专利名称：新孢虫的血清学检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及用受试血清与能和新孢虫(Neospora caninum)反应的蛋白质作用的方法进行新孢虫感染的血清学检测。
背景技术：
在许多种动物中新孢虫和刚地弓形体(Toxoplasma gondii)是密切相关的致病的原生动物寄生虫。新孢虫已经被认为是牛和其他动物流产，神经学相关的肢体缺陷和新生儿死亡率的原因。刚地弓形体是绵羊流产的常见原因。有效的控制新孢虫病和弓形体病需要快速诊断。因此开发有效的针对新孢虫的诊断试验是重要的。
有几种本领域已知的试验能够判断动物是否已经暴露过新孢虫。但是，迄今没有开发出可以区分新孢虫天然血清阳性动物和新孢虫接种动物和/或新孢虫血清反应阴性(未接种)动物的诊断试验和方法。
发明概述本发明首次提供一种区分新孢虫天然血清阳性动物和新孢虫疫苗接种过的动物的方法。本发明也提供用血清学测定判断动物是否已感染新孢虫的方法。
本发明一方面提供检测血清样品中新孢虫抗体的方法，其通过将血清与刚地弓形体蛋白接触并检测血清中结合抗体的存在。
附图简述
图1显示对截短的BAG1-GST的Western印迹反应泳道1抗全长BAG1-GST的兔抗血清(阳性对照)泳道2天然的( )血清反应阴性母牛的血清(阴性对照)泳道3新孢虫灭活疫苗免疫49天的母牛的混合抗血清泳道4新孢虫减毒疫苗免疫49天的母牛的混合抗血清泳道5自然感染的血清反应阳性的母牛的混合抗血清泳道6分子量标准(kDa)图2显示对截短的和全长的BAG1-GST的Western印迹反应泳道1-4截短的BAG1-GST抗原泳道5分子量标准(kDa)泳道6-9全长BAG1-GST抗原泳道1，6天然的血清反应阴性母牛的血清(阴性对照)泳道2，7新孢虫灭活疫苗免疫119天的母牛的混合抗血清泳道3，8新孢虫减毒疫苗免疫119天的母牛的混合抗血清泳道4，9自然感染的血清反应阳性母牛的抗血清泳道5分子量标准(kDa)发明详述本发明提供一种测定系统，其能够区分接种的和自然暴露于新孢虫的血清反应阳性动物。依照本发明，已经发现刚地弓形体和新孢虫的蛋白只存在于天然血清反应阳性的动物中。以本发明方法提供的测定结果为基础，现在可以将新孢虫血清反应阴性的动物及以前用新孢虫为基础的疫苗接种过的动物(参见例如，美国序列第09/260,414号“减毒活新孢虫疫苗”，在此引入以作参考和美国序列第09/138,985号“新孢虫疫苗”，在此引入以作参考)与血清反应阳性(即天然暴露的)动物可靠地区分和隔离。
暴露过新孢虫的动物的血清会与刚地弓形体和新孢虫蛋白以及它们的片段反应。“反应”意思是形成可检测到的抗原-抗体复合物。抗原抗体复合物的形成是预示着动物天然感染了新孢虫。以前接种过新孢虫的动物的血清和天然新孢虫血清反应阴性的动物的血清不会与刚地弓形体和新孢虫蛋白以及它们的片段反应。因此，本发明提供区分接种过(血清反应阴性)和天然暴露于新孢虫-血清反应阳性的动物的方法。
而且，依照本发明，如果希望，可以基于本发明的测定结果对新孢虫血清阳性动物进行接种。本发明所考虑的动物包括牛(cattle)，小牛(calves)，公牛(bulls)，母牛(cows)和阉牛(steer)。优选地，将本发明的方法应用于母牛，最优选，应用于小牛。
按照本发明，源于刚地弓形体或新孢虫的任何纯化的，天然的或重组的慢殖子抗原或其片段，可被用作本发明的血清学测定的检测抗原。“片段”意思是全长的刚地弓形体或新孢虫蛋白的部分肽段，其提供存在于动物血清中的抗体识别的表位。按照本发明，全长刚地弓形体或新孢虫蛋白的截断形式也理解为片段。
在一个实施方案中，全长慢殖子抗原谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白(BAG-1)是检测抗原，(SEQ ID NO.2)。在另一实施方案中，缺少BAG-1的N-末端28个氨基酸的截短的BAG-1-GST融合蛋白是检测抗原，(SEQ IDNO.3)。在本领域中BAG-1也称作BAG-5。本发明打算将自然感染新孢虫的动物的抗血清或者接种过新孢虫的动物的抗血清或者未经过感染(uninfected)的抗血清用作试验样品。
按照本发明，当慢殖子抗原或其片段被固定在固相支持物上时，其反应性便提供了检测新孢虫抗体的方法。特别是，本发明方法的进行可以通过将动物血清样品与慢殖子-阶段的蛋白或其片段接触，然后反应形成抗原抗体复合物，并用传统的检测和定量方法检测反应产生的复合物。“抗体”意思是能与抗原上特异表位结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆的混合物或者是单克隆的。抗体可以是天然来源或者重组来源的完整的免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。
