专利名称：涉及g－蛋白偶联受体寡聚体的材料和方法
技术领域：
本发明涉及与G-蛋白偶联受体(GPCR)寡聚体相关的材料和方法。本发明特别，但不限于提供了包括GPCR寡聚体的生物学试剂、生产所述生物学试剂的方法和用于测定其功能的试验。本发明还提供了用于测定具有调节GPCR寡聚体，特别是杂-寡聚体功能的能力的化合物的试验。
背景技术：
GPCR是人类基因组中最大的基因家族之一且已经成为用于研发临床有效的小分子药物的最易于控制的一组靶物。据估计在临床用于人的药物中约有40％以GPCR为靶。由此对GPCR的结构、调节和活化机制以及它们控制的下游信号级联放大的详细情况存在巨大关注。A类或视紫红质类家族的GPCR是迄今为止含有80％以上总GPCR家族成员的最大类。已经在人类基因组测序程序中鉴定了800个以上编码GPCR的基因，但它们中仅有约25个目前成为临床有效药物的靶物。因此，对此进行发展并找到靶向目前鉴定的GPCR的有用药物有巨大潜力(Lee等，2001)。
在最近的过去，GPCR作为二聚体存在的概念已经从假说迅速发展成显然被接受(参见Bouvier，2001，Milligan，2001，George等，2002综述)。尽管均二聚体(即含有一个单个GPCR的两个拷贝的二聚体)已经得到了最佳研究，产生的证据提示既发生杂二聚化(即二聚体由两个不同的GPCR各自的一个分子组成)，又可以具有功能性和药理性后遗症(Devi，2001，George等，2002)。然而，与形成这类杂二聚体的选择性和在共表达两种不同GPCR还必然导致均二聚体对产生时如何在分离中监测杂二聚体的功能相关的重要问题仍然存在。假定在单个细胞中共表达许多GPCR，则很可能细胞中GPCR二聚体的补体为复杂的。
已经对γ-氨基丁酸(GABA)B型受体(GABABR)进行了研究(Duthey等，2002)。这是一种罕见的GPCR，因为迄今为止已知它是唯一一种需要两个亚单位GB1和GB2起作用的受体。GB1亚单位含有GABA结合位点，但不能单独活化G-蛋白。GB2不结合GABA，但确实具有活化G-蛋白的能力。Duthey等考虑了G-蛋白偶联中GB1-GB2杂聚体(heteromer)内每一种亚单位的作用。该研究包括将突变引入GB1和GB2，特别是在第3胞内环内。他们确定使GB2突变防止了G-蛋白活化，而使GB1发生相似的突变不会影响受体功能。尽管关注GABAB受体，但是这项研究令人遗憾地没有提供任何有关GPCR的信息，其中相同蛋白质既能使配体结合又能使G-蛋白活化。
其它研究着眼于在激素结合中有缺陷的第一种突变体受体与在信号世代中有缺陷的第二种突变体受体的共表达。据报导这两种突变体的共表达挽救了激素-活化的cAMP产生(Lee等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)277卷，18期，2002；Osuga等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)272卷，40期，1997)。
然而，尽管公认GPCR作为潜在药物靶物是极为重要的，但是不存在令人满意的筛选试验，而令人满意的筛选试验要求采集有关可能天然存在的GPCR寡聚体，特别是GPCR杂-寡聚体的功能特性，例如配体结合特性的可靠数据。
发明内容
本发明人令人意外地发现，在配体结合后，GPCR具有活化与第二种GPCR结合的G-蛋白的能力，在此情况中，两种GPCR均形成寡聚体。
具体地且如下文给出的实施例中解释的，本发明人已经发现，在细胞中共表达(A)GPCR相对于G-蛋白而言被赋予非功能性的GPCR和G-蛋白的融合蛋白和(B)G-蛋白被赋予非功能性，即不能对GPCR所接受的信号起作用的GPCR和G-蛋白的融合蛋白，产生了下列复合物A、B、AA、BB、AB和BA，其中仅AB和BA为功能性的，即G-蛋白被活化以结合GTP并启动GPCR信号级联放大。
基本策略利用如下事实可以将GPCR/G-蛋白α亚单位融合蛋白(Milligan，2000；Milligan，2002)看作含有GPCR和G-蛋白这两种成分的序列和功能特性的双-功能多肽类。通过产生不同的突变体对，其中第一种在GPCR中得到突变而使其不能活化与之融合的野生型G-蛋白，而第二种在G-蛋白中得到突变，使得它不能被与之连接的野生型GPCR活化，本发明人证实当共表达这两种突变体时，功能可以得到恢复。因此，只有包括至少每种突变体的寡聚体才能产生功能互补且能够产生对激动剂配体产生反应的信号。
本发明人理解可以将这种现象用于提供可靠的筛选试验，以便测定GPCR寡聚体，特别是杂-寡聚体的特性并提供这类试验中使用的生物学试剂。
因此，本发明在其最一般的方面中提供了用于测定GPCR寡聚体的功能特性，包括测定潜在的配体的材料和方法。术语GPCR在本领域中众所周知且指的是任意细胞表面跨膜蛋白，当被合适的化合物活化时，它由此活化鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G-蛋白)。
本发明在第一个方面中提供了包括GPCR寡聚体的生物学试剂，所述的GPCR寡聚体含有(a)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中相对于结合的第一种G-蛋白而言，第一种GPCR为非功能性的；(b)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的。
术语“非功能性”指的是与野生型相反，蛋白质(GPCR或G-蛋白)不能执行特定的生物功能。因此，GPCR相对于G-蛋白而言为非功能性的这一事实指的是它相对于G-蛋白而言不能执行其野生型的生物功能，即不能在配体结合后活化G-蛋白。优选野生型的其它生物功能特征(例如配体结合)得到保持。
同样，非功能性G-蛋白不能执行其野生型生物功能，即在来自GPCR的刺激后不能启动细胞信号级联放大。
第一种和第二种GPCR形成寡聚体的能力使得功能性的第二种GPCR接触功能性的第一种G-蛋白的环境。功能性GPCR随之能够活化功能性G-蛋白，而活化的G-蛋白由此产生细胞信号级联放大。
第一种和第二种GPCR可以相同，即均-寡聚体，例如均二聚体、均三聚体或高级寡聚体；或第一种和第二种GPCR可以不同，即杂-寡聚体，例如杂二聚体、杂三聚体或高级寡聚体。
理想的情况是，所述的寡聚体存在于细胞膜中。如果第一种和第二种GPCR及其结合的G-蛋白在细胞中得到共表达，那么可以便利地实现这一目的。因此，需要GPCR及其G-蛋白彼此结合为融合蛋白。然而，本领域技术人员理解其它结合方式是可能的。例如，可以通过偶联方式，诸如结合对、化学键等或单纯通过在细胞环境中的自然结合使蛋白质彼此结合。
本发明还提供了用于生产第一个方面的生物学试剂且特别是用于本发明方法的突变体GPCR/天然G-蛋白融合蛋白(即包括修饰的非功能性GPCR/功能性G-蛋白)以及相应的核酸构建体。可以对蛋白质序列进行较少的修饰，例如，可以将附加表位添加到受体的N-末端，导入间隔节段，以便在GPCR蛋白质序列与G-蛋白序列之间产生缺口和/或除去G-蛋白基因的末端甲硫氨酸。本领域技术人员可以预计许多这类修饰，条件是在受体/G-蛋白融合蛋白的使用过程中的功能性基本上保持不受影响。
此外，本发明提供了如本文所述的突变体GPCR/G-蛋白融合蛋白在本发明方法中的应用(即包括修饰的非功能性GPCR/功能性G-蛋白或功能性GPCR/非功能性G蛋白)。
本发明的核酸构建体包括核酸，一般为编码符合读框的融合的特定受体的DNA、RNA、mRNA或cDNA，即编码G-蛋白的合适的核酸序列。一般来说，通过表达载体在细胞中表达所述的核酸构建体。
因此，还提供了包括GPCR寡聚体的细胞，所述的GPCR寡聚体含有(a)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中相对于结合的第一种G-蛋白而言，第一种GPCR为非功能性的；(b)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的。
一般来说，所述的细胞来源于真核生物，包括酵母，诸如脊椎动物来源，包括两栖动物和哺乳动物(尤其是人)且选择的表达载体为适合于在特定细胞类型中表达的载体。合适的细胞和表达载体在下文中更详细地讨论。
为了所述的生物学试剂可以用于测定GPCR寡聚体的天然特性的试验，重要的是保持存在于GPCR上的任何配体结合位点。因此，优选第一种GPCR仅相对于结合的第一种G-蛋白而言被赋予非功能性。换句话说，第一种GPCR保持任何它必须结合配体，但不能在配体结合后活化G-蛋白的能力。当然，GPCR的实际组合可以改变配体结合位点的特性，而这一结果是寡聚化形成后可能天然发生的情况的反映而不应该是人工操作的结果。
就第二种G-蛋白而言，优选它至少相对于第二种GPCR而言被赋予非功能性，即使得它不能对GPCR发送的信号起作用。因此，为了使所述的生物学试剂用于试验，重要的是第二种G-蛋白被赋予的非功能性至少达到不能活化细胞信号，即不能以功能方式结合GTP和启动GPCR信号级联放大的程度。
本发明人已经发现，对G11αG-蛋白而言，例如，可以通过替换使这些G-蛋白所共有的甘氨酸208突变，以便使G-蛋白成为非功能性的。
因此，优选通过至少一种氨基酸替换修饰第二种G-蛋白，其中所述的至少一种氨基酸为等同于G11α中的甘氨酸208的甘氨酸。
如上所述，优选修饰第一种GPCR以便使它仅相对于G-蛋白而言被赋予非功能性。分子生物学领域的发展已经能够极为特异性地修饰蛋白质的氨基酸序列以便维持某些功能(例如结合配体的能力)，同时破坏其它功能(例如活化G-蛋白的能力)。本发明人已经发现，GPCR的第2胞内环中高度保守的残基特别适合于突变，因为它们使受体相对于其结合的G-蛋白而言成为基本上非功能性的。具体地，本发明人已经发现，该区中一个或多个残基的突变使GPCR相对于G-蛋白而言成为非功能性的(即G-蛋白未被活化)，但仍然能够结合配体。下文中更详细地讨论对GPCR的突变。
本发明在第二个方面中提供了生产第-个方面的生物学试剂的方法，所述的方法包括下列步骤(a)生产或提供编码第一种GPCR和第一种G-蛋白的融合蛋白的第一种核酸构建体，其中第一种GPCR与野生型相比得到突变，使得它相对于融合的G-蛋白而言为非功能性的；(b)生产或提供编码第二种GPCR和第二种G-蛋白的融合蛋白的第二种核酸构建体，其中第二种G-蛋白与野生型相比得到突变，从而使它成为非功能性的；(c)在细胞中共表达第一种和第二种核酸构建体，以便生产包括所述的第一种和第二种GPCR的GPCR寡聚体。
如果已经产生了第一种和第二种核酸构建体，那么该方法可以简单地包括下列步骤(a)在细胞中表达第一种核酸构建体，所述的核酸构建体编码第一种GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中GPCR与天然GPCR相比得到突变，由此使它相对于其G-蛋白而言成为非功能性的；(b)在所述细胞中表达第二种核酸构建体，所述的第二种核酸构建体编码第二种GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中G-蛋白与天然G-蛋白相比得到突变，由此使它成为非功能性的；(c)使所述的第一种和第二种融合蛋白在细胞膜中装配成GPCR寡聚体。
