别出，可能会导致密度偏低。除此之外，传统的灰度识别方法不能区分出不动的精子是死还是活。本发明的任务之一就是提供一种解决上述问题的技术方案，该技术方案包括精子荧光染色和针对精子荧光染色样本的计算机分析系统。
本发明荧光精子染色方法使用了两种试剂，分别称之为试剂A、试剂B。试剂A的配制方法是先配制pH3～7.8，优选pH4～6的缓冲液，再用该缓冲液配制0.001～0.5％，优选0.01％的吖啶橙荧光色素，并将其放入-20至-30℃低温冰箱中保存待用。试剂A也可以采用生理盐水或双蒸水替代缓冲液配制0.001～0.5％的吖啶橙荧光色素溶液。试剂B采用Molec.Probe.Eugene.Oregon.USA死活精子染色试剂中的B液。染色的步骤是新鲜精液液化后，吸取100μl精液放入洁净试管中，加入试剂A和试剂B后充分混匀，于37℃放置5分钟。也可先加试剂A于37℃放置5分钟，然后再加入试剂B，于37℃放置5分钟。吸取10μl的染色精液，加入makler板中，置显微镜下检测。
本发明的检测原理由图2框图所示，利用计算机控制下的图像卡所具有的快速抓拍功能，实现对显微镜下的精子的运动图像或静态图像进行随机连续拍摄，将所获得的图像序列暂存在图像卡和计算机存贮单元中，然后图像卡和计算机对每一幅图像分析进行识别运算，提取出图像中样品的位置参数并予以记录，再根据这些不同图像中的位置参数，求出各位置参数之间的关联关系(即进行关联运算)，由这此关系参数求解出样品运动的轨迹，最后从这些轨迹计算出样品运动的各项参数。
本发明具有以下特点1.能区分死活精子，死精子发红色荧光。活精子发黄绿色荧光，不影响原液中精子的密度和活精子的前向运动速度，染色步骤简单，容易掌握，本发明提供的精子荧光染色试剂A与现有的Molec.Probe.Eugene.Oregon.USA死活精子染色试剂中的A液相比较，具有成本低，价格便宜、容易保存、衰减慢、不影响观察效果等优点。
2.采用彩色摄像头、彩色图像卡，这样所得到的图像为全彩色图像，尤其在静态图像处理方面，其优越性最为突出，使所检测人员可得到与镜下观测相同的图像，判断更为准确。使得微机处理结果更为准确，因为所测对象与杂质在颜色上有本质区别。
3.所说的图像卡几乎可与目前市面上常见的所有微机相匹配，兼容性好，充分利用计算机资源运算速度大为提高。
4.采用两个软件包，一个专门处理动态图像，一个专门用来处理静态图像。在静态软件包中添加了对染色涂片观测；分析畸形判别及组织胚胎方面的功能。这样将软件包一分为二，各负其责，可使处理结果更为准确，并且对于今后的功能扩展打下好的基础。
本发明应用领域甚广，如医院中的男科泌尿外科、男性不育检验科、计划生育、试管婴儿及动物的人工繁殖部门等。
附图简要说明
图1为本发明的实施例总结构示意图。
图2为本发明检测过程框图。
图3为本发明实施例软件系统结构示意图。
图4为本发明实施例软件系统运行流程图。
图5为本发明实施例精子运动叠加序列示意图。
图6为本发明实施例精子识别过程示意图。
图7为本发明实施例双阈值法示意图。
图8为本发明实施例链码方向定义图。
图9为本发明实施例精子轮廓示意图。
图10为本发明实施例位置关系示意图。
图11为本发明实施例精子运动方向定义示意图。
图12为本发明实施例精子运动曲线示意图。
图13为本发明实施例关联运算框图。
图14为本发明实施例重叠检测与消去流程图。
图15为本发明实施例精子检测程序总框图。
本发明实施例的装置总体结构如图1所示，包括以下部分1)、显微摄像部件显微镜1、CCD2；2)、图像采集部件全彩色图像卡(安装在计算机3内)；3)、微机部件586微机及其多媒体部件3；4)、显示部件彩色监视器4、打印机5；5)、恒温防尘部件加热装置及其有机玻璃密封罩(图中未示出)；6)、专用样品盒及工作台(图中未示出)；7)、录像机6。
