专利名称：一种基于微球的微流控生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基于微球的微流控生物芯片及其制备方法。它可以用来检测蛋白质、核酸等生物大分子，能够广泛应用于临床检测、检验检疫、环境监测、药物筛选、微生物鉴定以及核酸和蛋白功能分析等领域。
背景技术：
生物芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织和细胞中DNA、蛋白质和其他生物组分的快速、高效、灵敏的处理与分析。它是20世纪90年代初发展起来的一种生物检测技术，是多学科交叉综合发展的产物。其原理是在大约1～2cm2大小的玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶或者金属等载体材料上面，以大规模阵列的形式在不同位置固定上不同的生物分子探针(蛋白质、核酸等)，这些探针分子可以与溶液中的目的靶分子相互作用(如杂交、免疫反应等)，反应完成后通过洗片洗去未反应的分子。目的靶分子可以事先标记，也可以在与探针分子反应后进行染色。通过信号收集设备(如荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、芯片扫描仪等)得到反应信号的有无强弱经计算机数据分析，可以得到相关的生物信息。由于生物芯片高通量、并行化的特点，极大的简化和缩短了实验研究进程，近年来取得了长足的发展，特别是在人类基因组计划提前完成和后基因组计划启动之后，生物芯片的应用和需求都有了显著的增加。根据芯片表面固定的分子的不同，一般可以将其分为基因芯片和蛋白质芯片。根据固相表面分子固定方法的不同，又可以分为点样合成法和原位合成法。虽然多数生物芯片的片基采用价格便宜的玻璃片，但是由于芯片制备过程需要专门的设备和技术，所以造成芯片的成本较高。另外，芯片使用过程是在基片的表面点加含有目的靶分子的溶液，使数以万计的不同探针和目的靶分子固液界面相互作用，目的靶分子往往要经过很多的反应点才能扩散到相应探针分子所在的位置，反应检测时间较长，灵敏度有待进一步提高。因此如何降低芯片的成本和提高芯片检测的速度和灵敏度一直是生物芯片研究的热点和方向。
微流控芯片是微全分析系统(Micro Total Analysis System，μ-TAS亦称Lab-On-A-chip)中当前最活跃的领域和发展前沿，其宗旨是将分析实验室的功能转移到芯片上。它是20世纪90年代初中期在分析化学领域发展起来的一种分析技术，以分析化学和分析生物化学为基础，应用微电子加工技术，在微芯片上加工出微米级的容器、泵、阀、管道等微结构网络，将样品的制备、反应和检测的这个过程进行集成的微全分析系统。芯片的大小在几个平方厘米左右，选用硅片、玻璃、硅橡胶、塑料等材料作为基片和盖片，通过蚀刻、光刻或印模等方法加工微通道，采用电、压力、重力等方式驱动通道内的流体，最后采用化学发光、电化学、荧光检测器等进行检测。现在微流控芯片已在生物化学分析和环境分析诸方面发有了广泛的应用和快速的发展。由于微流控芯片将整个样品分析的过程，包括取样和样品的处理、预浓集、稀释和混合、分离、化学反应和信号检测全部集成化在一块小的芯片上，它与传统的分析装置相比实现了亚微升甚至纳升级的试剂和样品消耗，反应空间的大大缩小使反应的均一性提高，反应速度加快，同时降低了生产成本并便于携带。因此近年来备受国内外分析化学家的注目，相关研究也已成为当前分析化学发展的一个重要方向。但是目前微流控芯片很少有应用于核酸杂交等分析的例子，其原因在于缺少一种编码不同探针分子的载体。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种检测速度快、灵敏度高、样品需要量小、检测成本低的一种基于微球的微流控生物芯片。
技术方案本发明是在粒径大小不同的微球上固定不同的探针分子，然后将粒径大小不同的微球固定在阶梯状微通道中制成基于微球的生物芯片。
该生物芯片由位于上半部的盖片和位于下半部的基片所组成；在盖片内设有阶梯状的微通道，在微通道中设有大小不同的作为探针分子载体的微球，在微通道的两头设有一个进口和一个出口。其中，阶梯状微通道中的阶梯至少有两级，大小不同的微球至少有两种，每一级阶梯分别对应一种微球，以微球的大小作为编码来区别固定在微球上的不同探针分子。作为探针分子载体的微球由玻璃或者聚苯乙烯或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)或PDMS(聚二甲基硅氧烷)制备，微球的大小在30～100μm之间。阶梯状微通道中的每个台阶的长度在500μm～1000μm，阶梯状微通道的宽度为105～205μm，各个台阶离基片的距离在25～105μm。
其工作原理是阶梯状的微通道可以作为高度不同的坝，能够把大小不同的微球固定住，使其不至于随流体流出微通道。当微蠕动泵驱动杂交液循环通过微通道时，杂交液中带有荧光标记的目的靶分子就同微球上的探针进行杂交反应。杂交反应所需的温度条件可以由水浴，恒温加热器或者可控温的盒子提供。当杂交反应完之后，用微蠕动泵驱动洗脱缓冲液对微通道和微球进行洗脱。排尽洗脱液之后在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下检测微球的荧光强度，以确定杂交反应结果。