该方法可以进一步包括分离包括所述复合物的一部分细胞膜的步骤。可以通过溶解所述细胞并分离细胞膜完成该步骤。
如上所述，第一种GPCR和第二种GPCR可以相同(均-寡聚体)或不同(杂-寡聚体)。
本发明人认为为了使第一种和第二种GPCR形成寡聚体，它们必须彼此具有一定的亲和性。因此，本发明人已经设计了一种可以测定这种亲和性的方法。因此，作为本发明的第三个方面，提供了彼此具有亲和性以便形成复合物(GPCR寡聚体)的第一种和第二种GPCR的测定方法，所述的方法包括下列步骤(a)生产或提供编码作为融合蛋白的第一种GPCR及其结合的G-蛋白的第一种核酸构建体，其中GPCR与野生型相比得到突变，使得它相对于其结合的G-蛋白而言为非功能性的；(b)生产或提供编码第二种GPCR及其结合的G-蛋白的第二种核酸构建体，其中G-蛋白与野生型G-蛋白相比得到突变，使得它为非功能性的；(c)在细胞中共表达所述的第一种和第二种核酸构建体；和(d)确定包括所述的第一种和第二种GPCR的复合物的存在。
可以通过使所述细胞与用于所述第二种GPCR的配体接触并测定所述第一种G-蛋白是否被活化来确定包括所述的第一种和第二种GPCR的GPCR寡聚体的存在。
如上所述，所述的第一种和第二种GPCR可以不同。在它们不同的情况下，优选它们天然出现在同一细胞上。这能够合理地预计实际上形成所述的寡聚体。由于这一原因，所以所述的方法可以进一步包括测定哪些GCPRs存在于特定细胞类型上，即对同一细胞而言为内源性的起始步骤。因为充分地表征了许多GPCR，所以可以通过筛选特定细胞的基因产物，例如基于芯片的筛选或技术，诸如rt-PCR，随后通过测序来完成这一步骤。
测定彼此具有亲和性，即能够形成寡聚体的GPCR在药理学上具有显著的重要性。例如，两种受体形成寡聚体(杂或均)的能力可以为组织特异性的。因此，这些组织特异性GPCR寡聚体可以形成重要的药物靶物。表1中表示了可能与每一细胞类型相关的典型医学含义。
生产本发明的生物学试剂首次开辟了各种筛选试验的可能性，这些试验提供测定寡聚体功能，特别是在配体结合和随后的细胞信号级联放大方面的功能的便利和可靠的方式。
例如，在本发明的第四个方面中提供了检测化合物对GPCR寡聚体具有的作用的方法，包括下列步骤a)提供包括本发明第一个方面的生物学试剂的细胞或细胞膜；b)使化合物与所述细胞或细胞膜接触；和c)观察所述化合物对GPCR寡聚体，特别是对GPCR寡聚体的信号传导具有的作用。
本发明的该方面中还提供了鉴定能够与GPCR寡聚体发生相互作用的化合物的方法，所述的方法包括下列步骤a)生产表达GPCR寡聚体的细胞，所述的GPCR寡聚体包括(i)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中第一种GPCR相对于结合的第一种G-蛋白而言为非功能性的；(ii)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的；b)使所述细胞或分离的其细胞膜与所述化合物接触；c)测定所述化合物是否与GPCR寡聚体发生相互作用。
应理解包括GPCR寡聚体的细胞或细胞膜还包括非功能性或基本上非功能性的GPCR，例如包括第一种或第二种GPCR(i或ii)的单体；第一种GPCR的二聚体(i/i)；或第二种GPCR的二聚体(ii/ii)。本发明的优点在于这些单体或二聚体的形成不会影响筛选方法的结果，这是因为，由于对第一种和第二种GPCR进行了突变，所以唯一的功能受体(能够刺激G-蛋白和启动信号级联放大)为包括至少第一种和第二种GPCR的寡聚体。因此，任何单体或均-寡聚体(即两种第一种GPCR或两种第二种GPCR)与包括至少第一种GPCR和第二种GPCR的寡聚体相比均不具有除可能的本底活性外的活性。
本底活性被理解为指的是低于20％、15％、10％或优选5％的天然或野生型活性。
化合物在试验中与GPCR寡聚体的相互作用可以导致许多生物事件中的一种或多种。例如，相互作用可以导致配体结合位点的构象改变。这可以改变受体的天然配体的功效。另一方面，化合物与GPCR寡聚体的相互作用可以产生细胞受体信号级联放大，表明化合物为潜在的激动剂。该化合物可以结合到存在于天然GPCR单体上的配体结合位点上或它可以结合到作为GPCR寡聚化结果生成的新结合位点上。
本发明第四个方面的方法可以用于测定能够结合GPCR寡聚体的新配体(激动剂、拮抗剂等)。可能的情况是这些配体不同于能够结合GPCR寡聚体的那些配体，可能的情况是这些配体不同于能够结合和活化相应GPCR单体的那些配体，或可能的情况是结合作用与各单体的结合作用可以不同。例如，与相应单体相反，配体与寡聚体结合可以产生改变的信号，例如增加或减少的信号，或可以导致不同的活化细胞途径。使用第四方面的方法可以测定所有这些受体寡聚体特性。
此外，所述化合物在试验中可以具有阻滞GPCR寡聚体的已知配体，例如激动剂的能力。为了测定这一情况，可以使化合物在有已知配体存在下与细胞接触并将配体活化GPCR的能力与其在没有所述化合物存在下活化GPCR的能力进行比较。
因此，本发明进一步提供了鉴定具有调节GPCR寡聚体与其配体结合能力的化合物的方法，所述的方法包括a)生产或提供表达GPCR寡聚体的细胞，所述的GPCR寡聚体包括(i)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中第一种GPCR相对于结合的第一种G-蛋白而言为非功能性的；(ii)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的；b)使所述细胞在有所述配体存在下与所述化合物接触；c)将所述配体结合GPCR寡聚体的能力与所述配体在相差无几条件，但没有所述化合物存在下结合GPCR的能力进行比较。
因此，所述化合物可以具有竞争性抑制配体与GPCR结合的能力或它实际上可以导致结合增加和/或受体刺激增加作为配体结合的结果，即它增加了配体的功效。
一种可能性在于第三种GPCR可以与GPCR寡聚体复合并具有变构效应。当化合物为第三种GPCR时，可以通过上述方法测定这种作用。在这种情况中，优选在至少一种细胞类型中内源性共表达野生型第三种GPCR与野生型第一种和第二种GPCR。
如上所述，能够在两种GPCR形成寡聚体时，其相应的配体结合位点可以改变和/或形成新的配体结合位点。这些结果可能具有显著的药理学重要性。因此，作为第五个方面，本发明进一步提供了用于确定不存在于相应单体上的GPCR寡聚体上的新的或改变的配体结合位点存在的方法，所述的方法包括下列步骤a)使化合物与表达GPCR复合物的第一种细胞接触，所述的GPCR复合物含有(i)与G-蛋白结合的第一种GPCR，其中第一种GPCR被修饰，使得它相对于所述G蛋白而言为非功能性的；和(ii)与G-蛋白结合的第二种GPCR，其中G-蛋白被修饰，使得它为非功能性的；b)使所述化合物与表达未修饰的第一种GPCR单体的第二种细胞接触；和c)将化合物对第一种细胞和第二种细胞的作用进行比较以便确定由GPCR寡聚体产生的新的或改变的配体结合位点的存在。
如果GPCR寡聚体为杂-寡聚体，即它包括至少两种不同的GPCR，则所述方法可以进一步包括下列步骤使化合物与表达未修饰的第二种GPCR单体的第三种细胞接触并再次比较化合物对第三种细胞的作用以便确定作为两种或多种GPCR寡聚化结果产生的新的或改变的配体结合位点的存在。
优选分别通过重组方式在所述第二种或第三种细胞中表达未修饰的(即功能性)第一种和第二种GPCR单体。
可以根据特定化合物能够在接触寡聚体，但不接触相应的单体时在细胞中产生受体信号级联放大这一事实确定新的配体结合位点的存在。
可以根据作为寡聚体与相应单体之间的受体信号级联放大改变，例如信号增加或减少和/或信号传导途径改变这一事实测定改变的配体结合位点的存在。
化合物对第一种或第二种细胞的“作用”包括其结合GPCR寡聚体的能力(例如，通过标记化合物测定)及其启动细胞信号级联放大的能力(例如，通过检测信号传导途径中的化合物活性的改变测定)。
尽管各种配体结合位点在受体寡聚化后保持不变，但是可以发生受体功能的其它改变。
因此，本发明进一步提供了用于确定作为形成GPCR寡聚体结果的GPCR功能改变的方法，所述的方法包括a)使化合物与表达GPCR寡聚体的第一种细胞接触，所述的GPCR寡聚体含有(i)与G-蛋白结合的第一种GPCR，其中第一种GPCR被修饰，使得它相对于所述G蛋白而言为非功能性的；和(ii)与G-蛋白结合的第二种GPCR，其中G-蛋白被修饰，使得它为非功能性的；b)使所述化合物与表达未修饰的第一种GPCR的第二种细胞和/或表达未修饰的第二种GPCR的第二种细胞接触；和c)将所述GPCR寡聚体的功能与所述未修饰的第一种GPCR的功能和/或与所述第二种GPCR的功能进行比较以便确定因寡聚化导致的受体功能改变。
在上述用于测定能够活化GPCR寡聚体的化合物(例如第四个方面)和用于测定因GPCR寡聚化导致的新的或改变的配体结合位点的存在(例如第五个方面)的方法中，本领域技术人员可以选择使第一种和第二种GPCR再突变以便再次测定配体结合的改变。操作GPCR蛋白质完全属于本领域技术人员的能力范围。例如，就本发明的所有方面而言，能够将GPCR融合蛋白再修饰成组成型活性形式。美国专利US6,555,339(引入本文作为参考)和PCT/US98/07496、WO 98/46995(引入本文作为参考)中提供了用于以组成型方式活化GPCR序列的方法实例。
本发明的生物学试剂还能够测定单体、均-寡聚体和杂-寡聚体之间的差异性G-蛋白偶联。
作为实例，本发明允许用于评价的方法得以实施，以便评价与杂二聚体(例如AB或BA)相比均二聚体(例如AA或BB)是否与不同的G蛋白偶联，该方法包括下列步骤(a)生产或提供多个融合蛋白，它们各自包括一种与多个不同G蛋白之一融合的GPCR(例如A和B)，所述的不同G蛋白包括所有主要的G-蛋白类别(例如Gs、Gq和Gi)。例如，一对含有通过在与Gs融合的第2胞内环中突变而失活的受体。在该对中的第二种受体含有与突变的Gs融合的功能受体，以便突变使G蛋白失活。
第二对含有通过在与Gq融合的第2胞内环中突变而失活的受体。在该对中的第二种受体含有与突变的Gq融合的功能受体，以便突变使G蛋白失活。
第三对含有通过在与Gi融合的第2胞内环中突变而失活的受体。在该对中的第二种受体含有与突变的Gi融合的功能受体，以便突变使G蛋白失活。
可以按照类似方式评价其它G蛋白，诸如G12和G13。
(b)生产或提供每种G蛋白的对照融合蛋白，它们带有未修饰的完整功能受体(A或B)和未修饰的完整功能G-蛋白。
因此，对任意一种G蛋白而言，可以制备几种构建体(a)受体突变的受体A与完整功能Gs、Gi和/或Gq融合；(b)受体为功能性的受体B与突变的Gs、Gi和/或Gq融合；(c)受体为功能性的受体A与突变的Gs、Gi和/或Gq融合；(d)受体突变的受体B与完整功能Gs、Gi和/或Gq融合；(e)制备受体A和B各自的Gs、Gi和Gq的完整功能融合体。
可以进行几种细胞转染以便比较各自的相关偶联。例如。为了比较Gs在均二聚体与杂二聚体之间的偶联效力，进行如下步骤(a)用上述a)和b)的组合转染第一种细胞。
(b)用上述c)和d)的组合转染第二种细胞。
(c)用受体A的完整功能融合体转染第三种细胞。
(d)用受体B的完整功能融合体转染第四种细胞。