现将各分的功能简述如下显徽摄像部件显微摄像部件是由带摄像的显微镜和高分辨率、高灵敏度的彩色摄像头(CCD)组成，其功能是将放在样品盒中的被检样品的动静态图像随机拍摄下来送入图像采集部件以备处理。
图像采集部件主要是由图像卡负担，其功能是将CCD发送来的图像进行识别予处理贮存，并进一步将成熟的信号送到计算机进行全面处理。
微机处理部件是由计算机、监视器、打印机等外设组成，其功能是通过所编软件将图像卡送过来的原始信号进行全面加工处理，通过显示器及打印机将所有的参数进行显示和打印输出，或通过录相机、多媒体技术将原始信号进行永久地贮存以备将来复查和细心研究。
显示部件实际是由计算机监视器和单配的彩色图像监视器组成，计算机监视器是负责采集过程及运算过程中的信号显示，而单配彩色图像监视器是专为病人用以观看自已病性的。
恒温部件是由加温和保温设备组成，加温是通过热吹风机不断的将温度适中的热风鼓入封闭保温罩内，这种室内空调式恒温方式也是本发明的优点之一，加热均匀，不受外界气流人流和室温变化的影响，效果十分显著。
专用样品盒是本发明部件中必配器件，为确保单层取样样品池深度为10μm。工作台也是根据部件情况专门配用。
多媒体部件是由光驱、声霸卡、解压卡及音箱组成，它的功能一是为医务人员进行科教活动，二是为了放映病案进行技术交流等。
上面对有关硬件作了简介，下面就其部件的原理和软件的功能再作进一步说明。整个软件的运行和结构框图如图3和图4所示；实现精子自动检测除了微机图像卡、显微摄像等硬件设备外，软件也是重要的组成部分。在软件系统中除考虑到所需要的模式识别和数学运算算法外，还考虑临床使用的方便，简单易学，灵活性好，适应性强的特点，软件中采用了菜单方式出现的必要的输出输入管理模块。
要特别说明的是本软件对错误的容受力较高，多数情况下，软件对系统中出现的错误(运行错识，输入和输出和系统本身的错误)能够自动识别，并能自动中断程序的执行，显示错误信息，所有这些都是通过系统中的出错管理模块实现的。
本实施例精子检测程序简介如下(一)图像的获取与存储。
由图2可知本系统对精子的检测程序主要包括以下四部分图像的拍摄(获取)和存储，精子的识别，关联运算和运动参数计算。其基本原理是通过一系列的有序图像来描述实际样品(指精子，下文统称样品)的运动情况，如图5所示(以下主要以精子为例进行详细介绍)。
图4所示的连续图像是表示精子由位置1运动到位置5的轨迹序列。
利用所选用彩色图像板的特有功能很方便地实现图像的连续抓拍和存储，现在很关键的是如何准确地实现对精子的识别。
(二)精子的识别从迭加序列图6中可见，利用连续图像判断精子的运动情况，首先关键的问题是能否从图像中准确地识别出精子A和精子B，这属于计算机模式识别的问题，解决此问题要涉及到图像的去噪声处理，图像二值化(去背景)处理，图像中精子特征的提取和匹配(模式识别)等等问题，其关系框图如图5所示。
1、局部背景的计算由于在精液中除了有精子外还存杂质，加之显微光学中光路的不均性，使得记录到的图像呈现出背景明暗不一致的现象，因此以所获得的整幅图采取一个统一阈值模式进行去背景处理就很困难了，往往是某一个具体的阈值仅能实现一部分图像背景的良好分离。
针对这一问题，我们采用了动态阈值的方法，对图像进行运态二值化处理，也就是根据局部图像内部的平均值，来计算我们需要的阈值，使得二值化阈值随局部灰度的变化而变化，这样就可以使整个的图像都能实现精子与背景的良好分离。具体计算局部背景平均值的方法是将现有的800×600图像分割成8×8或4×4象素的小块图像，对每一小块的图像计算其灰度的平均值UUi=164Σk=18ΣI=18U(k,L)]]>或Ui=116ΣK=14ΣI=14U(K,1)]]>其中UI(k，1)为i块子图像块内第(k，1)象素的灰度值，U1为第i块子图像的平均象素灰度值，根据U1的大小，我们就可以确定对应第i块子图像块的二值化阈值大小。