已知有许多检测抗原抗体复合物的量和/或其存在与否的方法，所有这些方法也是本发明所考虑的。例如，Western印迹测定的进行可以通过将抗原附着于固体支持物如硝酸纤维素纸上，将该纸与血清检测样品保温，并检测硝酸纤维素滤纸上在全长(约55kDa)或截短的(约51kDa)刚地弓形体BAG1-GST蛋白预期分子量处特异条带存在与否。在两个预期分子量处的任何一处存在条带，都说明该动物是新孢虫血清阳性。相反地，两个预期分子量处的任何一处条带都缺失说明该动物是接种过的。
本发明也考虑用Western印迹测定，其中将抗原附着在硝酸纤维素纸上并且将抗原用有染料附着的抗体染色。也可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中抗原或抗体是用酶标记的。本发明也打算用放射免疫测定法，其中抗原或抗体是用放射性元素标记的。
本发明打算提供检测动物血清中新孢虫抗体的存在/量或缺失的方法。因此，含有测定试剂(assay)和阳性和/或阴性反应对照，和其他必需成分的诊断测定试剂盒可以按照本发明所讲授来组合。
本领域的技术人员可以理解，在不背离广义描述的本发明的精神或范围情况下，可以对具体实施方案所示的本发明进行许多变动和/或修改。因此，这些实施方案在各个方面只作说明而不是限制。
实施例1新孢虫血清反应阴性动物和新孢虫接种动物的抗血清可以使用任何血清反应阴性或PCR阴性动物的血清样品，该动物随后接受新孢虫速殖子(tachyzoite)为基础的改良活疫苗，灭活的或亚单位为基础的疫苗。在本实施例中，经有资格的兽医诊断实验室(Washington StateDiagnostic Lab，Pullman，WA)用诊断性ELISA试验判定4个月龄小牛是血清反应阴性。将小牛在0天和21天用基于速殖子的i)改良的、活的、减毒新孢虫疫苗(USPTO专利申请第09/260,414号“减毒活新孢虫疫苗”，在此引入以作参考)，或者ii)灭活的、全细胞匀浆物新孢虫疫苗(USPTO专利申请第09/138,985号“新孢虫疫苗”，在此引入以作参考)接种。两种疫苗都是基于速殖子抗原的，以该抗原作为疫苗的保护成分。新孢虫改良的、活的、减毒疫苗每剂含有5×107Ncts-8个速殖子并且皮下给予3个血清反应阴性动物。新孢虫灭活的匀浆物疫苗每剂含有100ug总速殖子蛋白，配制在皂角甙为基础的佐剂中(750ug Quil A/150ug胆固醇)并经皮下给予3个血清反应阴性动物。接种后49和119天，将每种疫苗组的3个小牛的血清收集，汇集并分装冻存于-20℃直至进行血清学测定试验(参见实施例4)。
实施例2新孢虫自然感染的，血清反应阳性动物的抗血清可以使用任何自然感染的，血清反应阳性或PCR阳性动物的血清样品。在本实施例中，经有资格的兽医诊断实验室(Washington State Diagnostic Lab，Pullman，WA)用诊断性ELISA试验判定所购牛群中每个动物的血清学状态。将该试验报告为血清反应阳性的21个动物进行鉴定。将每个血清反应阳性动物的血清样品收集，汇集，并分装冻存于-20℃直至进行血清学测定试验(参见实施例4)。
实施例3新孢虫血清学试验使用的慢殖子抗原可以使用任何纯化的，天然的或重组的新孢虫或刚地弓形体慢殖子蛋白(刚地弓形体慢殖子蛋白BAG1；Genebank编号U23944)。在本实施例中，使用刚地弓形体慢殖子抗原，BAG1(本领域也称作BAG5)的两种不同的重组制备的形式。第一种形式是用亲和层析从大肠杆菌表达和纯化的全长BAG1-谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白(S.F.Parmley，et.al.1995.Mol.Biochem.Parasit.73253-257，在此引入以作参考)。第二种形式是用亲和层析从大肠杆菌表达和纯化的、缺少头28个氨基酸的截短的BAG1-GST融合蛋白(Parmley et al.，1995)。将纯化的、重组的全长BAG1-GST和截短的BAG1-GST蛋白冻存在-20℃直至进行血清学测定试验(实施例4)。
实施例4血清学试验可以使用任何本领域已知的以抗体为基础的检测试验(ELISA，竞争ELISA，RIA，Western印迹等等)。在本实施例中，使用Western印迹测定。将总量5mg的刚地弓形体全长BAG1-GST或截短的BAG1-GST蛋白溶解，与5×变性上样缓冲液(Pierce，IL.)混合并上样至预制的4-20％Tris-甘氨酸连续梯度凝胶(Novex，San Diego，CA)的1mm×2孔上。将凝胶按照生产商的说明书于125V电泳1.5小时。于25V持续1小时将凝胶印迹于20μM硝酸纤维素膜上(Bio-Read，Hercules，CA)。将膜干燥并切成同样长度/宽度的条。将这些条在封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(PBS))中室温保温过夜，用PBS洗涤，然后与血清检测样品(上面实施例1或2来源的)保温。