比较各组合的反应以评价受体A和B的激动剂功效和组成活性。对每种G蛋白重复该方法。
Jurgen Wess(《药物疗法》(Pharm.Ther.)80卷，3期，1998)中提供了有关受体/G-蛋白-偶联选择性的分子基础，将该文献引入本文作为参考。
现在通过参照附图以实例的方式解释本发明的方面和实施方案。其它方面和实施方案对本领域技术人员而言显而易见。将文本中提及的所有对比文件引入本文作为参考。
图1表示如何预计发生突变体对对功能的重组的示意图。该附图以使用与一般使胞内钙浓度升高的G蛋白融合的GPCR为典型。
图2表示为何仅寡聚体(在这种情况中为二聚体)GPCR/G-蛋白融合体为功能性的且均聚形式为非功能性的示意图。
图3表示不同A类GPCR及其结合的G-蛋白以及GPCR的第2胞内环中适合于突变的残基(突出显示的)的代表。
图4表示α1b-肾上腺素受体-G11α融合蛋白的不同非功能性突变体对重组功能。
A.将表达40(I-IV)或80(V)fmol的各种α1b-肾上腺素受体-G11α融合蛋白的HEK293细胞膜用于测定在没有(空心条)或有(实心条)10μM去氧肾上腺素存在下的[35S]GTPγS结合。(1)野生型α1b-肾上腺素受体-G11α；(2)α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α；(3)Leu151Aspα1b-肾上腺素受体-G11α；(4和5)α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α+Leu151Aspα1b-肾上腺素受体-G11α。
B.Leu151Aspα1b-肾上腺素受体-G11α和α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α仅在它们被共表达时重组功能。测定HEK293细胞膜中没有(空心条)或有(实心条)10μM去氧肾上腺素存在下的[35S]GTPγS结合，其中共表达Leu151Aspα1b-肾上腺素受体-G11α和α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α(1)；或其中在膜制备前混合的分离的细胞群中表达两种构建体(2)；或分别由它们制备膜且然后在试验前混合(3)。
图5表示组胺H1受体-G11α融合蛋白的不同非功能性突变体对也可以重组功能。将表达25(1-4)或50(5)fmol的各种组胺H1受体-G11α融合蛋白的HEK293细胞膜用于测定在没有(空心条)或有(实心条)1mM组胺存在下的[35S]GTPγS结合。(1)野生型组胺H1受体-G11α；(2)组胺H1受体-Gly208AlaG11α；(3)Leu133Asp组胺H1受体-G11α；(4和5)组胺H1受体-Gly208AlaG11α+Leu133Asp组胺H1受体-G11α。
图6表示单个细胞中的GPCR二聚化和功能重组。转染EF88(来源于动物的小鼠胚胎成纤维细胞，其中使编码钙质动用G蛋白Gqα和G11α的基因失活)细胞以表达GPCR-G11α融合蛋白和GFP并监测激动剂配体升高胞内Ca2+的能力。
A.用GFP和组胺H1受体-G11α(黑色，n＝6)、组胺H1受体-Gly208AlaG11α(蓝色，n＝10)、Leu133Asp组胺H1受体-G11α(绿色，n＝12)以及组胺H1受体-Gly208AlaG11α和Leu133Asp组胺H1受体-G11α(红色，n＝8)转染EF88细胞。然后测定GFP阳性细胞对1mM组胺的反应。N＝定量的各细胞数。
B.仅正转染的细胞对激动剂有反应。用野生型组胺H1受体-G11α融合体与GFP共转染细胞。在所示的视野中，仅单个细胞表达GFP(左)。然后在这些细胞中监测基线(中央)和1mM组胺(右)刺激的Ca2+。较暖色表示[Ca2+]升高。仅在表达GFP的细胞中观察到荧光增加(较暖色)。
图7表示单个细胞中的GPCR二聚化和功能重组。具体地，该附图表示两种不同的GPCR形成寡聚体，即杂-寡聚体的能力。
A.转染EF88细胞以共表达与野生型G11α融合的组胺H1受体的非功能形式(Leu133Asp)和与G11α的失活形式(Gly208Ala)融合的α1b-肾上腺素受体的野生型形式。这两种GPCR-G蛋白融合体在单独被表达时都是无活性的，因为它们各自形成非功能性的均二聚体。用GFP共转染允许检测正转染的细胞。添加去氧肾上腺素(10μM)导致胞内钙浓度升高，而添加组胺(1mM)使钙浓度几乎没有改变或无改变。这一结果仅可以反映出激动剂去氧肾上腺素占据α1b-肾上腺素受体导致与失活的组胺H1受体以物理方式连接的野生型G11α活化并反映出功能性的α1b-肾上腺素受体-组胺H1受体杂二聚体的存在。
B.也按照类似方式转染EF88细胞以共表达与野生型G11α融合的α1b-肾上腺素受体的非功能形式(Leu151Asp)和与G11α的失活形式(Gly208Ala)融合的组胺H1受体的野生型形式。在这种形式中，添加去氧肾上腺素(10μM)使钙浓度几乎没有改变或无改变，而添加组胺(1mM)导致胞内钙升高。
图8表示GPCR和GPCR-G蛋白融合体的差别表位标记形式的共免疫沉淀并证实向GPCR的C-末端尾添加G蛋白不会防止二聚化。
A.α1b-肾上腺素受体构建体。
B.组胺H1受体构建体。模拟转染HEK293细胞(对照组)或转染HEK293细胞以表达FLAG、c-myc或分离的GPCR或GPCR-G蛋白融合体的两种表位标记形式的组合(FLAG+myc)。还混合了表达FLAG或c-myc标记形式的细胞(混合物)。用抗-FLAG抗体对样品进行免疫沉淀，通过SDS-PAGE分离这些沉淀并用抗c-myc抗体对其进行免疫印迹。
图9表示trFRET显示了GPCR和GPCR-G蛋白融合体的细胞表面寡聚体。
A.α1b-肾上腺素受体构建体。
B.组胺H1受体构建体。分别转染HEK293细胞(混合物)以表达分离的GPCR或GPCR-G蛋白融合体的FLAG或c-myc标记形式。然后将这些细胞彼此混合。还转染了HEK293细胞以共表达分离的GPCR或GPCR-G蛋白融合体的FLAG或c-myc表位标记形式(共转染)。然后使细胞接触Eu3+-标记的抗-c-myc抗体和别藻蓝蛋白标记的抗-FLAG抗体(参见方法)。然后如McVey等(2001)所述监测能量传递。能量传递与形成物理复合物(二聚体)的FLAG和c-myc标记的多肽类一致。当在不同细胞中表达时，FLAG与c-myc标记多肽类之间的距离过大而无法进行有效的能量传递，且在不同细胞中时，它们不能发生相互作用。这些实验由此起到阴性对照的作用。
图10表示非功能性GPCR-G蛋白融合蛋白对的共表达应产生50％的活性二聚体。如果在单个细胞中共表达两种不同的GPCR或GPCR-G蛋白融合体且A与A相互作用的亲和力与在A与B之间的相同，那么必然随机推测到AA、AB、BA和BB以等摩尔量存在。正如图2中所示，本发明人研发的方法确保了AA和BB不会对添加A或B的配体产生功能性反应。然而，AB和BA在添加A或B的配体时可能具有功能性(参见图7C)。因此，预计在共表达A和B后形成的二聚体中仅有50％为功能性的且它们是不同突变的融合蛋白的组合，例如AB或BA。
图11表示α1b-肾上腺素受体和组胺H1受体可以形成杂二聚体复合物。
A.在HEK293细胞中分别或共同(flag+myc)表达了组胺H1受体的FLAG-标记形式(flag H1)和α1b-肾上腺素受体的c-myc-标记形式(mycα1b)。还在分析前混合了各自表达两种构建体的细胞。用抗-FLAG对样品进行免疫沉淀并在SDS-PAGE和传递后，用抗-c-myc-抗体对其进行免疫印迹。
B.用Eu3+-标记的抗-c-myc和APC-标记的抗-FLAG抗体的组合处理共表达FLAG H1和c-myc α1b(实心条)的细胞或表达然后混合的这两种构建体中的任一种的单独的细胞群并且测定tr-FRET。
图12表示α1b-肾上腺素受体的失活形式的共表达可抑制组胺H1受体-G11α融合蛋白的信号传导。
转染HEK293细胞以表达组胺H1受体-G11α融合蛋白并与增加量的编码分离的失活Leu151Aspα1b-肾上腺素受体的cDNA一起表达。(A)将来自这些细胞的膜用于测定组胺H1受体-G11α融合蛋白的表达且将含有25fmol特异性[3H]美吡拉敏结合位点的量用于测定基线和1mM组胺-刺激的[35S]GTPγS结合。(B)转染EF88细胞以表达组胺H1受体-G11α融合蛋白(1)或与Leu151Aspα1b-肾上腺素受体一起共表达。然后评价1mM组胺升高细胞[Ca2+]i的能力。数据代表平均值+/-S.E.M.n＝6。
图13表示过量膜定向G11α的供给不会引起表达非功能性突变体对的细胞中的功能重组。转染HEK293细胞以表达c-myc-标记的α1b-肾上腺素受体-G11α融合蛋白(1)；与α1b-肾上腺素受体的N-末端和第一个跨膜区的c-myc-标记形式的C-末端连接的G11α(2)；α1b-肾上腺素受体和c-myc-Nt-TM1α1b-G11α构建体(3)；或c-myc-Nt-TM1α1b-G11α和α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α融合蛋白(4)。(A)通过SDS-PAGE分离膜样品并用抗-c-myc抗体进行免疫印迹。(B)基线(空心条)和10μM去氧肾上腺素刺激(实心条)的[35S]GTPγS结合在抗-c-myc免疫沉淀物中恢复。
详细描述图1表示本发明人预计由突变体对产生功能重组如何可以发生而由此形成功能性寡聚体的代表。正如可以观察到的，功能性寡聚体由如下成分构成第一种融合蛋白(a)，包括天然GPCR和突变体G-蛋白；和第二种融合蛋白(b)，包括突变体GPCR和天然G-蛋白。当这两种融合蛋白合并时，GPCR信号级联放大的功能活化通过结合第一种融合蛋白的天然GPCR的激动剂配体发生且功能偶联和信号传导通过第二种融合蛋白的G-蛋白进行。
图2表示如何预计形成非功能性均二聚体。非功能性均二聚体包括两种天然GPCR和两种突变体G-蛋白(a)或两种突变体GPCR和两种天然G-蛋白(b)。在各自的情况中，均二聚体的两种形式在合适的配体结合GPCR时不能产生功能性信号传导。
GPCR和结合的G-蛋白GPCR和G-蛋白可以为任意合适的GPCR/G-蛋白组合。GPCR的非限制性实例可以在http//www.gpcr.org/7tm/上找到。优选GPCR和G-蛋白来源于哺乳动物，更优选来源于人。典型的G蛋白偶联受体例如为多巴胺受体、毒蕈碱性胆碱能受体、α-肾上腺素能受体、β-肾上腺素能受体、阿片受体、大麻素受体、5-羟色胺受体、促生长素抑制素受体、腺苷受体、内皮受体、趋化因子受体、黑皮质素受体、神经肽Y(NPY)受体、GnRH受体、GHRH受体、TSH受体、LH受体和FSH受体。在如下文献中描述了可以用于本发明的其它GPCR(与其配体)S.P.H.Alexaqnder & J.A.Peters编译的《药理学科学趋势离子通道命名法增刊》(Trends in Pharmacological SciencesIonChannel Nomenclature Supplement)，第11版，Current Trends，London，UK 2000；和《受体分类与信号转导RBI手册》(The RBIHandbook of Receptor Classification and Signal Transduction)，K.J.Watling，J.W.Kebabian，J.L.Neumeyer，eds.ResearchBiomedicals International，Natick，Mass.，1995.Vassilatis等PNAS，2003年4月，100卷，4903-4908。将这些参考文献引入本文作为参考。