有益效果根据本发明，利用阶梯状的微通道固定大小不同的微球，利用微球的大小来编码不同的探针分子，通过检测微通道内微球的荧光强度来确定反应结果具有以下优点(1)检测速度快由于杂交反应只在微通道内进行，杂交液循环流动，可以减少溶液的挥发和目的靶分子到达探针的时间，提高反应的速度，缩短检测时间。(2)可以实现高通量检测每个阶梯状微通道可以有若干高度不同的坝，能够固定若干大小不同的玻璃微球，同时若干个阶梯状微通道可以串连或者并联，因此可以实现高通量的检测。(3)灵敏度高由于固定探针分子的表面是球形，比普通阵列芯片的圆形表面积增大，从而提高了检测的灵敏度，能够检测低浓度的目的靶分子。(4)样品需要量小由于微通道和微球都是微米级的，因此可以实现纳升级的进样。(5)可扩展性高由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同样品预处理等微流控芯片集成，促进了分析系统的微型化和自动化。
本发明的目的是将充分利用生物芯片和微流控芯片的优势，采用不同粒径大小的微球固定不同的核酸或者蛋白质分子，在微流控通道内同目的靶分子进行杂交反应，以加快反应速度和降低检测成本。
图1为本发明芯片的剖面结构示意图。
图2为本发明芯片的的俯视图。
图3为本发明芯片使用时，整个装置的结构示意图。
以上的图中有盖片1、第一阶梯11、第二阶梯12、第三阶梯13、第四阶梯14、第五阶梯15、进口16、出口17；基片2；第一微球31、第二微球32、第三微球33、第四微球34；微蠕动泵4、管线5。
具体实施例方式
本发明是一种基于微球的微流控生物芯片，该生物芯片由位于上半部的盖片1和位于下半部的基片2所组成；在盖片1内设有阶梯状的微通道，在微通道中设有大小不同的作为探针分子载体的微球，在微通道的两头设有一个进口16和一个出口17。阶梯状微通道中的阶梯至少有两级，大小不同的微球至少有两种，每一级阶梯分别对应一种微球，以微球的大小作为编码来区别固定在微球上的不同探针分子。作为探针分子载体的微球其材料可以是玻璃、聚苯乙烯或橡胶等，微球的大小在30～100μm之间。阶梯状微通道中的每个台阶的长度在500μm左右，阶梯状微通道的宽度为105～205μm，各个台阶离基片的距离在25～105μm。
盖片1、基片2以PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)作为芯片材料，在玻璃微球上固定寡核苷酸探针进行生物检测为例来说明其具体实施方式
如下a、盖片的制备采用激光微加工方法。通过AutoCAD设计微通道图形；将CAD图形转换成激光微加工系统可识别指令；采用激光微加工系统在基片或盖片上加工阶梯状的微通道，两端打孔分别作为进样口和出样口。
b、基片的制备选择与盖片同样大小的PMMA片子作为基片。
c、盖片和基片的封装通过玻璃态热键和方法进行基片和盖片的封装。
d、微球上固定探针洗净的微球经硅烷化和双功能试剂修饰，然后将不同的探针分子固定到大小不同的玻璃微球上。
e、微球在微通道内的固定用移液枪或者注射器等吸取适量微球和预反应液，按照从小到大的顺序依次注入微通道内，微通道内的阶梯可以把大小不同的微球依次固定在不同的位置。
f、微流控芯片的连接通过管线5依次连接微蠕动泵4和芯片。
g、微通道内的杂交反应打开管线接口，用微蠕动泵将预先处理好的带有荧光标记的样品吸入微通道，然后由微蠕动泵驱动流体在闭合的流路中循环
h、流动进行反应，反应结束后打开管线接口，泵出反应液，同时吸入洗脱液洗脱。如果反应需要特殊的温度，可以在水浴或者可控温的盒子中进行。
h、检测杂交反应结束后，用荧光显微镜或者激光共聚焦荧光显微镜下观察微通道中的微球，根据微球表面荧光信号的有无和强度来判断目标分子的有无和多少。
权利要求
1.一种基于微球的微流控生物芯片，其特征在于该生物芯片由位于上半部的盖片(1)和位于下半部的基片(2)所组成；在盖片(1)内设有阶梯状的微通道，在微通道中设有大小不同的作为探针分子载体的微球，在微通道的两头设有一个进口(16)和一个出口(17)。
2.根据权利要求1所述的一种基于微球的微流控生物芯片，其特征在于阶梯状微通道中的阶梯至少有两级，大小不同的微球至少有两种，每一级阶梯分别对应一种微球，以微球的大小作为编码来区别固定在微球上的不同探针分子。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于微球的微流控生物芯片，其特征在于作为探针分子载体的微球其材料是玻璃、聚苯乙烯或橡胶，微球的大小在30～100μm之间。
4.根据权利要求1所述的一种基于微球的微流控生物芯片，其特征在于阶梯状微通道中的每个台阶的长度在500μm～1000μm，阶梯状微通道的宽度为105～205μm，各个台阶离基片的距离在25～105μm。
全文摘要
一种基于微球的微流控生物芯片它可以用来检测蛋白质、核酸等生物大分子，能够广泛应用于临床检测、检验检疫、环境监测、药物筛选、微生物鉴定以及核酸和蛋白功能分析等领域。该生物芯片由位于上半部的盖片(1)和位于下半部的基片(2)所组成；在盖片(1)内设有阶梯状的微通道，在微通道中设有大小不同的作为探针分子载体的微球，在微通道的两头设有一个进口(16)和一个出口(17)。阶梯状微通道中的阶梯至少有两级，大小不同的微球至少有两种，每一级阶梯分别对应一种微球，以微球的大小作为编码来区别固定在微球上的不同探针分子。
文档编号G01N33/50GK1595149SQ20041004136
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月13日 优先权日2004年7月13日
发明者顾忠泽, 赵祥伟, 刘兆斌, 张宏, 陆祖宏 申请人:东南大学