专利名称：利用光子微粒编码的微通道阵列式生物芯片及应用方法
技术领域：
本发明是一种用来进行生物样品中多种蛋白质和基因检测的快速、方便、廉价的高通量检测用芯片。可以广泛应用于临床检测、药物筛选、环境中生物样品的检测、法医鉴定、海关农产品进出口检验检疫、基因序列及功能分析以及军事上细菌战中各种致命或致病微生物的检测。
背景技术：
在科学研究和临床检测、药物筛选以及环境检测等众多领域中快速、高通量的检测到生物样品中与人类各种疾病、健康以及重要生命活动相关的各种蛋白质和DNA序列，能够为疾病的预防、诊断、治疗和生命科学研究提供指导和参考。生物芯片是近几年发展起来的一种高通量的生物检测技术，根据其检测的生物样品的不同，可分为基因芯片、蛋白质芯片和细胞芯片等。现有的生物芯片主要是基于将探针分子固定在玻璃基片等固相载体上，利用探针分子的位置信息进行编码、然后用荧光标记的目标分子进行杂交。杂交后，根据探针所在的位置信息确定探针的种类，根据目标分子荧光的信号确定目的分子的存在与否。该方法是利用位置信息对探针分子进行编码，通过xy坐标对生物分子的种类进行识别。因此，探针分子在基片表面固定时必须有很好的定位系统精确地将各探针分子固定在设计好的位置上。一般采用微加工的方法。该方法具有很好的可设计性并可以用来制备高密度生物芯片。但是，该方法的成本比较高。为了降低生物芯片的成本，有关生物芯片的简便的制备方法的研究受到了很大的重视。喷墨打印，纤维阵列等一系列方法得以开发。除了芯片的制造成本外，在生物芯片的使用过程中如何提高检测的灵敏度和检测速度也是一个关键问题。只有这些问题得到了很好的解决生物芯片才有可能得到广泛的使用。
光子晶体微粒是一种具有特殊光学特性和纳米结构的微粒。它是由两种以上具有不同光学常数的材料所构成。这些材料在光子晶体微粒中可以是形成同心圆的排列结构或者是层状排列。其周期在数十纳米到数千纳米之间。由于光子晶体微粒中材料排列的周期与光波长在同一尺度内，光子晶体微粒会标现出一些特有的光学特性。比如，光子晶体微粒具有光截止带。当光入射到光子晶体微粒上时与光截止带的频率一致光会被反射，而其他频率的光则可以通过光子晶体。在利用反射光谱对光子晶体微粒进行检测时可以观察到一个与光截止带一致的很强的反射峰。由于光子晶体微粒的光截止带的位置可以通过组成材料的光学常数和周期结构进行控制，因此光子晶体微粒的反射峰位置的控制可以通过对光子晶体的结构设计来实现。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种成本低，灵敏度高，杂交速度快、使用方便的利用光子微粒编码的微通道阵列式生物芯片。
技术方案本发明的光子晶体微通道阵列式生物芯片可以制备成一维或二维阵列结构。进样口位于通道的一端，出样口位于通道的另一端。在通道出口由用砂心或微刻蚀的微槽或滤纸等构成的阻挡机构。在微通道内从阻挡机构开始按顺序排列有具有不同颜色的光子晶体微粒。每一种颜色的光子晶体微球上固定有不同的探针。当含有生物样品的杂交缓冲液或洗脱缓冲液在通道内流动时，仅能容生物样品中的蛋白质、核酸分子通过，光子晶体微球则被阻挡在微通道之内。
本发明的芯片在结构上由微通道、进样口、光子晶体微球、出样口组成；光子晶体微球上固定有探针分子，光子晶体微粒按所设定的顺序排列在微通道中，微通道的两头分别是进样口和出样口，其中出样口端部内径小于进样口内径，其尺寸大小设计在能使生物分子通过，而将光子晶体载体阻挡在微通道内，避免固定在其上的探针随之流出通道外。固定有探针分子的光子晶体微球是具有不同颜色的光子晶体微粒，每一种颜色的光子晶体微粒上固定一种探针。
使用时将多位进样阀通过微蠕动泵、T型管分别与进样口和出样口连通，构成一个封闭的杂交反应通道，被检生物分子在通道内在微蠕动泵的驱动下在微通道中循环往复流动，直到杂交反应完全为止。在杂交反应的时候将多位进样阀、微蠕动泵与进样口和出样口相串联连接，在洗脱的时候将T型管与出样口连接，使蠕动泵间接与出样口相连接，使缓冲液通过出样口流入废液池。