就本发明的所有方面而言，优选的情况是，当第一种与第二种GPCR不同时，它们被至少一种细胞类型内源性共表达。
目前将GPCR分成3个主要类别-A、B & C。A类也称作视紫红质-类或视紫红质族受体；B类为促胰液素类受体；C类为促代谢(metabotropic)受体。尽管它们均为GPCR，但是这三族不具有序列相似性且看起来已经成为趋同进化的实例。A类的实例包括诸如肾上腺素、组胺、多巴胺和5-羟色胺这类儿茶酚胺类的受体以及(神经)肽类，包括阿片样活性肽、神经激肽、食欲素等的受体。嗅感受器也为该组的组成部分。B类受体总计大约有65种且C类受体约有18种，它们包括GABAb受体、钙传感受体和7种促代谢谷氨酸受体的族。存在最终仍然分类为GPCR的其它族蛋白质。它们包括“卷曲的”受体族和″Methuselah″受体。
G-蛋白可以为任意能够与GPCR结合/偶联的G-蛋白。G-蛋白优选具有调节Ca2+、cAMP、cGMP、肌醇1，4，5三磷酸、二酰基甘油、蛋白激酶C活性或MAP激酶活性的胞内水平的能力。
例如，Gi、Go或Gz的活化导致cAMP的胞内水平下降。Gq、G11、G15或G16的活化导致肌醇1，4，5三磷酸和Ca2+的胞内水平增加。
G-蛋白还可以选自Gi、Go、Gz、G11、G12、G13、G15、G16、Gs和Gq组成的组。
除本文鉴定的外，在本领域技术人员的读者的知识范围内可以基于序列信息充分鉴定其它GPCR。所有GPCR均带有7个足以通过质膜的长度(20-25个氨基酸)的高度疏水区。其中基本上始终存在某些氨基酸。例如，在A类GPCR中，实际上始终存在序列天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸或极为相似的某些序列(因天冬氨酸(D)-精氨酸(R)-酪氨酸(Y)的单字母氨基酸代码而称作DRY结构域)。本领域技术人员还可以使用诸如″Hidden Markov″法这类数学算法进行检索以鉴定其它GPCR。
适宜的情况是，所述的GPCR可以为A类GPCR，其实例与它们结合的G-蛋白如图3中所示。
GPCR和G-蛋白的修饰图3还表示了GPCR的第2胞内环中例如适合于突变和赋予GPCR基本上非功能性的高度保守的残基。本发明人已经证实使这些残基突变可以特别有效地使GPCR失活，但仍然能够结合配体。此外，因为疏水残基为高度保守的，所以预计可以按照这种方式使所有A类GPCR突变以使它们失活。一般来说，残基为疏水残基，例如，可以通过本领域中公知的定点诱变技术使疏水残基突变成酸性残基。然而，可以进行使GPCR功能失活或基本上功能失活的任意其它突变且关于测定杂二聚体活性可以使用下文所述的试验检测其活性/缺乏活性。即，可以对诱变的GPCR进行用于天然GPCR的功能性试验，以便在诱变处理后确定多少程度的活性保留下来。如果第一个循环的诱变不足以使GPCR失活，可以再进行一次诱变循环并在此后检测活性。
还能够进行随机诱变或应用分子进化且然后检测突变体活性。此外，G蛋白的晶体结构是已知的且根据它鉴定重要的残基，以便可以进行定向诱变。
本领域技术人员可以使用公众可得到的互联网站(http//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)鉴定具有GPCR结构的跨膜结构域。它允许进行定点诱变以确定使GPCR失活，但仍然能够结合配体的突变体。可以将第2胞内环(IC2)定义为跨膜(TM)3与TM4之间的多肽节段。该站点至少可以在鉴定相邻的GPCR氨基酸序列方面提供指导，所述相邻的GPCR氨基酸序列需要与图3中的IC2序列进行序列对比以便进行类似的突变。
一般通过使结合的G-蛋白与受体融合修饰本文所述的膜GPCR。一般可以使编码G-蛋白的核酸与编码已经消除了终止密码子的特定GPCR的基因的3′末端进行符合读框的融合。以这种方式，在表达核酸时，对报道蛋白进行功能表达并使其与GPCR的C-末端融合。修饰该受体使得膜受体的功能性基本上保持不受G-蛋白与该受体融合的影响。
可以对G-蛋白进行的突变可以为赋予G-蛋白非功能性的任意合适的突变(即不能与GTP功能性结合和启动GPCR信号级联放大)。此外，本领域技术人员易于使用本文所述的试验测试这种突变。可以进行的一种合适的突变为例如使G11α的208位上的甘氨酸突变成丙氨酸。所有G-蛋白均在208位，或等同位点/残基上带有甘氨酸且由此可以预计等同的突变使其它G-蛋白失活。易于鉴定其它合适的突变，因为它们可以影响使蛋白质结合和水解GTP的序列。迄今为止，已经观察到G-蛋白序列通过进化为高度保守的且所鉴定的在使蛋白质结合和水解GTP中所涉及的序列为高度保守的。
因此，相对直接的任务在于能够使任意受体(天然的或突变体)与合适的G-蛋白(天然的或突变体)偶联。
组成型活性的GPCR和功能基因组在当今的药物研发中可能最具挑战的步骤涉及靶物的确立。近年来已经获得成果的大量的公开的和非公开的人类基因组测序工作提供了用于药物研发的空前数量的基因靶物。解密这些基因靶物的功能性，且最重要的是它们的潜在治疗关联性作为研发下一代治疗剂的基础具有高度前瞻性。这种挑战的等级并不比在较大数量的新基因已经得到鉴定的GPCR基因族内的挑战大。由于已经鉴定了在所关注的组织内表现出高度或选择性表达的GPCR，所以能够进一步将分析改进至细胞水平。这一过程可能涉及使用RNA探针和抗体以便对表达任意所关注的GPCR的组织内的细胞群作图。
就没有鉴定的配体的孤独GPCR而言，可以将受体的组成型活性形式用作进一步研究其功能作用的工具。这类手段本质上模拟了配体刺激对靶GPCR的作用。例如，已经鉴定了在胰腺B细胞中选择性表达的孤独GPCR作为鉴定调节胰岛素分泌的潜在靶物的手段。在体外系统中检验一种这类受体“胰岛受体1”的组成型活性形式证实该受体与合适的细胞信号传导分子(腺苷酸环化酶)偶联以便调节胰岛素释放。此外，在产生胰岛素的细胞系中利用这种组成型活性受体证实该受体的活性形式促进了葡萄糖敏感性胰岛素释放。这些数据提供了支持研发“胰岛1”GPCR激动剂作为调节胰岛素释放的手段的高度建设性信息。
为了全面地检验GPCR表达，寡核苷酸GPCR芯片已经由ArenaPharmaceuticals Inc.，6166 Nancy Ridge Drive，San Diego，CA92121，USA.合成，它含有所有可得到的人GPCR序列以及用于细胞功能和疾病状态的标记。这种手段能够快速鉴定大规模通过各种人体组织的GPCR的基因表达特性。还可以应用簇丛分析以鉴定可以显示功能作用的基因表达的组织特异性模式。评价GPCR和相关信号传导分子的组织分布由此可以阐明受体信号传导转导胞外刺激的分子机制的复杂性。对人类基因组的测序带来了新的途经，通过这种途经，可以采取整体法来研究GPCR信号传导的宽度。目前据估计GPCR超家族由600-1000个受体组成。微阵列技术的出现考虑到了对受体族进行大规模取样。这项技术允许人们在指定样品中同时监测数以千计的基因的信息水平。对通过一大组组织的这些基因的转录水平进行评价由此可以对人体内GPCR的信号传导提供整体见解。
适合于表达修饰的GPCR和G-蛋白的细胞各种细胞可以用于表达编码本发明融合蛋白的核酸构建体。将可以转染以表达修饰的GPCR的所有细胞看作属于本发明的范围。这类细胞的实例包括新生儿细胞、内分泌细胞、肿瘤细胞、腺泡细胞、胰岛细胞、免疫细胞、神经内分泌细胞、神经元细胞和垂体细胞。完全在本领域技术人员能力范围内还有确定能够表达本发明修饰的GPCR的其它细胞系，例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞(CHO-K1)和HEK(人胚肾)细胞。
在进行本发明的试验过程中，可以优选使用不将任何内源性GPCR表达至高水平的细胞系。CHO-K1为这类细胞系的实例。
可以选择某些表达本发明GPCR寡聚体的细胞，因为它们具有对GPCR信号级联放大起反应的能力。例如，在用于测定GPCR寡聚体的配体的试验中，便利的是可以在受体活化时具有可检测到的特征改变的细胞，例如色素细胞中表达GPCR。US 5,462,856(引入本文作为参考)中描述了使用色素细胞系研发用于评价GPCR的新激动剂和拮抗剂的快速和灵敏性生物测定的方法。下文中更详细地讨论用于测定GPCR活性的试验。因此，可以用本发明的核酸构建体转染的色素细胞包括载色素细胞、载黑色素细胞或黑素细胞、黄色素细胞、红色素细胞、白色素细胞和虹细胞。这类细胞可以便利地获自低等动物，诸如爬行纲，例如安乐蜥属；两栖纲，例如非洲爪蛙；Pieces，例如，Zaccotemmincki；甲壳纲，例如Uca pugilator；棘皮动物门，例如，Diademaantillarum；和Cinidaria，例如Nanomsa cara。用于本发明的特别优选的色素细胞为来自非洲爪蛙的培养的载黑色素细胞(《色素细胞》(Pigment Cell)1985)，ed.Bagnara等，University of Tokyo Press，219-227页)和Lerner等(1988)P.N.A.S.USA，85261-264。
使用核酸构建体转染细胞完全属于本领域技术人员的能力范围。标准方法包括脂质转染胺(lipofectamine)、磷酸钙沉淀、电穿孔、基因枪、脂质体和病毒载体。
表达载体，例如质粒、病毒载体等为可复制的DNA构建体，其中核酸可操作地与能够引起特定细胞中膜受体/报道基因融合体表达的合适控制序列连接。控制序列一般可以包括转录启动子、控制转录的任选的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和/或翻译终止的序列。表达载体一般可以包括例如质粒、噬菌体或病毒且这类载体可以整合入宿主基因组或在特定细胞中自主复制。
各种表达载体是本领域技术人员可得到的。优选的载体为寄存在ATCC并给予ATCC#203351寄存号的pCMV。
为了使特定细胞表达突变体GPCR/G-蛋白融合蛋白，必须用合适的表达载体转化细胞。本文所用的“转化”指的是将异源多核苷酸片段导入宿主细胞，而与使用的方法无关，例如直接摄入、转染或转导。
本发明因此还涉及已经用包括本发明突变体GPCR/G-蛋白融合体转化并表达突变体GPCR/G-蛋白融合蛋白的细胞。在本发明的方法中，可以在使用前溶解细胞，使得仅可以使用GPCR定位的细胞膜。
用于测定GPCR活性的试验由于使用编码修饰的GPCR的核酸构建体共转染了细胞，所以可以评价至少对功能性(第二种)GPCR具有特异性的至少一种配体的结合。可以通过大量标准和众所周知的技术测定本发明GPCR寡聚体的功能活性。已知GPCR影响腺苷酸环化酶活性，以便调节电压控制的钙通道的传导性、调节钾通道、激活MAP激酶途经、激活磷脂酶C(PLC)-IP3途经、活化磷酸酪氨酸磷酸酶、刺激有丝分裂、刺激胞吐作用、刺激白细胞郁积、刺激趋化性和诱导编程性细胞死亡。本领域技术人员可以使用常规和标准方法测定这些活性。还可以在用于测定GPCR配体的试验中使用这些技术测定功能活性(参见下文)。