2、二值化阈值的计算在一般情况下，从显微镜下所获得的精子运动图像中，精子的灰度级常常是在一定范围内发生变化的，往往是头部颜色较浅，尾部颜色较浅，头的中部颜色较浅，灰度级较高；四周围颜色较深，灰度级低。此外，由于噪声的影响，精子体本身的灰度级变化也是随机的，特别是牛马精子灰度级的变化更为均匀。为了实现较好的二值化处理效果，本发明在二值化过程中采用了双阈值方法，即采用两个阈值分别对颜钯深和颜色浅的部分进行二值化处理，且两个阈值的使用是有一定的限制关系的，如图7所示。这种双阈值的处理方法具有背景分离和噪声消去双重处理的功能。
3、去噪声处和二值化运算由于各种因素的干扰和图像观测条件的限制，所获得的图像往往是信噪比很低的，其噪声的来源常常是精液中所含有的呈颗粒状的组织块杂质，这种杂质的简单二值化运算中不随背景的分离而消除，这些噪声的存在影响了精图像的均匀连续性，给精子有识别带来很大困难，所以本发明在图像的二值化过程中引入了噪声消除处理。
由于噪声多呈现颗粒状，与精子的尺度相比，它的尺寸一般较小，它的灰度也不像精子图像的灰度那样有明、暗的渐变性，故我们利用这些特点对图像进行去噪声处理，处理的方法是对要处理的图像进行扫描，对每一个被扫描的象素点(k，i)，检测其灰度值U(k，1)及其四周各点灰度值的大小，若满足条件1、该点的灰度值U(k，1)＜阈值T1，该点的灰度值U(k，1)＜T2而且上、下、左、右四点中至少有一点的灰度值＜T1时，则该点为精子图像的象素点，否则该点不是精子图像的象素点(为背景点或噪声点)。
用公式表示上述处理过程分别为第一步若U(k，1)＜T1，则点(k，1)可能为噪声或精子图像点，若U(k，1)＞T1，则点(k，1)可能为背景点或精子图。
第二步对所有U(k，1)＜T1的点进行检测若U(k+1，1)＞T2且U(k-1，1)＜T2且U(k，1-1)＜T2，则点(k，1)为噪声点。
第三步对所有被确定为精子图像点的象素点(k’，1’)若U(k’-1，1’)＜T2，则点(k’+1，1’)为精子图像点(边缘点)。
U(k’-1，1’)＜T2........(k’-1，1’)......
U(k’，1’+1)＜T2........(k’，1’+1)......
U(k’，1’-1)＜T2........(k’，1’-1)......
第四步是否所有的精子图像点都已找出。
是则结束，不是则重复第三步骤。
经过这样的处理之后，图像中的颗粒性噪声被消除了，而精子的图像也因噪声被消除而保证了较好的均匀连续性。另外，由于以阈值法的采用，也使精子图像的轮廓有了较完整的保留。
4、边界提取在图像经过二值化处理后，下一步是如何将图像中分离出的轮廓(这些轮廓有些是精子的轮廓，有些可能不是精子轮廓)进行边界跟踪(也就是边界提取)。即通过跟踪图像中的灰度变化点得到所需要的轮廓曲线，这些轮廓曲线便是我们进行精子形状识别和精子位置参数提取的依据。
边界提取的方法有多种，本发明所采用的是方向链码方法，链码的方向定义如图8所示。
踊跃时采用右手摸墙准则，在跟踪过程中，设当前要查寻得到的方向为direction，而前一个方向为before-direction，对于before-direction取不同的值时，要顺序查找的方向为
起始方向的选择与具体的扫描方式有关，由于我们所采用的是从下向上的扫描方式，故将起始方向设为before-direction＝2。
5、位置参数的计算图9是本发明用边界跟踪方式得到的精子轮廓，对这一轮廓，我们需要选择精子某一部位中的某一点来计算精子移动的位置参数，因为精子的头部，一方面代表了精子生命的关键物质所在，另一方面，精子在运动过程中头部的形状变化比尾部变化要小得多，明显得多。
