专利名称：Dna－蛋白质交联定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种DNA-蛋白质交联定量检测用的试剂盒，适用于各种环境或化学因素引起的DNA-蛋白质交联的定量检测。
背景技术：
DNA-蛋白质交联(DNA protein crosslinks，DPC)在正常的细胞中有一定的本底水平，也是细胞正常生长所必须的，但在环境污染物或化学致癌物的作用下可形成超量的DPC，而超量的DPC是一种病理状态是DNA分子的严重遗传损伤，并且修复比较困难。在DNA的复制过程中容易造成某些重要基因的丢失。因此，DPC作为遗传毒性的生物标志物有非常重要的价值。
国内外多年来一直致力于研究有效的DNA-蛋白质交联检测方法，现有的方法中有的检测灵敏性较低；有的检测灵敏度较高但只能间接检测而不能对其精确定量；有的方法造成的测量误差较大；有的需要昂贵的设备、特异性的抗体以及样品的处理非常复杂。近年来发展起来的KCl-SDS沉淀法在检测DPC时具有简便有效的特点，但需要称量和配制的试剂较多而使用非常不方便，且会因为实验人员及仪器的准确性等原因产生较大的系统误差。目前国内外尚无可用于DNA-蛋白质交联定量检测的试剂盒。
发明内容
本实用新型的任务是在KCl-SDS沉淀法的基础上加以修饰，并提供一套预先由生产厂家称量配制和分装好，临用时只需简单操作即能使用的试剂盒。因而可以有效的克服上述缺点，提供灵敏、简便、不需要昂贵的试剂和设备的DPC检测方法，并且样品处理简单不受DNA-DNA交联和DNA链断裂等其他DNA损伤的影响，可广泛应用于各种环境化学因素所致DNA-蛋白质交联的检测。
本实用新型所采用的技术方案是裂解待测细胞样品，获取长度统一的DNA片段。通过十二烷基硫酸钠与蛋白质和DNA-蛋白质交联结合，沉淀DNA-蛋白质交联物从而将游离的DNA分离出来，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白质使DNA-蛋白质交联物中结合态DNA游离出来，并用荧光法测定结合态DNA的含量以及游离DNA的含量，进而得到DNA和蛋白质的交联程度。
本实用新型的结构为一种DNA-蛋白质交联定量检测试剂盒，包括盒体、盒盖和固定板，盒体内置放着试剂瓶1、2、3、4、5、6、7和8，八个试剂瓶由固定板分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内封闭包装着固定重量比配和准确称量的试剂，试剂瓶1中装有小牛胸腺DNA，试剂瓶2中装有十二烷基硫酸钠，试剂瓶3中装有Tris-HCl和KCl配制的pH为7.5的溶液，试剂瓶4中装有蛋白酶K，试剂瓶5中装有荧光染料Hoechst33258，试剂瓶6中装有NaH2PO4和Na2HPO4，试剂瓶7中装有KCl和Na2EDTA及Tris-HCl，试剂瓶8中装有Tris-HCl，试剂瓶5为棕色玻璃瓶。试剂瓶1、2、3、4、6、7和8为玻璃瓶或白塑料瓶本DNA-蛋白质交联定量检测试剂盒的盒体和盒盖用硬纸或簿塑料板制作，固定板用硬纸或塑料泡末板制作。
使用本实用新型时，操作者按照试剂盒说明书配制好试剂，并按照给定的操作步骤进行使用，就可以检测各类细胞样品DNA-蛋白质交联。本实用新型简化了实验操作中的很多繁杂步骤，能节约实验者的时间，较好地满足实验操作的简单化和提高实验结果的准确性。
图1DNA-蛋白质交联定量检测试剂盒结构图图中序号表示1、2、3、4、5、6、7和8为试剂瓶，9为固定板，10为盒体、11为盒盖具体实施方式