可以通过测定所述GPCR信号级联放大的下游组成部分的水平观察所述化合物对GPCR杂二聚体起作用所具有的影响。检测的一种适宜的组成部分为钙的水平/钙水平的改变。一般为钙离子。作为对钙检测的替代选择，还能够使用结合活性G蛋白的GTP类似物作为检测试剂且还有本领域技术人员公知的报道基因试验。
可以通过本领域技术人员公知的监测胞质钙水平的方法检测正常和异常细胞中的胞质钙水平。可以使用指示剂染料，例如荧光探针(诸如fura-2、fluo-3或-4、indo-1、quin-2)在结合钙时表现出光谱响应且然后能够例如使用荧光显微术、流式细胞计量术和荧光光谱学检测胞内游离钙浓度的改变。大部分上述荧光指示剂为非荧光钙螯合剂EGTA和BAPTA的变化形式。其它实例可获自，例如MoleclarProbes，Oregon，USA。
另外，本方法特别适合于研发高流通量筛选，其中例如可以使用CCD照相机、发光计或任意其它合适的光检测系统进行检测。以这种方式，例如，可以将细胞/细胞膜维持在可以加入检测胞内钙必不可少的测试物质和试剂的多孔平板中。此外，可以使用商购的仪器，诸如“基于FLIPR-荧光(flumetric)成像的平板读出器”(MolecularDevices Corp，Sunnyvale，CA，USA)。还可以使用称作“变色龙”的钙的新荧光指示剂且它不需要使用辅因子进行遗传编码并可靶向至具体的胞内位置。这些所谓的“变色龙”由绿色荧光蛋白(GFP)、钙调蛋白、钙调蛋白-结合肽M13的发射蓝色或青绿色的突变体和增强发射绿色或黄色的GFP的衔接融合体组成。钙的结合使得钙调蛋白包裹在M13结构域周围，从而增加(Miyawaki等1997)或减少(Romoser等1997)了侧翼GFPs之间的荧光共振能量传递。
另一种胞内钙浓度测定的方法在于如Sheu等(1993)所述使用超表达GPCR和脱辅基水母发光蛋白的细胞系。在该系统中，将表达脱辅基水母发光蛋白的细胞与为水母发光蛋白辅因子的coelenterazine一起温育。在该温育过程中，coelenterazine进入细胞并与脱辅基水母发光蛋白缀合形成水母发光蛋白，为该酶的活性形式。在将细胞与GPCR激动剂一起温育时，胞内钙浓度增加。这种增加导致水母发光蛋白的催化活性活化，从而氧化coelenterazine并产生脱辅基水母发光蛋白、coelenteramide、CO2和光。一旦发射了光予，则复合物必然解离且脱辅基水母发光蛋白必然与新的coelenterazine分子重组以便能够再次发光。因此，在该系统中，添加激动剂后光发射的测定结果反映出其活化GPCR且由此增加胞内钙浓度的能力。
其它合适的检测机理包括检测除Ca2+外的其它第二信使(例如cAMP水平、cGMP水平、肌醇1，4，5三磷酸水平、二酰基甘油水平、蛋白激酶C活性或MAP活性)。还能够使用报道基因，因为活化GPCR一般随时间导致基因表达改变(可以使用与对cAMP水平改变或激酶活化作出反应的启动子元件偶联的报道基因进行该步骤)。另外的方法如US5,462,856(引入本文作为参考)和US6,051,386(引入本文作为参考)所述使用黑素细胞，这两篇文献中描述了方法，其中因GPCR功能活化产生的信号改变细胞中色素聚集状态且细胞看起来因色素沉着而近乎不透明，例如易于通过比色法检测。改变聚集状态可以使聚集增加或反之使聚集减少(分散)。
报道基因试验还可以使用各种报道基因系统评价来自GPCR寡聚体的信号传导。为了测定胞内cAMP水平的改变，可以优选由含有环AMP反应元件(CRE)的启动子驱动的报道基因构建体。为了测定由导致蛋白激酶C活化的Gq途经驱动的反应，可以优选在其启动子序列中含有AP1位点的PKC-敏感性报道基因系统。对MAP激酶活化敏感的其它报道基因和含有血清反应元件(SREs)的报道基因也可以用于测定来自GPCR寡聚体的反应。报道分子自身可以在一定范围内且它们的实例包括荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。
配体结合的测定本发明特别适合于测定与GPCR结合作为寡聚化结果的新配体。可以测试本领域技术人员众所周知的天然存在和合成的配体。合适的测试配体可以来源于组合文库、肽和肽模拟物、确定的化学个体、寡核苷酸和可以针对活性筛选的天然产物文库。在一种可能的手段中，例如，候选物质可以分批用于开始的筛选，例如，每一反应使用10种物质，且分别测试表现出作用的那些批次的物质。
一般来说，可以将本试验用于筛选对特定膜GPCR起作用的化合物。例如，鉴定为对特定膜受体具有作用的化合物可以用于调节野生型和/或突变体膜受体的活性；可以用于完善特定膜受体的生理功能；和/或可以用于鉴定化合物的筛选中，所鉴定的化合物破坏正常的膜受体相互作用或自身可以破坏这类相互作用。
本试验特别适合于检测用作膜受体的反激动剂、拮抗剂或激动剂的化合物。将术语反激动剂理解为指在与受体结合时选择性稳定和由此增加不能诱导下游信号的一种或多种构象的受体的化合物。将激动剂理解为指在与受体结合时选择性稳定和由此增加能够诱导下游信号的一种或多种构象的受体的化合物。将拮抗剂理解为指在与受体结合时不具有富集活性或无活性构象的选择性能力且由此无法改变它们之间的平衡的化合物。
本发明因此还涉及使用本发明试验鉴定的受体蛋白的反激动剂、拮抗剂或激动剂并涉及这类反激动剂、拮抗剂或激动剂在研究二聚体或寡聚体GPCR功能或疗法中的应用。
具体实施例方式
下文提供了实施本发明的具体实施例并概括了导致本发明的本发明人所进行的工作。
材料和方法来源于组合的Gαq/Gα11双剔除小鼠(Offermans等，1998)的成纤维细胞细胞系(EF88)(Gohla等，1999)为M.I.Simon博士(California Institute of Technology，Pasadena CA)的赠品。用于组织培养的所有材料均由Life Technologies Inc.(Paisley，Stratclyde，UK)提供。[3H]哌唑嗪(80Ci/mmol)、[3H]美吡拉敏(30Ci/mmol)和[35S]GTPγS(1250Ci/mmol)来自NEN/Perkin Elmer。寡核苷酸购自Cruachem(Glasgow，Strathclyde，UK)。用于时间分辨荧光共振能量转移的试剂来自Wallac。受体配体购自RBI(Gillingham，Kent，U.K.)。抗-Gq/G11α抗血清CQ的生产和表征由(Mitchell等，1991；Mitchell等1993)描述。用针对于预计的C-末端十肽的抗肽抗血清通过免疫法检测Gq/G11α的广泛分布。《FEBS通讯》(FEBSLett.)287，171-174。
所有其它化学药品来自Sigma(Poole，Dorset，U.K.)且属于可得到的最高等级。
融合蛋白的构建如(Carrillo等，2002)所述进行野生型和突变的α1b-肾上腺素受体-Gα11融合蛋白的生产和亚克隆。在两个单独的阶段中进行人组胺H1受体-G11α融合蛋白的生产和亚克隆。在第一个步骤中，使用氨基-末端引物5′-GATACTGGGCTATCCAAGCTTATGAGCCTCCCCAATTCCTC-3′，通过PCR将HindIII限制位点(加下划线的)导入人组胺H1受体编码序列的上游。使用羧基-末端引物5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGGAGCGAATATGCAGAATTCTCT-3′，将三氨基酸间隔基(Ser-Gly-Arg)和NotI限制位点紧接着导入终止密码子的上游。类似地，通过PCR，使用氨基-末端引物5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGACTCTGGAGTCCATGATGGC-3′和羧基-末端引物5′-ATGAAACCGCTCGAGTCACACCAGGTTGTACTCCTTCAG-3′扩增小鼠G11α序列。该步骤分别导入了位于G11α编码序列侧翼的NotI和XhoI限制位点。在第二个步骤中，用HindIII/NotI消化扩增的受体片段并用NotI/XhoI消化G11α片段。纯化这些片段并连入预先用HindIII/XhoI消化的pcDNA 3载体(Invitrogen)。对胞内环2Leu-Asp突变体的选择基于Greasley等2001的研究。在大部分A类GPCR中，等同的位置也为疏水氨基酸(参见图2)。使用PCR诱变，通过定向诱变的标准方法(Sambrook等和Carrillo等，Manufacturers Kit等)将这类突变导入融合蛋白构建体。
为了进行共免疫沉淀和trFRET研究，在NH2-末端甲硫氨酸后紧接着导入c-myc(EQKLISEEDL)或FLAG(DYKDDDDK)表位。对每一构建体进行完整测序，此后对其进行表达和分析(Mitchell等，1991；Mitchell等，1993)。
HEK293细胞的瞬时转染在37℃下和5％CO2加湿气体环境中将HEK293细胞维持在补充了0.292g/升L-谷氨酰胺和10％(v/v)新生小牛血清的DMEM中。使细胞生长至60-80％融合，此后在60mm平皿中进行瞬时转染。使用LipofectAMINE试剂(Life Technologies，Inc.)，按照制造商的说明进行转染。
GTPγS结合通过将含有定量融合构建体(详见结果)的膜添加到含有所示浓度受体配体的测定缓冲液(20mM HEPES(pH 7.4)、3mM MgCl2、100mMNaCl、1μM 鸟苷5’-二磷酸、0.2mM抗坏血酸、50nCi[35S]GTPγS)中启动[35S]GTPγS结合实验。在相同条件下但在有100μM GTPγS存在下测定非特异性结合。将该反应体系在30℃下温育15分钟并通过添加含有20mM HEPES(pH 7.4)、3mM MgCl2和100mM NaCl的0.5ml冰冷缓冲液终止反应。在4℃下将样品以16,000g离心15分钟并将所得沉淀重新悬浮于增溶缓冲液(100mM Tris、200mM NaCl、1mM EDTA、1.25％ Nonidet P-40)+0.2％十二烷基硫酸钠中。用Pansorbin(Calbiochem)预净化样品，随后用CQ抗血清进行免疫沉淀(Mitchell等，1993)。
最后，用增溶缓冲液将免疫复合物洗涤两次并通过液体-闪烁光谱测定法测定结合的[35S]GTPγS。
配体结合研究如(Carillo等，2002)中所述进行用于监测含有α1b-肾上腺素受体的构建体的表达的[3H]哌唑嗪结合研究。通过将3μg细胞膜添加到含有[3H]美吡拉敏(0.1-10nM)的测定缓冲液(50mM Tris-HCl、100mMNaCl、3mM MgCl2，pH 7.4)中启动用于监测含有组胺H1受体的构建体的表达的[3H]美吡拉敏结合试验。在有100μM美吡拉敏存在下测定非特异性结合。将该反应体系在25℃下温育30分钟并通过经GF/B滤膜的真空过滤从游离配体中分离结合的配体。用测定缓冲液将滤膜洗涤两次并通过液体-闪烁光谱测定法估计结合的配体。