将实施例1和2来源的分装的血清检测样品在室温溶解并用PBS配制成1∶200的新鲜制备的稀释液。将天然的血清反应阴性的母牛血清用作阴性对照(1∶200稀释)。抗全长BAG1-GST的兔抗血清用作阳性对照(M.McAllister惠赠；M.McAllister，et.al.，1996.J.Parasitol.82(2)354-355)并在使用前用PBS作1∶12,500稀释。
将每个试验条(实施例3制备的)加入每个稀释的血清样品并于室温保温1小时。将所述条在含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中短暂洗涤2次并加入亲和纯化的、磷酸酶标记的山羊抗牛IgG 1∶400的PBS稀释液(KPL，Gaithersburg，MD.)。于室温保温1小时后，将所述条在PBST中短暂洗涤2次，然后在磷酸酶底物BCIP/NBT(KPL，Gaithersburg，MD.)中保温。适当显色后(大约10分钟)将所述条短暂放于双蒸水中终止酶反应。然后将所述条在空气中干燥。结果如图1所示。
实施例5血清学试验的解释血清学检测阳性指示试验血清样品和新孢虫或刚地弓形体慢殖子抗原之间特异反应的存在。在本实施例中，通过判定在全长(大约55kDa)或截短的(51kDa)刚地弓形体BAG1-GST蛋白预期分子量处特异条带的存在或缺失，来检测实施例4中使用的条的特异反应。
如图1所示，泳道5，在与新孢虫自然感染的牛汇集血清保温的条中，存在大约52-55kDa的条带，说明在新孢虫自然感染的血清反应阳性试验样品和截短的BAG1-GST慢殖子抗原之间有特异反应。相反，图1的泳道3和4，未检测到抗55kDa BAG1-GST蛋白的反应，说明新孢虫接种的试验样品缺乏特异反应。
如图2所示，泳道4和9，在与新孢虫自然感染的牛汇集血清保温的条中，存在大约52-55kDa条带，说明在新孢虫自然感染的血清反应阳性试验样品和截短的(泳道4)或全长的(泳道9)BAG1-GST慢殖子抗原之间有特异反应。相反，图2的泳道2和7，用新孢虫灭活疫苗免疫119天的母牛汇集抗血清未检测到抗任何一种形式BAG1-GST蛋白的反应。相似地，图2的泳道3和8，用新孢虫减毒疫苗免疫119天的母牛汇集抗血清未检测到抗任何形式BAG1-GST蛋白的反应。
本发明中描述的对刚地弓形体重组慢殖子抗原反应的差异证明利用慢殖子抗原的血清学试验可以区分或诊断新孢虫自然感染的和新孢虫接种的动物。源自新孢虫(例如SEQ ID No.1或2)或新孢虫(例如SEQID No.3或4)的任何纯化的，天然的或重组的慢殖子抗原或其片段，可被用作此诊断试验的检测抗原。任何源自新孢虫自然感染的或新孢虫接种的动物的抗血清可被用作此诊断试验的试验样品。
序列表<110>辉瑞产品公司(PFIZER PRODUCTS INC.)<120>新孢虫的血清学检测<130>PC23020A<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1219<212>DNA<213>刚地弓形体(Toxoplasma gondii)<220>
<221>CDS<222>(219)..(905)<220>
<221>CDS<222>(303)..(905)<400>1tgcttttgcc aaaggagacc tgtgtgcaga ggacttcgct gctaaaaagc agaagagtgc 60acggcgtgtg tagctcagtg gcatttcggg actcggtctt gcgtcgttcg cgactggacg 120tcgtcgtctg tgagagcgtc aaactaggga gaaggggcgg gccagagcgt tcggaaaatt 180atctgcaaag cccaggtccc gtatgatatt caaaaaag atg gcg ccg tca gca tcg 236Met Ala Pro Ser Ala Ser1 5cat ccg ccg gga gct tgt cca ccg gga tgt acc aag cat cct gct act 284His Pro Pro Gly Ala Cys Pro Pro Gly Cys Thr Lys His Pro Ala Thr10 15 20gcg aca gcc att tcc ccg agt gga gtg tgt ccc atg cgt gcg ttc cat 332
