专利名称：Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测试剂盒及其制备方法，本发明还涉及一种Bt晶体蛋白放射免疫检测方法。
背景技术：
转Bt基因植物具有很好的抗虫性，所以Bt基因被广泛地转入棉花、玉米等农作物中。Bt晶体蛋白是转Bt基因生物的Bt基因表达产物，是鉴定抗虫性的重要指标，其快速、准确测定，为育种、转基因植物的虫害管理和基因标识提供技术支撑。
现有技术所用的酶联免疫检测Bt晶体蛋白方法存在如下的缺陷1、检测结果不稳定，因酶促反应易受反应条件的影响，；2、反应时间长，测样时间长达24小时以上(包括包被时间)；3、操作步骤多，较为繁琐。
放射免疫法检测Bt晶体蛋白，虽测定结果稳定，但传统放射免疫法需离心分离抗原-抗体复合物，操作繁琐，且检测时间最短也需3小时。现有的较新技术放射免疫法抗原抗体反应是在固相界面进行，不需离心，但是反应时间比传统放射免疫方法还长。
因此，现有技术的检测Bt晶体蛋白方法均不能达到快速、简便的要求。
发明内容
本发明的目的是建立一种快速、简便的Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测方法，并提供一种快速、简便的Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测试剂盒。
本发明提供了一种用于检测Bt晶体蛋白CrylAc的放射免疫检测试剂盒，该盒包括有磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体和磁性微粒联接的羊抗兔IgG。
所述检测试剂盒中还包括本领域技术人员进行Bt晶体蛋白放射免疫检测所用的其它常规试剂，如Bt晶体蛋白CrylAc标准溶液、125IBt晶体蛋白CrylAC、质量控制样品及蛋白提取液等。
上述用于检测Bt晶体蛋白CrylAc的放射免疫检测试剂盒的制备方法如下1、制备超顺磁微粒，并与Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体联接，提供磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体；2、制备磁性联接羊抗兔IgG，形成磁性微粒联接的羊抗兔IgG；所述磁性微粒联接的Bt晶体蛋白的制备方法是将Aerosol604的戊二醛溶液与Fe3O4水溶液混合，将混合液调制为碱性，离心得到100nm微粒；将所得微粒经过戊二醛活化后再离心，将所得沉淀物与Bt晶体蛋白CrylAc抗血清混合、再经离心得到磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体；所述磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备方法是将Aerosol604的戊二醛溶液与铁粉溶液混合，将混合液调制为碱性，离心得到100nm微粒；将所得微粒经过戊二醛活化后再离心，将所得沉淀物与羊抗兔IgG混合、再经离心得到磁性微粒联接的羊抗兔IgG。
其中磁性微粒联接的Bt晶体蛋白和磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备中，所述碱性为pH10-12。所述将混合液调制为碱性后，进行氮气脱氧后振荡，使反应均匀、完全。
上述检测试剂盒中其它成分均为本领域公知的Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测所用的其它常规试剂，可以外购或按文献配制，详见实施例。
将所述检测试剂盒中所有成分按一定量装入盒中，即可。
用本发明的检测试剂盒进行Bt晶体蛋白放射免疫检测的方法是，在若干放射免疫管中分别加入待测样品、Bt晶体蛋白CrylAc标准溶液和质量控制样品，然后对每一放射免疫管分别进行如下操作1.加入上述磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体；2.加入125I-Bt晶体蛋白CrylAc，混匀；3.将放射免疫管放置在磁分离器的管架上，连接磁分离器底部磁铁25分钟，再移走磁铁；4.加入上述磁性微粒联接的羊抗兔IgG，振荡摇匀。再连接磁分离器底部磁铁5分钟；5.倒出溶液，加缓冲液冲洗一次后测沉淀放射性计数(cpm)；6.计算各管的结合率，作标准曲线，根据标准算出待测样品的含量。
在外加磁场的作用下，所制备的超顺磁颗粒吸附抗体，可加速与抗原的免疫反应，反应时间30分钟可达到平衡。