i成像在37℃下以及95％空气和5％CO2气体环境中使EF88细胞生长在补充了10％(v/v)加热失活的胎牛血清和L-谷氨酰胺(1mM)的DMEM中。将胰蛋白酶消化过程中收集的部分细胞平板固定在玻璃盖玻片上且在24小时生长期后，使用LipofectAMINE(Life Technologies Inc.)，按照制造商的说明转染它们。3小时后，用OPTIMEM 1将细胞洗涤两次且然后在DMEM生长培养基中再培养24小时。将含有相关cDNA种类的总计3μg的pCDNA 3用于转染每一盖玻片。通过在减弱光条件下的含有染料的膜透性乙酰氧基甲酯形式(1.5μM)的DMEM生长培养基中温育(15-20分钟，37℃)给转染的EF88细胞中加载Ca2+-敏感性染料。成像研究的详细内容及其分析描述在Liu等，2002中。
GPCR共免疫沉淀研究如(McVey等，2001)所述，使用α1b-肾上腺素受体和组胺H1受体构建体的FLAG和c-myc标记形式进行共免疫沉淀研究。在使用组胺H1受体进行的研究中，加入30U/ml内切糖苷酶F。
时间分辨荧光共振能量传递如(McVey等，2001)中所述使用Eu3+-标记的抗-c-myc抗体和别藻蓝蛋白-标记的抗-FLAG抗体对完整的HEK293细胞进行时间分辨荧光共振能量传递。
结果本发明人已经预先生产了α1b-肾上腺素受体与结合包括[3H]哌唑嗪在内的激动剂和拮抗剂配体的G11的α亚单位的融合蛋白(Carillo等，2002)。向为表达这种构建体转染的HEK293细胞膜中添加激动剂去氧肾上腺素对使用针对G11α的C-末端十肽的抗血清的测定免疫沉淀结束后监测的[35S]GTPγS结合产生显著刺激(图4A)。
将Gly208AlaG11α突变体导入融合蛋白基本上消除了在使用表达等量该构建体的膜时对[35S]GTPγS的去氧肾上腺素刺激(图4A(2)，因为G蛋白的这种形式不能释放结合的GDP。然而，这种突变没有改变[3H]哌唑嗪或去氧肾上腺素的结合特性)。
上述研究已经证实在α1b-肾上腺素受体的胞内环2中疏水氨基酸的突变可以消除激动剂介导的信号转导(Greasley等，2001)。本发明人由此生产了Leu151Aspα1b-肾上腺素受体与G11α的融合蛋白。它结合了[3H]哌唑嗪和去氧肾上腺素作为野生型融合蛋白(未显示)，但去氧肾上腺素还不能刺激[35S]GTPγS的结合(图4A(3))。然而，两种功能性突变体的共表达重组了去氧肾上腺素介导的[35S]GTPγS的结合(图4A(4))且在所用的膜量中含有两倍于用于各构建体的[3H]哌唑嗪结合位点时，激动剂介导的[35S]GTPγS水平几乎与使用野生型融合构建体时同样高(图4A(5))。
功能的重组要求共表达两种突变体融合体。如果在单独的细胞群中表达两种构建体且在膜制备前混合细胞或分别制备膜且然后在试验前合并，那么没有观察到激动剂刺激的[35S]GTPγS的结合(图4B)。这类结果与GPCR二聚化是激动剂功能所需的推定一致。此外，在该二聚体内，一种GPCR元件活化以物理方式与配偶体GPCR连接的G蛋白。
为了扩展这一基本概念，使用组胺H1受体与G11α的融合体进行了等同的一组实验。基本结果相同。含有GPCR与G蛋白的野生型形式的融合体在有组胺存在下对[35S]GTPγS结合产生了显著刺激(图5(1))。这一结果在单独表达组胺H1受体-Gly208AlaG11α融合蛋白(图5(2))或Leu133Asp组胺H1受体与野生型G11α的融合体(图5(3))时不存在。这两种突变体的共表达再次重组了G蛋白的激动剂活化(图5(4))。此外，在共表达这两种突变体后，表达2倍以上数量[3H]拮抗剂结合位点的膜在添加激动剂组胺时产生了与分离中表达的野生型组胺H1受体-G11α融合蛋白同样高水平的[35S]GTPγS结合(图5(5))。
作为对这些研究的扩展，本发明人试图监测单个细胞中的功能重组和二聚化。为了进行这种尝试，他们使用了应用EF88细胞的Ca2+成像。EF88细胞为来源于Gqα/G11α双剔除小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞的品系(Mao等，1998；Yu和Hinkle，(1999)。它们由此需要表达功能性GPCR和功能性Ca2+动用G蛋白以使胞内[Ca2+]升高(Liu等，(2002；Stevens等，2001)。在导入组胺H1受体或α1b-肾上腺素受体的野生型形式与G11α激动剂之间的融合体时使胞内[Ca2+]升高(图6)。
这种情况仅在正转染的细胞中出现。当EF88细胞抗拒转染时，本发明人使用强化的绿色荧光蛋白(GFP)共转染以使正转染的细胞显色。仅对GFP呈阳性的那些细胞对激动剂配体起反应(图6b)。就组胺H1受体和α1b-肾上腺素受体而言，含有非激动剂反应性GPCR或G蛋白突变体的融合体无法升高胞内[Ca2+]。然而，共表达非功能性融合体对可以再次产生有效的信号(图6a、6b、7a和7b)。
本发明人还直接证实了分离的GPCR和GPCR/G蛋白融合体形成二聚体/寡聚体的能力。构建体为用c-myc或FLAG标记物标记的N-末端表位。在HEK293细胞中共表达α1b-肾上腺素受体的标记形式，但并未对其进行单独表达、随后进行细胞混合后，使用抗-FLAG抗体进行免疫沉淀在有抗-c-myc免疫反应性存在下产生沉淀(图8a)。SDS-PAGE显示存在通过与α1b-肾上腺素受体的单体和二聚体形式一致的53kDa和110kDa表观大小的c-myc抗体鉴定的带。还在接近凝胶顶部观察到了抗c-myc免疫反应性且这一结果可表示高级寡聚体或聚集的蛋白质(图8a)。当使用α1b-肾上腺素受体-G11α融合蛋白进行等同实验时，得到了类似的结果，但抗-c-myc反应带目前具有的表观质量为90kDa和200kDa，与这种融合蛋白的单体和二聚体形式的预计大小一致(图8A)。对组胺H1受体的FLAG和c-myc标记形式获得了类似的结果(图8B)。分离的受体的单体形式作为约50kDa多肽迁移，而对二聚体形式预计作为约100kDa多肽迁移(图8B)。此外，当使用α1b-肾上腺素受体时，还检测到了一系列较高分子量的种类。当使用组胺H1受体-G11α融合蛋白时，也便利地检测到了单体和二聚体种类(图8b)。
已经提出了有关仅依赖于共免疫沉淀的GPCR二聚化数据的意义和可靠性方面的一系列问题(Milligan G，2001；Salim等，2002)。本发明人由此使用时间分辨荧光共振能量传递(tr-FRET)监测了完整HEK293细胞中分离的α1b-肾上腺素受体和α1b-肾上腺素受体-G11α融合蛋白的二聚化/寡聚化。当共表达分离的GPCR或融合蛋白的c-myc和FLAG-标记形式时，在添加作为能量供体的Eu3+-标记的抗-c-myc抗体与作为能量受体的别藻蓝蛋白(APC)-标记的抗-FLAG抗体的组合时，获得了清楚的能量传递信号(图9A)。当在添加所述抗体前混合的单独细胞群中表达GPCR构建体的标记形式时，未获得能量传递信号。在表达组胺H1受体和组胺H1受体-G11α融合蛋白的N-末端c-myc和FLAG-标记形式的HEK293细胞中获得了等同的结果(图9B)。
为了检验组胺H1受体与α1b-肾上腺素受体之间杂二聚化的能力和GPCR二聚体使G蛋白活化的机制，本发明人共表达了组胺H1受体的FLAG-标记形式和α1b-肾上腺素受体的c-myc-标记形式。在使用抗-FLAG抗体和SDS-PAGE进行免疫沉淀后，在与仅通过所用电泳条件部分分离的组胺H1受体-α1b-肾上腺素受体杂二聚体的免疫沉淀一致的50和100kDa表观分子量的多肽类中检测到了c-myc免疫反应性(图11A)。在共表达组胺H1受体的FLAG-标记形式和α1b-肾上腺素受体的c-myc-标记形式后进行的tr-FRET研究证实了在细胞表面存在组胺H1受体/α1b-肾上腺素受体杂二聚体(图11B)，不过，绝对信号水平显示这些形成的杂二聚体的有效性低于相应的均二聚体对(参见与图11B比较的图9A和9B的y-轴)。与在所述的均二聚体的研究中一样，当在分析前混合表达这些受体中的每一种的单独的细胞群时，没有观察到tr-FRET信号(图11B)。
当在EF88细胞中与α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α一起共表达Leu133Asp组胺H1受体-G11α时，去氧肾上腺素能够升高胞内[Ca2+]，但组胺不能(图12A)。这种情况仅在α1b-肾上腺素受体活化与Leu133Asp组胺H1受体以物理方式连接的G蛋白时发生。当通过共表达Leu151Aspα1b-肾上腺素受体-G11α和组胺H1受体-Gly208AlaG11α使该方案反向进行时，组胺使胞内[Ca2+]升高，而去氧肾上腺素不能(图7B)。为了扩展这种类型的分析，将组胺H1受体-G11α融合体与不能活化G蛋白且由此刺激[35S]GTPγS结合的分离的Leu151Aspα1b-肾上腺素受体一起共表达。对[35S]GTPγS结合的组胺刺激与表达相同水平的仅组胺H1受体-G11α融合体的膜相比显著减少(图12A)。这类数据与产生失活的与组胺H1受体-G11α的杂二聚体的Leu151Aspα1b-肾上腺素受体一致并表明所述杂二聚体中的组胺H1受体不会活化以物理方式与之结合的G蛋白。在共转染中的组胺产生的其余信号反映出在有Leu151Aspα1b-肾上腺素受体存在下仍然形成某些功能性组胺H1受体-G11α均二聚体。实际上，当本发明人将组胺H1受体-G11α与增加量的Leu151Aspα1b-肾上腺素受体cDNA一起共表达时，组胺使表达相同数量的组胺H1受体结合位点的膜中[35S]GTPγS结合的能力因Leu151Aspα1b-肾上腺素受体cDNA水平增加而下降(图12A)。在EF88细胞中共转染Leu151Aspα1b-肾上腺素受体与组胺H1受体-G11α后，获得了类似的结果。对胞内[Ca2+]的组胺刺激显著下降(图12B)。
共表达两种不同的GPCR必须使相应的均二聚体存在并提供使杂二聚体形成的可能性。本发明人希望确保在共表达Leu133Asp组胺H1受体-G11α与α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α时观察到的Ca2+信号传导的重组并不反映仅存在α1b-肾上腺素受体和组胺H1受体的均二聚体且α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α均二聚体单纯能够接触并活化与Leu133Asp组胺H1受体-G11α均二聚体连接的G11α。为了提高膜适当靶向的G蛋白的水平，生产了一种构建体，其中G11α与α1b-肾上腺素受体的N-末端和第一个跨膜区的c-myc-标记形式的C-末端连接(c-myc-Nt-TM1α1b-G11α)。当将其转染入HEK293细胞时，膜部分的免疫印迹清楚地显示其表示为53和47kDa双峰，无论是使用抗-c-myc(图13A)还是抗-G蛋白抗血清(数据未显示)进行检测。基于使用抗-c-myc抗体进行的免疫检测，c-myc-Nt-TM1α1b-G11α的水平显著高于c-myc-α1b-肾上腺素受体-G11α融合蛋白的水平(图13A)。[35S]GTPγS结合试验(在该试验结束时，使用抗-c-myc抗体对c-myc-Nt-TM1α1b-G11α构建体进行免疫沉淀)证实了该构建体不结合[35S]GTPγS作为对去氧肾上腺素的反应(图13B)。平行实验表明抗-c-myc抗体确实俘获了去氧肾上腺素刺激的[35S]GTPγS与全长c-myc-标记的α1b-肾上腺素受体-G11α融合蛋白的结合(图13B)。然而，共表达c-myc-Nt-TM1α1b-G11α与分离的α1b-肾上腺素受体同样不会对抗-c-myc免疫沉淀物中的[35S]GTPγS结合产生显著刺激(图13B)且这一结果在c-myc-Nt-TM1α1b-G11α与α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α融合蛋白共表达时也是如此(图13B)。因此，单纯增加膜结合的G蛋白浓度不会使α1b-肾上腺素受体或α1b-肾上腺素受体-融合蛋白均二聚体活化这种G蛋白。这一结果强烈主张来自失活的组胺H1受体和α1b-肾上腺素受体受体G蛋白融合体对共表达的数据必须因杂二聚体内的反式激活而产生。