本发明的光子晶体编码微通道阵列式生物芯片是在微蠕动泵的驱动的作用下，生物样品在微通道内循环流动，与固定在光子晶体上的生物探针分子进行杂交。杂交之前先在微通道进口端注入需要检测的生物样品，注入生物样品的时候，出口端封闭，以免被检样品流出通道。杂交在能调节温度的温浴锅内进行，将温度设置在最适杂交反应温度；杂交之后拆除微蠕动泵，通道的出口端加一真空抽吸泵，在进口端注入洗脱缓冲液，然后在出口端将洗脱缓冲液抽出。洗脱之后将微通道在激光共聚焦扫描仪下读取数据。然后根据杂交结合在探针分子上的荧光标记物的有无来判目标分子的存在与否，本发明将光子晶体微粒作为探针分子的载体，通过将光子晶体微粒在毛细管或者刻蚀的微通道内的排列制备得到生物芯片。本芯片利用光子晶体微球的截止带和位置信息对探针分子进行混合编码，目标分子在外加驱动力的作用下进入微通道流动，以便加快杂交反应速度。利用该技术制备得到的芯片具有成本低，灵敏度高，杂交速度快、使用方便等特点。
在本发明中我们通过把具有不同光截止带光子晶体微粒在微通道中的排列制备生物芯片。该方法与现有方法相比有制备简单，选材广，可被利用来编码的信息量大，测试简单等优点。
在本发明中我们针对阵列式生物芯片的以上这些问题，利用光子晶体微粒和微流体芯片技术降低生物芯片的制造成本，提高灵敏度和检测速度。
有益效果本发明实现了固定了探针分子的光子晶体在微通道内有序排列，利用光子晶体微球本身的颜色和和位置信息对探针进行编码，以标识探针的种类，同时利用探针分子的识别作用来识别目标分子的存在与否。本发明的特点在于(1)光子晶体颜色与位置信息的混合编码，可利用不同颜色的光子晶微球体进行排列组合对探针分子进行编码，编码信息量大，而且读码方便，甚至用肉眼就可以进行读码。(2)杂交速度快，由于杂交反应限制在微通道内，与二维的平板生物芯片相比，在杂交时可以采用震荡、流体驱动等方式加快杂交反应速度，缩短检测时间。(3)敏感性提高由于寡核苷酸固定的表面增大，本装置能够提高检测的灵敏度，从而可以检测样品内低丰度的生物分子。(4)由于杂交反应密闭在微通道内进行，可以与样品的预处理等装置连用，提高检测的自动化。
图1是本发明光子晶体的结构示意图。其中图1a为圆球状的光子晶体结构示意图；图1b为微片状的光子晶体结构示意图；图1c为复合层状的光子晶体结构示意图。
图2是本发明利用光子微球编码的微通道阵列式生物芯片中，一维光子晶体微通道芯片检测系统的示意图。
图3是本发明芯片制作和使用的流程示意图。
以上的图中有微通道1、进样口2、光子晶体微球3、出样口4、多位进样阀5、微蠕动泵6、T型管7、进样瓶8、缓冲液瓶9、废液瓶10。
具体实施例方式
本发明的光子晶体微球编码的微通道阵列式生物芯片由微通道1、进样口2、光子晶体微球3、出样口4组成，光子晶体微球3上固定有探针分子，光子晶体微粒3按所设定的顺序排列在微通道1中，微通道1的两头分别是进样口2和出样口4，其中出样口4端部内径小于进样口内径，其尺寸大小设计在能使生物分子通过，而将光子晶体载体3阻挡在微通道1内，避免固定在其上的探针随之流出通道外。固定有探针分子的光子晶体微球3是具有不同颜色的光子晶体微粒，每一种颜色的光子晶体微粒上固定一种探针。
具体制备流程如下光子晶体微粒的制备本发明中光子晶体微粒的制备采用两种方式。利用合成好的SiO2或高分子单分散纳米微粒通过自组装形成有序的微米球或微米膜。或者利用本身具有多层有序膜结构的光子晶体微粒包覆表面具有官能团的高分子聚合物，如聚苯乙烯等。
光子晶体的探针标记利用硅氧烷试剂对光子晶体进行表面修饰，再用双功能试剂将设计和合成好的探针分子固定在光子晶体微粒上。
微通道的制备方法采用印模或者激光光刻法，在PDMS、PMMA或者玻璃片上制作阶梯状的微通道作为盖片，然后采用粘接、化学键合、热键合、等离子键合或者电键合等方法使盖片同基片键合。
光子晶体微粒在微通道内的排列本发明中光子晶体微粒在微通道内的排列有两种方式。进样之前先将连有微蠕动管的进样阀与杂交反应的微通道拆分。在出样口端利用注射器抽吸形成的负压将光子晶体微球吸入微通道内，每次抽吸固定数量的同种颜色的光子晶体微球，几次抽吸之后，不同颜色的光子晶体微球按抽吸时的顺序定向排列在微通道内。另外一种方式是将漏斗与通道进样口连接，将固定有不同探针分子的不同颜色的光子晶体载体分别按顺序注入微通道内，在出口端光子晶体载体被阻拦，不同颜色的光子晶体微粒按顺序排列在微通道内。至此，完成了利用光子微粒编码的微通道阵列式生物芯片的制备。