在实际工作中，位置的选择是利用求平均法得到的，也就是位置点(Cx，Cy)可通过下面两式求出Cx=12(Xmax+Xmin)]]>Cy=12(Ymax+Ymin)]]>其中Xmax和Xmin，Ymax和Ymin分别代表了精子轮廓跟踪过程中所获得的最大和最小边界坐标值。为了保证这一位置，参数能够落在精子头部的范围内，我们采取了两个措施，第一，选择合理的二值化阈值，使得图像在经过二值化处理后，精子头部的图像得到了完整的保留，而尾部图像不一定全部保留，只保留接近头部附近的图像，以示和其他杂质图像的区别。第二，在实施边界跟踪时，通过计算跟踪线各点的曲率，而求其精子部和尾部位置。对其尾部位置进行部分删除，对中心点的计算主要是头部边界和尾部局部边界跟踪来进行。
6、数量的统计在图像完成边界跟踪之后，也就是已确定了所采集精子样本的数量，有多少条跟踪线，就有多少个精子样本被采集到。利用计算机强有力的累计计算功能，可很快地求出其数量的多少。但应当指出利用摄像机(CCD)采集显微镜下的精子数与实际视场内有的精子数相比，存在一定的差异，这种差异的大小与精子的实际运动速度是相关的，这只能通过大量的实验来确定其差异的大小。
三、关联运算据前所述，精子运动的情况是通过一系列有序的图像来描述的，对这一序列图像中的每一幅分别进行精子识别运算，便可得到一系列的精子位置参数组(这些参数组也是有序的)，每一组参数都一一对应于有序图像序列中的一幅精子图像，显然，这每一组位置参数之间也是存在有一定的相互关系的。如第二组中的各位置参数分虽对应于第一组中各位置参数上精子的下一步位移，找到了这种对应关系，也就找到了位移曲线。所谓关联运算也是寻找各组位置参数之间的这种对应关系的运算。
关联运算的核心是三个基本准则距离准则、速度准则和方向准则。
1、距离准则由图10所示，图(1)中某一精子a的位置(参数)为A(即用参数A来记录精子a所在的位置点。在下面的论述中还会提到“位置A”，即表示由参数A所表示的那一位置点)，图(1)的相邻后续图像为图(2)，其中有B1、B2和B3三个位置与图(1)中的位置A相接近，那么B1、B2、B3哪一个参数所对应的位置可能是精子a所对应的下一位置呢？(我们称这一位置为预测位置)，根据连续拍摄过程中的图像时间间隔和精子运动速度的大致上限，在位置A的附近确定一个区域，例如，以位置A为中心，r为半径所划的圆形区域(如图(2)所示)。后续图像中，落在这个区域之内的位置点，如B1、B3位置占，则可能成为精子a的预测位置点，而位置B2则不是精子a的预测位置点，这种确定方式即为距离准则，它把所要处理的位置参数划分为可能预测位置点参数和非预测位置点参数两大类。如用数学表达式描述则为设{Ai|i＝1，2.......，I}为某一位置参数组，{ai|i＝1，2......I}为所对应检测精子的集合，{Bi|j＝1，2....，J}为参数组{Ai}的相邻后续参数组，r＝拍摄时间间隔Δtx精子速度上限Vmax，r称为距离准则的判别半径。
距离准则可描述为对于{Ai}中的某一个元素AkKAk∈{1，2....I}，计算距离d＝D(Ak，Bj)‖j＝1，2....，J，若d＜r，则Bj为精子aI的可能预测位置点参数，若d＞r，则Bj为精子aI的非预测位置点参数，若D(Ak，Bj)表示位置Ak与位置Bj之间的距离。
2、速度准则当以判定半径r所限定的范围内出现多个可能的精子预测位置时，(如图10中图(2)的B1和B3位置)，对第一个可能预测位置下的瞬时运动速度进行预测，取其中速度变化最小的那个可能位置为精子的预测位置，这就是速度判定准则。
设精子a所具有初即速度为VA，对应于预测位置B1可以求出相应的瞬时速度为VB3＝D(A1B3)/Δt，于是精子a的预测位置B为B＝Bi，且Bi∈{B1，B3}，VA-VBi＝min(VA-VBi，VA-VB3)。
3、方向准则首先我们对精子运动的方向性做出定义，那规定精子在图像平面内运动具有十六种不同的运动方向，如图11所示对于每一个运动方向，我们也规定了一个数字作为该方向的值。当精子处于静止状态时，我们定义为运动方向值是“16”。