用于测定胞内钙浓度的荧光成像平板读出器(FLIPR)试验的实施例将来自相应克隆品系的靶受体(实验)和pCMV(阴性对照)稳定转染的细胞以5.5×104个细胞/孔接种入聚-D-赖氨酸预处理的含有完全培养基(DMEM含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠)的96-孔平板(Becton-Dickinson，#356640)，在第2天用于试验。为了制备Fluo4-AM(分子探针，#F14202)温育缓冲储备溶液，将1mgFluo4-AM溶于467μl DMSO和467μl Pluoronic acid(分子探针，#P3000)而得到1mM储备溶液，可以将其贮存在-20℃下1个月。Fluo4-AM为荧光钙指示剂染料。
在洗涤缓冲液(pH 7.4下的1X HBSS/2.5mM Probenicid/2o mMHEPES)中制备候选化合物。
在试验时，从孔中取出培养基并向细胞中加载100μl pH 7.4下的4μM Fluo4-AM/2.5mM Probenicid(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培养基。要求将在37℃/5％CO2下的温育持续60分钟。
在1小时温育后，除去Fluo4-AM温育缓冲液并用100μl洗涤缓冲液将细胞洗涤2X。在各孔中保留100μl洗涤缓冲液。将平板放回37℃/5％CO2下的恒温箱内60分钟。
使FLIPR(荧光成像平板读出器；Molecular Device)执行程序以便在第30秒时添加50μl候选化合物并再记录150秒该候选化合物引起的胞内[Ca2+]浓度的瞬时改变。将总荧光改变计数用于使用FLIPR软件测定激动剂活性。仪器软件校准了荧光读数而得到0时的等同起始读数。
在某些实施方案中，包括靶受体的细胞进一步包括混杂Gα15/16或嵌合Gq/Giα单位。
尽管上述提供了使用稳定转染细胞对激动剂活性进行的FLIPR试验，但是本领域技术人员能够便利地改变该试验以便表征拮抗剂活性。所述的本领域技术人员还易于理解，在另一方面，可以使用瞬时转染的细胞。
用于检测配体结合的载黑色素细胞试验的实施例载黑色素细胞为在低等脊椎动物中发现的皮肤细胞。它们含有称作黑素体的色素细胞器。载黑色素细胞能够在G-蛋白偶联受体(GPCR)活化时沿微管网络重分配这些黑素体。这种色素运动的结果为细胞明显发亮或颜色变深。在载黑色素细胞中，因Gi-偶联受体活化导致的胞内cAMP水平下降使黑素体迁移至细胞中心，从而导致颜色明显发亮。如果在Gs-偶联受体活化后，cAMP水平升高，那么黑素体再分散且细胞看起来再次颜色变深。因Gq-偶联受体活化导致的二酰基甘油水平升高也可以诱导这种再分散。此外，这项技术还适合于研究某些受体酪氨酸激酶。载黑色素细胞的反应在受体活化的数分钟内发生且产生单纯强烈的颜色改变。易于使用常用吸收度微量平板读出器或适当的视频成像系统检测到这种反应。不同于其它皮肤细胞，载黑色素细胞来源于神经嵴且看起来可以表达信号蛋白。特别是，这些细胞表达极其广泛的G-蛋白且由此能够以功能方式表达几乎所有的GPCR。
载黑色素细胞可以用于鉴定化合物，包括天然配体、激动剂GPCR。该方法可以通过下列步骤进行导入能够分散或聚集其色素作为对特异性刺激的反应的色素细胞系并表达编码GCPR的外源性克隆。刺激剂，例如褪黑素设立了色素分布的起始状态，其中如果GPCR的活化诱导色素分散，那么色素聚集在测试细胞内。然而，用刺激剂刺激细胞可以设定色素分布的起始状态，其中如果GPCR的活化诱导色素聚集，那么色素分散。然后使测试细胞接触化学化合物并测定细胞中的色素分布是否因色素分布的起始状态而改变。因候选化合物，包括，但不限于配体而导致色素细胞分散，所以与GPCR偶联看起来在培养皿上的颜色变深，而色素细胞聚集看起来发亮。
材料和方法遵循美国专利US 5,462,856和美国专利US 6,051,386中披露的内容。将这些专利公开文献的全部内容引入本文作为参考。
将细胞平板固定在96-孔平板(一种受体/平板)中。转染后48小时，用10nM褪黑素处理每一平板上一半的细胞。褪黑素激活了载黑色素细胞中的内源性Gi-偶联受体并使它们聚集其色素。将剩余的一半细胞转入不含血清的培养基0.7X L-15(Gibco)中。1小时后，不含血清的培养基中的细胞保持色素分散状态，而褪黑素-处理的细胞呈色素聚集状态。此时，用产生剂量反应的选择的测试化合物处理细胞。如果平板固定的GPCR与选择的测试化合物结合，那么可以预计载黑色素细胞发生了颜色改变作为对所述化合物的反应。如果受体为Gs或Gq偶联受体，那么褪黑素-聚集的载黑色素细胞可以发生色素分散。相反，如果受体为Gi-偶联受体，那么可以预计色素分散的细胞发生剂量依赖性色素聚集。
讨论通过使用α1b-肾上腺素受体和组胺H1受体与G蛋白G11α的融合蛋白，本发明人目前证实这些GPCR二聚化且这一结果并不因将G蛋白添加到GPCR的C-末端尾而受到损害。同样，通过使用trFRET检测完整细胞中的GPCR二聚体/寡聚体，他们能够证实在细胞表面上存在这些复合物。这一结果也并不因将G蛋白序列添加到GPCR上而受到损害。此外，通过将防止G蛋白的激动剂活化的突变导入GPCR或G蛋白，本发明人生产了能够在共表达时恢复激动剂介导的功能的非功能性融合蛋白对。以两种方式监测功能重组。首先，激动剂仅能够在共表达分离中各自为非功能性的两种突变体后EF88细胞中产生升高的胞内[Ca2+]。EF88细胞缺乏磷脂酶C-偶联G蛋白的表达且由此必需导将合适的GPCR和G蛋白导入这些细胞以产生Ca2+信号。这一试验具有明显有益性的方面在于Ca2+成像允许本发明人监测单细胞中的功能性二聚化。可以在信号转导级联中测定的最早期步骤之一为G蛋白上激动剂诱导的鸟嘌呤核苷酸交换。可以根据[35S]GTPγS的结合便利地监测这一步骤。在所有的[35S]GTPγS结合试验中，本发明人最初通过使用饱和[3H]拮抗剂结合研究测定了GPCR G蛋白融合蛋白的表达水平。这一过程允许他们将含有定量构建体的膜量加入到试验中。本发明人已经预先证实激动剂刺激的[35S]GTPγS结合随增加量GPCR-G11α融合蛋白的添加而呈线性增加(Stevens等，2001)。当共表达组胺H1受体-Gly208AlaG11α和Leu133Asp组胺H1受体-G11α融合蛋白时，要求存在两倍数量的[3H]拮抗剂结合位点以产生基本上与仅表达野生型组胺H1受体-G11α融合蛋白时相同量的激动剂刺激的[35S]GTPγS结合。这一结果提供了良好的证据，即功能元件为二聚体或高级寡聚体。如果功能性组胺H1受体为二聚体，那么当共表达两种非功能性突变体融合体时，产生的半数二聚体随机应为非功能性的，因为它们为组胺H1受体-Gly208AlaG11α或Leu133Asp组胺H1受体-G11α的均二聚体。可以预计50％的二聚体为含有组胺H1受体-Gly208AlaG11α的一个拷贝和Leu133Asp组胺H1受体-G11α的一个拷贝的功能性杂二聚体(图10)。这些研究还支持了如下构思就C类GPCR而言，aminergic A类GPCR通过反式激活机制起作用。可以被活化的二聚体中G蛋白的拷贝与GPCR的非功能形式连接，而GPCR的功能形式与非功能性G蛋白结合。
为了进一步支持这一机制，本发明人利用了已知的结构相关GPCR形成杂二聚体的能力。最初的研究证实当共表达时，可以使组胺H1受体和α1b-肾上腺素受体共免疫沉淀。此外，在EF88细胞中共表达Leu133Asp组胺H1受体-G11α和α1b-肾上腺素受体-Gly208AlaG11α使去氧肾上腺素而非组胺介导的[Ca2+]i升高。如果α1b-肾上腺素受体活化以物理方式与失活组胺H1受体连接的G蛋白，那么仅可以发生上述结果(图2)。当实验以反向进行以便无活性的α1b-肾上腺素受体与野生型G蛋白连接且野生型组胺H1受体与突变体G蛋白连接时，组胺为功能性的，但去氧肾上腺素不是。本发明人通过当将组胺H1受体融合蛋白与增加量的分离且失活的Leu151Aspα1b-肾上腺素受体一起共表达时，检验组胺刺激[35S]GTPγS结合的有效性而扩展了这一构思。组胺的作用下降。这类信息与增加水平的组胺H1受体-G11α-Leu151Aspα1b-肾上腺素受体杂二聚体减少了组胺H1受体-G11α均二聚体的量且与所述杂二聚体结合的组胺不能使与组胺H1受体以物理方式结合的G蛋白活化这一观点一致。在这种情况中，当Leu151Aspα1b-肾上腺素受体不能刺激任何G蛋白时，去氧肾上腺素是无活性的。大量报导证实GPCR-G蛋白融合体可以与内源性表达的G蛋白以及所述融合体中的G蛋白元件发生相互作用并活化它们(Burt等，1998，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem)273，10367-10375；Molinari等，2003《生物化学杂志》(J.Biol.Chem)278，15778-15788)。然而，在这些研究中，已经以极高水平表达了GPCR-G蛋白融合体，所述的极高水平属于已经报导的因膜中的物理邻近性而产生的非特异性“旁观者”(Mercier等，2002《生物化学杂志》(J.Biol.Chem)277，44925-44931)作用的范围。EF88细胞的应用消除了与内源性G蛋白发生相互作用的可能性，因为它们不表达Gqα或G11α且由此的作用必须反映出融合的G蛋白的活化。此外，在将Gly208Ala突变导入融合体的G蛋白元件后，对转染的HEK293细胞膜中[35S]GTPγS结合的激动剂刺激实际上得到消除。这一结果表明在达到的表达水平下，尽管表达了内源性Gqα或G11α，但实际上，HEK293细胞中的内源性Gqα或G11α没有活化。在HEK293细胞中的异二聚化实验中，将过量的G蛋白与第二种GPCR按照1∶1的摩尔比导入，这是因为由融合体确定的GPCR和G蛋白的化学计算量为1∶1。为了评价这些结果是否可以简单地归因于存在的额外G蛋白，本发明人通过可选策略提供了额外的G蛋白。为了进行这类步骤，生产了与α1b-肾上腺素受体的N-末端和第一个跨膜区连接的G11α形式。预先使用了用于其它G蛋白的等同构建体(Lee等，1999《生物化学》(Biochemistry)38，13801-13809，Guzzi等，2001《生物化学杂志》(Biochem J.)355，323-331，Molinari等，2003《生物化学杂志》(J.Biol.Chem)278，15778-15788)且已经提示与跨膜α螺旋结构的连接以特别有效的方向提供了用于活化的G蛋白(Molinari等，2003，如上所述)。尽管可以将这种构建体表达至显著高于α1b-肾上腺素受体-G11α融合体的水平，但是G蛋白并非由去氧肾上腺素活化，无论是单独表达还是与分离的α1b-肾上腺素受体或α1b-肾上腺素受体-G11α融合体组合表达。这些研究证实通过共表达GPCR-G蛋白融合体的非功能对重组信号必须反映出重组的二聚体内的内部反式激活。