免疫反应平衡后，在反应容器底部放置磁铁，磁二抗(磁性联接羊抗兔IgG)可与抗原-抗体复合物(Bt晶体蛋白CrylAc抗原与Bt晶体蛋白CrylAc抗体复合物)结合并自动沉淀，不用离心即可进行分离。
本发明在现有的放射免疫检测技术的基础上进行改进，所建立的检测方法和检测试剂盒可提高抗原抗体反应速率，减少测样时间，测定时间小于40分钟(达到免疫反应平衡时间30分钟)。本发明操作简便，抗原-抗体复合物为液-液反应，且分离时无需离心；制样简单蛋白只需粗提，不用离心分离。种子样品不用去酚和脱脂。
具体实施例方式实施例11、Bt晶体蛋白CrylAc的提取、纯化培养基液体LB(参见金冬雁等翻译，原著J.萨姆布鲁克，1992。分子克隆实验指南第二版，科学出版社)Tryptone1％，Yeast extract 0.5％，NaCl1％，pH7.0，15磅，20min。
液体Z氏(参见左雅慧等，1999，几种Bt培养基的筛选和晶体蛋白纯化方法初探，植物保护，25(3)，31-31)蛋白胨1％，酵母粉0.2％，可溶性淀粉0.3％，葡萄糖0.2％，K2HPO40.1％，KH2PO41％，CaCO30.2％，pH7.0，15磅，20min。活化菌株挑取单菌落(HD-73)于LB液体培养基中，37℃，200rpm，摇瓶培养20-24小时。提取步骤按1％的接菌量将活化的菌液转接Z氏液体培养基中，37℃摇瓶培养36-48小时。离心，5000rpm，5min，收集所有菌体，Na2CO3裂解4-6hrs，0℃；aAc沉淀4hrs，0℃；离心，12000rpm，10min，4℃；收集沉淀，加适量Na2CO3溶解沉淀，0℃；DS-PAGE电泳定量检测，获得BtCry蛋白(130KD)Trypsin酶解BtCry蛋白取1mlBt Cry蛋白液，按蛋白Trypsin＝50∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解8小时得到酶解产物(Bt Cry蛋白的毒素部分60KD)。
BtCry蛋白的活性检测BtCry蛋白对小菜蛾、棉铃虫均有较高的杀虫活性。
2、抗血清制备把Bt蛋白配制成0.6mg/ml溶液，加等量福氏完全试剂乳化，在新西兰白兔背部皮内多点注射，每两周加强免疫一次，免疫剂量减半，二个月后静脉取血，用放射免疫法测定抗血清。当抗血清滴度达到1∶5000以上时，可全部取血，取血清，离心进行纯化。(所得抗血清滴度1∶10000)3、标准配置取纯品Bt晶体蛋白CrylAc，用缓冲液配成标准系列0，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml。
4、超顺磁微粒的研制与抗体联接(1)用戊二醛将Aerosol604配成1％。溶液。
(2)用少量蒸馏水溶解一定量Fe3O4粉末，加入100ml上述溶液中。混合液置入一个带盖的溶液中，滴加10N NaOH至pH11。
(3)用氮气使其脱氧后，将容器盖紧，并将其放到振荡器中。
(4)在室温下振荡24小时，每隔一定时间用10N NaOH调节pH，使维持pH11。
(5)将混合物对水充分透析。
(6)以2000×g离心30分钟，使微粒沉淀。
(7)将微粒悬在蒸馏水中。
(8)加入戊二醛，使微粒活化1小时。
(9)离心，弃上清，加入抗血清(Tris-HCl缓冲液稀释)，在室温下作用8小时。
(10)离心，弃上清，用PBS洗涤，用BSA液封团未被联接的区域。
(11)去除BSA液，洗涤。在4℃下保存。
5、磁分离剂研制制备方法同4相似，只是把3％的铁液代替Fe3O4溶液，用羊抗兔IgG代替抗血清。
6、Bt晶体蛋白CrylAc的125I标记将185MbqNa125I与100μl的Bt晶体蛋白CrylAc溶液(30μ)，用氯胺T法标记，经凝胶层析分离，收集125I-蛋白峰。用0.1M，pH7.4PBS稀释至200μl中含有2000cpm。
7、组装(1)抗体最适量的确定选取结合率为50-60％时的抗体浓度为实用浓度；(2)标准调制按表1顺序加样(从左至右)，用对数纸作结合率-浓度曲线，求相关系数。
当相关系数小于0.9990时，调整标准浓度。
表1加样顺序 (单位μl)
(3)把抗体、125I标记抗原、分离剂、标准和质控(由纯品配制，浓度分别为10ng/ml，400ng/ml和1000ng/ml)，放置包装盒内。
实施例2试剂盒组成1.Bt晶体蛋白CrylAc标准溶液(0.05M磷酸缓冲液pH7.4)系列，浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、1ng/ml和0ng/ml，共7瓶，各1ml。