以下结合附图对本实用新型的构成与使用方法，做进一步的详细说明检测试剂盒的构成试剂瓶1白色塑料瓶，瓶内封闭包装按固定重量准确称量的小牛胸腺DNA标准品，其净重为1mg，用于标准曲线的绘制。此为试剂I。
试剂瓶2白色塑料瓶，瓶内装按固定重量准确称量的十二烷基硫酸钠，50T净重为0.6g，100T净重1.2g，临用前用双蒸水加热溶解，配成浓度为2％的溶液，用于裂解细胞。此为试剂II。
试剂瓶3白色塑料瓶，瓶内封闭包装按固定重量和配比配成的Tris-HCl-KCl溶液，其中Tris-HCl浓度为20mmol/L，KCl的浓度为1.0mol/L，试剂的pH为7.5，溶液的体积50T为6mL，100T为12mL。此为试剂III。
试剂瓶4白色塑料瓶，瓶内封闭包装按固定重量准确称量的蛋白酶K，试剂的净重量50T为12mg，100T为24mg，临用前用清洗缓冲液配制成浓度为0.4mg/mL的溶液，用于分离交联的DNA。此为试剂IV。
试剂瓶5棕色玻璃瓶，瓶内封闭包装按固定重量准确称量的荧光染料Hoechst33258，试剂的净重量为1mg，临用前用染料稀释液配成浓度为400ng/mL的染色液。此为试剂V。
试剂瓶6白色塑料瓶，瓶内封闭包装按固定重量和配比准确称量的NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O混合试剂，试剂的净重50T为1.9548g，100T为3.9102g，临用前用双蒸水溶解配制重悬缓冲液，其中两种试剂的浓度均为0.2mol/L。此为试剂VI。
试剂瓶7白色塑料瓶，瓶内封闭包装按固定重量和配比准确称量的KCl和Na2EDTA及Tris-HCl混合试剂，试剂的净重量50T为2.2109g，100T为3.7256g，临用前用双蒸水溶解配制清洗缓冲液，其中KCl浓度为0.1mol/L，EDTA浓度为0.1mmol/L，Tris-HCl浓度为20mmol/L，pH为7.5。此为试剂VII。
试剂瓶8白色塑料瓶，瓶内封闭包装按固定重量准确称量的Tris-HCl试剂，用来配制染料稀释液，试剂的净重量50T为0.394g，100T为0.788g，临用前用双蒸水配制成浓度为20mmol/L的溶液，pH为7.5。此为试剂VIII。
上述八个试剂瓶一同放入一个由硬纸材料制成的长方形盒子10中，并用带有圆孔的泡末板9固定各试剂瓶，然后用盒盖11盖好加封。
检测试剂盒的使用方法一、试剂的配制1.从冰箱中取出试剂I，用清洗缓冲液配制终浓度分别为0ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，300ng/mL，400ng/mL 500ng/mL，750ng/mL，1000ng/mL，2000ng/mL，3000ng/mL，5000ng/mL的DNA标准液。在DNA标准液的配制时，先将1mg的标准DNA溶于2mL的清洗缓冲液中配成母液然后再取少量做梯度稀释至所需浓度。
2.试剂II加入双蒸水加热溶解。中其50T加30mL双蒸水；100T加60mL双蒸水。
3.临用前从冰箱中取出试剂IV，加入清洗缓冲液溶解，并放入4℃恒温箱中备用。其中50T加30mL缓冲液；100T加，60mL缓冲液。
4.临用前从冰箱中取出试剂V，加入稀释液2.5mL溶解，再稀释1000倍，并放入4℃恒温箱中备用。其中50T取120μL用稀释液稀释至120mL；100T取240μL用稀释液稀释至240mL。
5.从冰箱中取出试剂VI，用双蒸水溶解配制成所需体积。
6.从冰箱中取出试剂VII，将其50T溶解于200mL双蒸水；100T的溶于350mL双蒸水，调节pH值至7.5，并放入4℃恒温箱中备用。
7.从冰箱中取出试剂VIII用双蒸水配制成所需体积，调节pH至7.5，放入4℃恒温箱中备用。