所谓方向准则是当根据速度准则确定了某一精子a的预测位置之后，对该预测位置下的精子运动方向值进行计算。若计算所得的方向值与精子a原有的运动方向值相比，变化在某一范围之内，则该预位置确为精子a的预测位置，否则变化不在某一范围之内，该位置就不是精子a所预测位置。用公式表示这一方向准则倒便是设精子原有的运动方向为SA，由预测位置B所计算所得的运动方向是SB，再设定运动方向的变化阈值为ΔS，于是又有
若|SB-SA≤ΔS|或|(SB-SA)mod16|≤ΔS成立，则位置位置S是所要求的预测位置，否则就不是预测位置。
4、最小距离准则当采用速度准则和方向准则不能产生出精子a的确切预测位置时，我们又选择了最小距离准则作为最后确定精子预测位置的计算依据。所谓最小距离准则也即已知精子a的位置为A，还知精子a的可能预测位置集合是{B1＝1，2.....L}，对所有的I值，计算距离D(A1B1|L＝1，....L)的预测位置。精子a的预测位置B为B＝Bi|D(A1B1)＝min[D(A1B1)]作出以上准则规定的基础是一个正常运动的精子，在没外界因素的影响下，精子运动的瞬间速度和瞬时方向都不可能发生较大幅度的跳变，这种非跳变的特点表现为精子的运动曲线是一条平滑的曲线，如图12所示。
当精子的运动受到外界影响发生碰撞时，或当精子处于不正常状态时，精子的运动速度和其方向都将发生较大幅度的变化，而这时精子运动的瞬时速度往往较小，这也是我们采用最小距离准则的原因。
5、关联运算的流程图前四个问题是介绍了关联运算中的几个准则，下面将给出关联运算的流程图，如图13所示。
从流程图中可见，在利用上述几个判别准则对精子运动的关联性进行计算后，还要对计算结果进行重叠位置检测和重叠位置消去运算。这是因为在经过速度准则和方向准则的判断之后，每一个精子都有了其相庆的预测位置，而这些预测位置有可能出现相同的(即两个或＜2820880＞0误判而出现的重叠现象)。重叠检测和重叠位置消去运算的处理方法是这样的，如图14所示。
在经过重叠性和重叠位置消去处理之后，精子运动检测的关联性运算就结束了，接下来就是计算精子运动的参数指标了。
四、运动参数计算在图13所示的关联运算流程图中，有一个位置参数重新排序步骤，这一排序步骤的引入，使得各位置参数组之间的对应关系表现为各参数之间的序号对应(例如，第一组的第一号参数对应于第二组的第一号参数，对应于第三组的第一号参数，.......，对应于第N组的第一号参数)，这使得我们可以根据位置参数和这种简单的对应关系，方便地描绘出精子运动的轨迹，计算出有关的运动参数。设我们已知的位置参数(经过关联运算处理后的参数)集合为{A1(j)}，其中I＝1，2........N为位置参数的组号，j＝1，2.....J，是每组中的位置参数的个数序号，也即对应的精子的序号。显然，这位置参数集合描述了J个精子{aj|j＝1，2.....，J}的运动轨迹。由于我们已知各组位置参数之间的关系是依据序号排列的，所以有关精子运动的一系列参数也根据序号j所确定的关系来描述。
(1)精子运动的轨迹将位置点Ai(j)随I的变化连接起来，就得到了所要求的精子aj的运动轨迹。显然，随j＝1到j＝J的变化我们可以得到一共J条精子运动轨迹曲线。
(2)精子运动的线速度V(j)[Σj=1N-1(D(Ai(j),Ai+1(j)))]/[(N-1)Δt],j=1,2......J]]>该线速度反映了精子运动的线位移与时间的比值。
(3)精子运动的直线速度V(j)D(AI(j)，An(j))/[(N-1)Δt]，j＝1，2......，J该直线速度反映了精子沿某一方向前进的强度。直线速度大，表明该精子前进快，直线速度小，说明精子前进速度小。
(4)精子运动线平均速度和直线平均速度V=1JΣJ=1JV(j)]]>V线反映了精子运动速度的平均情况。V=1JΣJ=1JV(j)]]>V直反映了精子运动的平均前进情况。