使用时将多位进样阀5通过微蠕动泵6、T型管7分别与进样口2和出样口4连通，构成一个封闭的杂交反应通道，被检生物分子在通道内在微蠕动泵6的驱动下在微通道1中循环往复流动，直到杂交反应完全为止。在杂交反应的时候将多位进样阀5、微蠕动泵6与进样口2和出样口4相串联连接，在洗脱的时候将T型管7与出样口4连接，使蠕动泵间接与出样口4相连接，使缓冲液通过出样口4流入废液池10。
样品的预处理与荧光标记被检测生物样品在杂交反应之前需先提取带检测的目标分子。提取的核酸样品还需经多重PCR扩增，可在扩增的同时进行荧光标记；带检测的目标分子为蛋白质的时候，如若含量低，还需富集。
预杂交与被检样品的杂交反应及洗脱将配置好的预杂交缓冲液在微通道的进样口注入微通道内，然后将进样口与出样口微蠕动泵与接在进样阀上，利用微蠕动泵驱动预杂交缓冲液在微通道内往复流动，待杂交完全后，微蠕动泵与微通道分离，使缓冲液从微通道留出。杂交反应操作与预杂交反应相同，将杂交液转移到进样瓶中，打开微蠕动泵的开关，使其泵入微通道内，调节好流速之后，将T型管通过多位进样阀与微蠕动泵连通，使杂交液在通道内循环往复流动，等杂交完全后，将T型管与废液池连通，使杂交液流入废液池，然后从缓冲液池中通过进样口将洗脱缓冲液泵入微通道内，再将T型管通过多位进样阀与微蠕动泵重新连通，通过微蠕动泵的作用洗脱缓冲液在通道内往复流动洗脱，洗脱完成后，将洗脱缓冲液冲入废业液池，不同的是杂交反应在可以调节温度水浴锅内进行，杂交反应的时候，将温度设定在最佳杂交反应温度。
权利要求
1.一种利用光子晶体微粒编码的微通道阵式生物芯片，其特征在于该芯片由微通道(1)、进样口(2)、光子晶体微粒(3)、出样口(4)组成；光子晶体微球(3)上固定有探针分子，光子晶体微粒(3)按所设定的顺序排列在微通道(1)中，微通道(1)的两头分别是进样口(2)和出样口(4)，其中出样口(4)端部内径小于进样口内径，其尺寸大小设计在能使生物分子通过，而将光子晶体载体(3)阻挡在微通道(1)内，避免固定在其上的探针随之流出通道外。
2.根据权利要求1所述的利用光子晶体微球编码的微通道阵式生物芯片，其特征在于固定有探针分子的光子晶体微球(3)是具有不同颜色的光子晶体微粒，每一种颜色的光子晶体微粒上固定一种探针。
3.一种如权利要求1所述的利用光子晶体微粒编码的微通道阵式生物芯片的使用方法，其特征在于使用时将多位进样阀(5)通过微蠕动泵(6)、T型管(7)分别与进样口(2)和出样口(4)连通，构成一个封闭的杂交反应通道，被检生物分子在通道内在微蠕动泵(6)的驱动下在微通道(1)中循环往复流动，直到杂交反应完全为止。
4.根据权利要求4所述的利用光子晶体微粒编码的微通道阵式生物芯片的使用方法，其特征在于在杂交反应的时候将多位进样阀(5)、微蠕动泵(6)与进样口(2)和出样口(4)相串联连接，在洗脱的时候将T型管(7)与出样口(4)连接，使蠕动泵间接与出样口(4)相连接，使缓冲液通过出样口(4)流入废液池(10)。
全文摘要
利用光子微粒编码的微通道阵列式生物芯片及应用方法是一种用来进行生物样品中多种蛋白质和基因检测的快速、方便、廉价的高通量检测用芯片。该芯片的光子晶体微球(3)上固定有探针分子，光子晶体微粒按所设定的顺序排列在微通道(1)中，微通道的两头分别是进样口(2)和出样口(4)，其中出样口端部内径小于进样口内径，而将光子晶体载体阻挡在微通道(1)内。使用时将多位进样阀(5)通过微蠕动泵(6)、T型管(7)分别与进样口(2)和出样口(4)连通，构成一个封闭的杂交反应通道，被检生物分子在通道内在微蠕动泵(6)的驱动下在微通道(1)中循环往复流动，直到杂交反应完全为止。
文档编号G01N30/50GK1595144SQ20041004136
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月13日 优先权日2004年7月13日
发明者顾忠泽, 刘兆斌, 赵祥伟, 张宏, 陆祖宏 申请人:东南大学