检测步骤1.取配制好的DNA标准液1mL，加入1mL新鲜配制试剂IV，置于暗处30分钟，荧光分光光度计350nm和450nm，扫描各浓度标准液，做出标准曲线。
2.将染毒好的细胞在6000r/min的条件下离心3分钟收集细胞，去掉上清液。
3.接着向每支离心管中加入0.5mL重悬缓冲液(试剂VI)重悬浮细胞，再分别加入0.5mL试剂II溶液并轻微振荡。然后将混合液65℃水浴加热10分钟。
4.从水浴中取出加入0.1mL试剂III，将混合液六次穿过1mL的聚丙烯枪头，在冰上冷冻样品5分钟后沉淀形成，然后10000r/min 4℃离心5分钟收集沉淀，将上清液转入一5mL离心管a中。
5.加入1mL的清洗缓冲液(试剂VII)重悬浮沉淀(重悬时，先将样品放入50℃-65℃的热水中加热约1分钟至白色沉淀溶解，再将样品旋涡混匀)，于65℃水浴加热10分钟，冰上骤冷5分钟，然后按步骤3离心，清洗2次，每次离心的上清液均转入上述离心管a中(其中包括游离的DNA)混匀后取出1mL于离心管b。
6.最终的沉淀重悬浮于0.5mL的试剂VII清洗缓冲液中，然后加入试剂IV0.5mL，于50℃水浴3小时，从水浴中取出冰上骤冷5分钟，在12000r/min和4℃条件下离心10分钟，收集上清液，其中包括DPC中的DNA，转入5mL离心管c中。
7.紧接着向离心管b和c中加入1mL新鲜配制的试剂V，置于暗处30分钟。染色后的样品用荧光分光光度计测定其荧光值，激发波长为350nm，发射波长为450nm。
8.将测定样品的荧光值代入标准曲线，计算出相应的DNA浓度。
9.计算交联系数％＝离心管c中DNA浓度/(离心管b中DNA浓度×3+离心管c中DNA浓度)×100％。
权利要求1.一种DNA-蛋白质交联定量检测试剂盒，包括盒体(10)、盒盖(11)和固定板(9)，其特征是盒体内置放着试剂瓶(1、2、3、4、5、6、7和8)，八个试剂瓶由固定板(9)分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶(1)中装有小牛胸腺DNA，试剂瓶(2)中装有十二烷基硫酸钠，试剂瓶(3)中装有Tris-HCl和KCl配制的pH为7.5的溶液，试剂瓶(4)中装有蛋白酶K，试剂瓶(5)中装有荧光染料Hoechst33258，试剂瓶(6)中装有NaH2PO4和Na2HPO4，试剂瓶(7)中装有KCl和Na2EDTA及Tris-HCl，试剂瓶(8)中装有Tris-HCl，试剂瓶(5)为棕色玻璃瓶，试剂瓶(1、2、3、4、6、7和8)为玻璃瓶或白塑料瓶。
2.按权利要求1所述的DNA-蛋白质交联定量检测试剂盒，其特征是盒体(10)和盒盖(11)用硬纸或簿塑料板制成，固定板(9)用硬纸或塑料泡末板制成。
专利摘要本实用新型是一套适于定量检测DNA－蛋白质交联的试剂盒。它以KCl－SDS沉淀法为原理，制备出一种可简便、灵敏的检测各类细胞样品DNA－蛋白质交联水平的试剂盒。该试剂盒是一套由8瓶试剂共同配套使用的DPC定量检测试剂盒，8瓶试剂中试剂II为液体，其余为固体；每个试剂瓶中装有固定重量和特定配比的试剂；这8瓶试剂一起装入一个由硬纸等材料制成的适当大小的长方形盒子10中，并用带有一定大小和秩序的圆孔的泡末板9来固定各试剂瓶。其使用不需要昂贵的设备，样品处理简单，可广泛应用于各种环境化学因素所致DNA－蛋白质交联的检测。
文档编号G01N33/50GK2750319SQ20042011138
公开日2006年1月4日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者刘英帅, 鲁志松, 杨旭 申请人:华中师范大学