(5)精子运动线性速度差和直线速度方差δV2=1JΣj=1J(V(j)-V)2]]>δV2=1JΣj=1J(V(j)-V)2]]>这里以二阶中心矩代替样本修正方差，只要其中的精子个数J为足够大即可。
(6)精子运动的活率百分比定义精子运动的速度阈值Vr，当精子的运动速度V线＞Vr的精子的个数占所检验的精子总数的百分之几，即被称为是精子运动的活率百分比。
(7)精子浓度(即样本溶液的精子浓度)精子浓度＝(精子总数C/所观测的样本体积V)×(稀释比d)-1。
在以上所介绍的本实施例装置从图像的获取一直到动静态检测结果的输出。由图15给出也全貌例如在图中(1)部分的内容包含在图5、图6、图10和图13；(2)部分的内容包含在图7、图8及图9；(3)部分的内容包含图11、图12及图14。
本发明与以往的检测装置最根本的区别在于1、硬件上全部改为彩色系统，显微镜由原来国产的改为放大倍率更高、性能更强的进口显微镜。2、本装置为提高静态分析的功能，除了硬件上有大的改动外，在软件上又作了较大的补充，使整个装置分成两个软件包。
本发明荧光精子染色实施例1.试剂的配制用pH5的缓冲液配制0.01％的吖啶橙荧光色素溶液，并将其放入-20℃低温冰箱中保存待用。试剂B采用Molec.Probe.Eugene.Oregon.USA死活精子染色试剂中的B液。
2.染色的步骤取待检精液，待新鲜精液液化后吸取100μl精液放入洁净试管中，加入1μl试剂A和1μl试剂B后充分混匀，于37℃放置5分钟，吸取10μl的染色精液加入makler板中，置显微镜下检测。
本发明的荧光染色方法，使活精子在荧光激发下呈绿色，死精子呈红色，其余任何分泌物与杂质都不着色，再通过软件识别方法，可使检测的准确度大大提高，使其检测的功能加以拓宽，特别是对精子的形态分析提供了方便和准确性，使精子的自动检测系统得以根本改善。
本发明的特点其一、利用染色法，在荧光激发下使活精子呈绿色，死精子呈红色，而精液中的任何杂质、分泌物、组织块都不着色，且又不影响精子活力，这样就解决了检测系统最大的困扰，如何去杂质，只检测精子的最大难题之一；其二、由于只有精子着色，这样对精子的形态分析也提供了极大方便，这就解决了检测系统中最大难题之二；其三、由于样品带有不同的颜色，在软件分析识别中也利用了一种进行识别使其识别精度大大提高，从而使其检测系统的操作更加简单实用准确；其四、由于死活精子颜色分明，使检测报告一屏齐全，为精子的活率、存活率运动轨迹等等一目了然；其五、由于本系统的硬软件相应有较大的改变，使本系统的应用功能有较大的展宽，不仅仅可检测分析精液，而且还可以用于性病方面的研究，病理方面的诊断，这也是常规方法所不及的，也就是说，应用领域更加广阔。
权利要求
1.一种精子荧光染色计算机检测系统，包括将检测样品的动静态图像随机拍摄下来的显微摄像部件；将所说的显微摄像部件发送来的图像信号进行识别预处理贮存，并进一步将成熟的信号送到教育处机中的图象采集部件；在软件的控制下完成对图像卡送过来的随机信号进行一系列运算处理和结果的输出以及进行人机对话的病案的教学、学术交流的微机处理部件；图像贮存及病案管理(VCD)部件、显示打印部件，其特征在于所说的系统用计算机控制下的图像卡实现对显微镜下经荧光染色的精子运动图像或静态图像进行随机连续拍摄，并将所获得的图像序列暂存在图像卡和计算机存贮单元中，然后图像卡和计算机对每一幅图像进行精子的识别，关联运算和运动参数计算，求出各位置参数之间的关联关系，由此关系参数求解出样品运动的轨迹，最后从这些轨迹计算出样品运动的各项参数，从而确定精子的活率、存活率并将其输出到显示器、存储器或打印机。