2.磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体溶液(Tris-HCl缓冲液)一瓶，10ml。兰色。
Bt晶体蛋白CrylAc抗体的制备参见文献(李振甲韩春生王建勋主编，实用放射免疫学。科学技术出版社pp21-40)。
磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体的制备Aerosol 604的1％戊二醛溶液与Fe3O4水溶液混合，并调制为一定的pH后，经氮气脱氧后振荡24小时(保持pH)，对水透析、离心，得到100nm微粒。微粒经过戊二醛活化后离心，沉淀物与Bt晶体蛋白CrylAc抗血清(Tris-HCl缓冲液)混合，在室温下作用8小时。经离心、磷酸缓冲液洗涤、牛血清白蛋白封闭即得。
3.125I Bt晶体蛋白CrylAC一瓶，10ml，红色，每100μl放射性活度约20000cpm。制备方法参见文献(李振甲 韩春生 王建勋主编，实用放射免疫学。科学技术出版社pp41-59。
4.磁分离剂(磁性微粒联接的羊抗兔IgG)一瓶，100ml，黑色。其主要成分为磁性微粒联接的羊抗兔IgG。
羊抗兔IgG购自北京欣经科生物技术有限公司，产品号10227。
磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备Aerosol 604的1％戊二醛溶液与铁粉溶液混合，并调制为一定的pH后，经氮气脱氧后振荡24小时(保持pH)，对水透析、离心，得到100nm微粒。微粒经过戊二醛活化后离心，沉淀物与羊抗兔IgG(Tris-HCl缓冲液)混合，在室温下作用8小时。经离心、磷酸缓冲液洗涤即得。
5.质量控制样品，低、中、高浓度各1瓶，各1ml。
由Bt晶体蛋白CrylAc阳性和阴性质量控制标准样品(Agdia公司，阳性质量控制样品LPC05200(货号)及阴性质量控制样品LNC05200)配制。
6. 蛋白提取液一瓶，200ml(1L蒸馏水中含有无水碳酸钠2.66g、氯化钠2.92g和Vclg，自行配制，用于测样时样品的蛋白粗提)
实施例3测样过程1.样品采集和蛋白粗提取籽粒或新鲜叶片1g，加入蛋白提取液(1L蒸馏水中含有无水碳酸钠2.66g、氯化钠2.92g和Vclg)2ml，研磨成匀浆，转移到小试管中，稍微甩一下，静止5分钟。吸取上清液待测。
2.操作程序1)在塑料试管上编号，包括非特异管(NSB)、零结合管(S0)、标准管(S1-S6)、质控管(Qcl，2，3)，样本管(U)，以上试管必须双管标号。
2)向NSB管加入200μl零标准品，S0管加入100μl零标准品，向其它试管加入100μl相对应的标准、质控或样本。
3)向除了NSB管之外的所有试管中加入100μl微粒联接抗血清。
4)向所有试管中加入100μl125I-Bt晶体蛋白CrylAc，混匀，任取三管测放射性计数，取其平均值作为总放射性计数(T)。
5)把所有试管置于磁分离器的上层管架上，连上磁分离器底部磁铁，37℃放置25分钟。移走底部磁铁。
6)向所有试管中加入1.0ml磁分离剂，振荡摇匀。再连上磁分离器底部磁铁，5分钟。
7)倒出溶液，加缓冲液冲洗一次。测沉淀放射性计数(cpm)。
3.结果计算1)计算每对试管(T、NSB、B0、B)的平均计数，净计数＝平均cpm-本底计数2)非特异结合率和最大结合率分别为NSB/T×100，(B0-NSB)/T×1003)各标准管、样本管结合率为B/B0％＝(B-NSB/B0-NSB)×100，其中B＝标准管(或样本管)双管计数的均值，B0＝零标准(S0)双管计数的均值，NSB＝非特异双管计数的均值。
4)以上各标准碘的B/B0％为纵坐标，以标准点浓度为横坐标，在Logit-Log双坐标纸上作标准曲线。
5)根据待测样本的结合率，从标准曲线上查出相应的样品Bt蛋白含量。
表2不同免疫反应时间下的测定效果
注1.免疫反应时间在30分钟时，结合率、质控测定值在允许范围内。
2.分离无需离心。
3.分析灵敏度为0.5ppb(0.5ng/ml)。
4.反应温度为37℃。
实施例4与酶联免疫法相比较进行Bt晶体蛋白CrylAc测定分别用本发明的方法与现有酶联免疫方法测定了玉米和棉花样品中Bt晶体蛋白Cry1Ac含量，并进行了比较。