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Gly Ala Lys Gln Gln Ile Ser Val Lys195 200<210>4<211>672<212>DNA<213>新孢虫(Neospora caninum)<400>4cccctttctt ctctccgttt caagatgagc aagctcagca cagacggcct gaagaaggcc 60atcggagaga tcttggaggg ctcgcgggaa aagaagagaa agttcgtgga gaccgtcgag 120cttcagatcg gtttgaagga ttacgacacc caaagagaca agcgtttcag cggaagcgtg 180aggcttccta acgtcccccg cccccgcatg cgcgtgtgcg tgatgggaga tgctgtgcat 240tgcgagcaag caaaggagct gggactggaa ttcatggacg tggaggctat gaagaagttg 300aacaagaaca agaagcttgt gaagaaactc gcacggaagt acgacgcttt cctggcctcg 360caagtgttga ttccgcagat cccccgtctc ctgggtccgg gtcttaacaa ggcgggcaaa 420ttcccgacgc ttatcactca caacgataag ctcgaggata agattcagga natcaagagc 480tcaatcaaat tccaactcag aaaggtgcct gtgcatggtg tcgccgtcng gcacgtcgac 540atgacggagg agcaactgcg cgtgaacctg acactggcca tcaacttcct tgtctctctg 600ctgaagaaga actggaacag cgtgagaacg ctgcacatca agagcaccat gggcaagcct 660cagcagattt ac 67权利要求
1.区分天然新孢虫血清反应阳性动物与用新孢虫接种的动物的一种方法，其包括从动物获得血清样品和将该血清与刚地弓形体蛋白接触并检测血清结合抗体的存在。
2.权利要求1的方法，其中所述刚地弓形体蛋白包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
3.权利要求1的方法，其中所述刚地弓形体蛋白包含SEQ ID NO3的氨基酸序列。
4.权利要求2的方法，其中所述刚地弓形体蛋白是BAG-1。
5.权利要求2的方法，其中所述刚地弓形体蛋白是BAG-5。
6.权利要求1的方法，其中将所述蛋白附着于支持物。
7.权利要求1的方法，其中检测用以证明结合抗体存在的蛋白的步骤用Western印迹进行。
8.权利要求1的方法，其中检测用以证明结合抗体存在的蛋白的步骤用放射免疫测定法进行。
9.权利要求1的方法，其中检测用以证明结合抗体存在的蛋白的步骤用酶联免疫吸附测定进行。
10.权利要求1的方法，进一步包括测定结合于所述蛋白的抗体的量。
11.对怀疑感染了新孢虫的动物的诊断方法，其包括从动物获得血清样品和将该血清与刚地弓形体蛋白接触并检测血清结合抗体的存在。
12.权利要求11的方法，其中所述刚地弓形体蛋白包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或者SEQ ID NO3的氨基酸序列。
13.权利要求12的方法，其中所述刚地弓形体蛋白是BAG-1或者BAG-5。
14.检测血清样品中新孢虫抗体的方法，其包括将该血清与刚地弓形体蛋白接触并检测血清中结合抗体的存在。
15.区分天然新孢虫血清反应阳性动物与用新孢虫疫苗接种动物的一种方法，其包括从所述动物获得血清样品和将该血清与刚地弓形体蛋白片段接触并检测血清结合抗体的存在。
全文摘要
本发明涉及接种新孢虫的动物的血清学检测，其通过将受试血清与能和新孢虫反应的蛋白质作用来进行。该蛋白可以是全长的天然或重组新孢虫或刚地弓形体慢殖子融合蛋白或者是截短的融合蛋白或者是它们的片段。可以将该蛋白用于任何大量测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，Western印迹和其他合适形式的免疫测定。
文档编号G01N33/569GK1639574SQ02821627
公开日2005年7月13日 申请日期2002年10月8日 优先权日2001年10月31日
发明者戴维·A·布雷克, 黛安娜·M·里特 申请人:辉瑞产品公司