2.如权利要求1所说的精子荧光染色计算机检测系统，其特征是所说的精子的识别，是采用动态阈值的方法，对图像进行运态二值化处理和计算，即将现有的800×600图像分割成8×8或4×4象素的小块图像，对每一小块的图像计算其灰度的平均值UUi=164Σk=18ΣI=18U(k,L)]]>或Ui=116ΣK=14ΣI=14U(K,1)]]>其中UI(k，1)为i块子图像块内第(k，1)象素的灰度值，U1为第i块子图像的平均象素灰度值，根据U1的大小，确定对应第i块子图像块的二值化阈值大小；对要处理的图像进行扫描，对每一个被扫描的象素点(k，i)，检测其灰度值U(k，1)及其四周各点灰度值的大小，按照条件该点的灰度值U(k，1)＜阈值T1，该点的灰度值U(k，1)＜T2而且上、下、左、右四点中至少有一点的灰度值＜T1进行判断，灰度值＜TI时，则该点为精子图像的象素点，否则该点不是精子图像的象素点。
3.如权利要1求所说的精子荧光染色计算机检测系统，其特征是所说的关联运算是一种寻找各组位置参数之间对应关系的运算，按照距离准则、速度准则、方向准则进行；距离准则对于{Ai}中的某一个元素AkKAk∈{1，2....I}，计算距离d＝D(Ak，Bj)‖j＝1，2....，J，若d＜r，则Bj为精子aI的可能预测位置点参数，若d＞r，则Bj为精子aI的非预测位置点参数，其中{Ai|i＝1，2.......，I}为某一位置参数组，{ai|i＝1，2......I}为所对应检测精子的集合，{Bj|j＝1，2....，J}为参数组{Ai}的相邻后续参数组，r＝拍摄时间间隔Δtx精子速度上限Vmax，r称为距离准则的判别半径；速度准则当半径r所限定的范围内出现多个可能的精子预测位置时，对第一个可能预测位置下的瞬时运动速度进行预测，取其中速度变化最小的那个可能位置为精子的预测位置，即B＝Bi，且Bi∈{B1，B3}，VA-VBi＝min(VA-VBi，VA-VB3)，其中a为精子，VA为初即速度，B为预测位置，VB3＝D(A1B3)/Δt为瞬时速度；方向准则若|SB-SA≤ΔS|或|(SB-SA)mod16|≤ΔS成立，则位置位置S是所要求的预测位置，否则就不是预测位置其中SA为精子原有的运动方向，SB为由预测位置B所计算所得的运动方向，ΔS为再设定运动方向的变化阈值为。
4.如权利要1求所说的精子荧光染色计算机检测系统，其特征是所说运动参数计算包括(1)精子运动的轨迹将位置点Ai(j)随i的变化连接起来，得到所要求的精子aj的运动轨迹，随j＝1到j＝J的变化得到一共J条精子运动轨迹曲线；(2)精子运动的线速度V(j)[Σj=1N-1(D(Ai(j),Ai+1(j)))]/[(N-1)Δt],j=1,2......J]]>(3)精子运动的直线速度V(j)D(AI(j)，An(j))/[(N-1)Δt]，j＝1，2......，J(4)精子运动线平均速度和直线平均速度V=1JΣJ=1JV(j)]]>V=1JΣJ=1JV(j)]]>(5)精子运动线性速度差和直线速度方差δV2=1JΣj=1J(V(j)-V)2]]>δV2=1JΣj=1J(V(j)-V)2]]>
5.一种精子荧光染色方法，其特征在于使用了下述的试剂A试剂A是以pH3～7.8的缓冲液或生理盐水或双蒸水配制的浓度为0.001～0.5％的吖啶橙荧光色素。
6.如权利要1求所说的精子荧光染色计算机检测系统，其特征是所说系统还包括对被检样品进行加热、保温及防尘的恒温防尘部件。
全文摘要
荧光染色标本计算机检测系统及其在精液检测中的应用,用计算机控制下的图像卡实现对显微镜下的精子的图像或进行随机连续拍摄,而后进行识别、关联运算和运动参数计算,确定其活率、存活率;其荧光染色方法,可使活精子在荧光激发下呈绿色,死精子呈红色,其余任何分泌物与杂质都不着色,解决了检测系统去杂质,分析精子形态不易的难题,不仅可检测分析精液,而且还可以用于性病方面的研究,病理方面的诊断。
文档编号G01N1/30GK1385700SQ01106690
公开日2002年12月18日 申请日期2001年5月10日 优先权日2001年5月10日
发明者熊承良, 宋传琳, 马玉兰, 尚学军, 宫黄涛, 任燕春 申请人:华中科技大学同济医学院, 清华同方股份有限公司