实验目的检查本发明方法及试剂盒的检测结果的准确性；测定方法1、样品的提取，同实施例3测样过程1.样品采集和蛋白粗提；2、酶联免疫法的测定依照Bt晶体蛋白CrylAc试剂盒(Agdia公司，货号PSA05200/0096)说明书进行；3、本发明方法的测定步骤同本发明实施例3中的2.操作顺序；结果见下表。
表3玉米和棉花Bt晶体蛋白CrylAc测定结果
从表中数据可看出阴性样品用本发明方法测定的结果为阴性，阳性样品用本发明方法测定的结果为阳性，并且两种方法测定样品含量的数据无显著性差异。
结论本发明方法测定结果与酶联免疫法相符。
权利要求
1.一种用于检测Bt晶体蛋白CrylAc的放射免疫检测试剂盒，该盒包括有磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体、磁性微粒联接的羊抗兔IgG及用于Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测所用的常规试剂。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒的制备方法，其中所述磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体的制备方法是将Aerosol 604的戊二醛溶液与Fe3O4水溶液混合，将混合液调制为碱性，离心得到100nm微粒；将所得微粒经过戊二醛活化后再离心，将所得沉淀物与Bt晶体蛋白CrylAc抗血清混合、再经离心得到磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体；所述磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备方法是将Aerosol604的戊二醛溶液与铁粉溶液混合，将混合液调制为碱性，离心得到100nm微粒；将所得微粒经过戊二醛活化后再离心，将所得沉淀物与羊抗兔IgG混合、再经离心得到磁性微粒联接的羊抗兔IgG。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒的制备方法，其中磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体和磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备中，所述碱性为pH10-12。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒的制备方法，其中磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体和磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备中，将混合液调制为碱性后，进行氮气脱氧后振荡。
5.一种Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测方法，其步骤是，在若干放射免疫管中分别加入待测样品、Bt晶体蛋白CrylAc标准溶液和质量控制样品，然后对每一放射免疫管分别进行如下操作1)加入磁性微粒联接的Bt晶体蛋白CrylAc抗体；2)加入125I-Bt晶体蛋白CrylAc，混匀；3)将放射免疫管放置在磁分离器的管架上，连接磁分离器底部磁铁25分钟，再移走磁铁；4)加入磁性微粒联接的羊抗兔IgG，振荡摇匀，再连接磁分离器底部磁铁5分钟；5)倒出溶液，加缓冲液冲洗一次后测沉淀放射性计数(cpm)；6)计算各管的结合率，作标准曲线，根据标准算出待测样品的含量。
全文摘要
本发明提供了一种Bt晶体蛋白Cry 1Ac放射免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。本发明用戊二醛、Aerosol 604和四氧化三铁制备磁性微粒，并与Bt晶体蛋白Cry 1Ac抗体连接，在磁场下Bt晶体蛋白Cry 1Ac与Bt晶体蛋白Cry 1Ac抗体特异反应加快，测样时间缩短到40分钟。本发明还用磁性微粒连接IgG制备免疫分离剂，在磁场的作用下，抗原抗体复合物自动沉淀，不需离心即可分离。
文档编号G01N33/68GK1501082SQ0214881
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月18日 优先权日2002年11月18日
发明者潘家荣, 张维, 张 杰, 乔艳红, 宋平, 李锦波, 林敏 , 黄大昉 申请人:中国农业科学院原子能利用研究所