表1
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权利要求
1.包含复合物的生物学试剂，所述的复合物具有(a)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中相对于结合的第一种G-蛋白而言，第一种GPCR为非功能性的；(b)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的。
2.权利要求1的生物学试剂，其中所述的复合物存在于细胞膜中。
3.权利要求1或权利要求2的生物学试剂，其中所述的第一种GPCR和第一种G-蛋白结合为融合蛋白，且其中所述的第二种GPCR和第二种G-蛋白结合为融合蛋白。
4.上述权利要求中任意一项的生物学试剂，其中所述的第一种GPCR带有与天然GPCR序列相比修饰的氨基酸序列，以便使它相对于第一种G-蛋白而言成为非功能性的。
5.权利要求4的生物学试剂，其中第一种GPCR的氨基酸序列在第2胞内环中被修饰。
6.权利要求4或权利要求5的生物学试剂，其中通过氨基酸残基替换修饰第一种GPCR的氨基酸序列。
7.权利要求6的生物学试剂，其中通过疏水氨基酸残基替换为酸性氨基酸残基修饰第一种GPCR的氨基酸序列。
8.权利要求4-7中任意一项的生物学试剂，其中所述的第一种GPCR带有选自图3中所示的组的第2胞内环的氨基酸序列且突出显示的氨基酸残基中的一个或多个被修饰。
9.上述权利要求中任意一项的生物学试剂，其中所述的第二种G-蛋白带有与天然G-蛋白相比修饰的氨基酸序列，以便使它成为非功能性的。
10.权利要求9的生物学试剂，其中所述的第二种G-蛋白与天然氨基酸序列相比通过至少一种氨基酸残基替换而得到修饰。
11.权利要求10的生物学试剂，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
12.上述权利要求中任意一项的生物学试剂，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
13.权利要求12的生物学试剂，其中A类GPCR选自图3中提供的组。
14.上述权利要求中任意一项的生物学试剂，其中所述的第一种GPCR不同于所述的第二种GPCR。
15.包括GPCR和G-蛋白的融合蛋白，其中GPCR维持结合配体的能力，而相对于野生型GPCR而言被修饰，使得它不能在配体结合后刺激所述的G-蛋白。
16.权利要求15的融合蛋白，其中GPCR的氨基酸序列在第2胞内环中被修饰。
17.权利要求15或权利要求16的融合蛋白，其中通过氨基酸残基替换修饰GPCR的氨基酸序列。
18.权利要求17的融合蛋白，其中通过疏水氨基酸残基替换为酸性氨基酸残基修饰GPCR的氨基酸序列。
19.权利要求15-18中任意一项的融合蛋白，其中GPCR带有选自图3中所示的组的第2胞内环的氨基酸序列且突出显示的氨基酸残基中的一个或多个被修饰。
20.包括GPCR和G-蛋白的融合蛋白，其中G-蛋白相对于其野生型而言被修饰，使得它为非功能性的。
21.权利要求20的融合蛋白，其中G-蛋白带有与野生型G-蛋白相比修饰的氨基酸序列，以便使它成为非功能性的。
22.权利要求21的融合蛋白，其中G-蛋白与野生型氨基酸序列相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到修饰。
23.权利要求22的融合蛋白，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
24.编码权利要求15-23中任意一项的融合蛋白的分离的核酸序列。
25.包括权利要求24的核酸序列的表达载体。
26.包括权利要求24的核酸序列或权利要求25的表达载体的宿主细胞。
27.生产权利要求1-14中任意一项的生物学试剂的方法，包括下列步骤(a)在细胞中表达第一种核酸构建体，所述的核酸构建体编码第一种GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中GPCR与野生型GPCR相比得到突变，由此使它相对于其G-蛋白而言成为非功能性的；(b)在所述细胞中表达第二种核酸构建体，所述的第二种核酸构建体编码第二种GPCR/G-蛋白融合蛋白，其中G-蛋白与野生型G-蛋白相比得到突变，由此使它成为非功能性的；(c)使所述的第一种和第二种融合蛋白在细胞膜中装配成一种复合物。
28.生产权利要求1-14中任意一项的生物学试剂的方法，所述的方法包括下列步骤(a)生产第一种核酸构建体，它编码第一种GPCR和第一种G-蛋白的融合蛋白，其中所述的第一种GPCR与野生型相比得到突变，使得它相对于融合的G-蛋白而言为非功能性的；(b)生产第二种核酸构建体，它编码第二种GPCR和第二种G-蛋白的融合蛋白，其中所述的第二种G-蛋白与野生型相比得到突变，从而使它成为非功能性的；(c)在细胞中共表达所述的第一种和第二种核酸构建体，以便产生包括所述的第一种和第二种GPCR的复合物。
29.权利要求27或权利要求28的方法，进一步包括步骤(d)分离包括所述复合物的一部分细胞膜。
30.权利要求27-29中任意一项的方法，其中所述的第一种GPCR与其野生型GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
31.权利要求30的方法，其中所述的至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
32.权利要求31的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换为酸性氨基酸残基。
33.权利要求31或权利要求32的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
34.权利要求27-33中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与野生型G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
35.权利要求34的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
36.权利要求27-35中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
37.权利要求36的方法，其中所述的A类GPCR选自图3中提供的组。
38.权利要求27-37中任意一项的方法，其中所述的第一种GPCR不同于所述的第二种GPCR。
39.彼此具有亲和性而形成GPCR寡聚体的第一种和第二种GPCR的测定方法，所述的方法包括下列步骤(a)生产第一种核酸构建体，它编码作为融合蛋白的第一种GPCR及其结合的G-蛋白，其中所述的GPCR与其天然GPCR相比得到突变，使得它相对于其结合的G-蛋白而言为非功能性的；(b)生产第二种核酸构建体，它编码作为融合蛋白的第二种GPCR及其结合的G-蛋白，其中所述的G-蛋白与其天然G-蛋白相比得到突变，使得它为非功能性的；(c)在细胞中共表达所述的第一种和第二种核酸构建体；和(d)确定包括所述的第一种和第二种GPCR的复合物的存在。
40.权利要求39的方法，其中通过使细胞与所述第二种GPCR的配体接触并确定所述第一种G-蛋白是否被激活来确定复合物的存在。
41.权利要求39或权利要求40的方法，其中所述的第一种GPCR与其天然GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
42.权利要求41的方法，其中所述的至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
43.权利要求42的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换为酸性氨基酸残基。
44.权利要求42或权利要求43的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
45.权利要求39-44中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与天然G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
46.权利要求45的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
47.权利要求39-46中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
48.权利要求47的方法，其中所述的A类GPCR选自图3中提供的组。
49.权利要求39-48中任意一项的方法，其中所述的第一种与第二种GPCRs不同。
50.权利要求39-49中任意一项的方法，其中野生型第一种和第二种GPCR被至少一种细胞类型内源性共表达。
51.确定因GPCR寡聚化而产生的新的或改变的配体结合位点存在的方法，所述的方法包括下列步骤a)使化合物与表达GPCR寡聚体的第一种细胞接触，所述的GPCR寡聚体含有(i)与G-蛋白结合的第一种GPCR，其中第一种GPCR被修饰，使得它相对于所述的G蛋白而言为非功能性的；和(ii)与G-蛋白结合的第二种GPCR，其中所述的G-蛋白被修饰，使得它为非功能性的；b)使所述的化合物与表达未修饰的第一种GPCR的第二种细胞接触和/或使所述化合物与表达未修饰的第二种GPCR的第二种细胞接触；和c)将所述化合物对第一种细胞的作用与对第二种细胞的作用进行比较，以便确定由所述GPCR寡聚体产生的新的或修饰的配体结合位点的存在。
52.确定作为形成GPCR寡聚体的结果的GPCR功能改变的方法，所述的方法包括a)使化合物与表达GPCR寡聚体的第一种细胞接触，所述的GPCR寡聚体含有(i)与G-蛋白结合的第一种GPCR，其中第一种GPCR被修饰，使得它相对于所述的G蛋白而言为非功能性的；和(ii)与G-蛋白结合的第二种GPCR，其中所述的G-蛋白被修饰，使得它为非功能性的；b)使所述的化合物与表达未修饰的第一种GPCR的第二种细胞和/或表达未修饰的第二种GPCR的第二种细胞接触；和(c)将所述GPCR寡聚体的功能与所述未修饰的第一种GPCR和/或与所述第二种GPCR的功能进行比较，以便确定因寡聚化导致的受体功能的改变。
53.权利要求52的方法，其中所述的受体功能的改变是化合物功效的改变。
54.权利要求52的方法，其中所述的受体功能的改变是因所述化合物使受体活化而导致的细胞信号传导途经的改变。
55.权利要求51-54中任意一项的方法，其中所述的第一种GPCR与其天然GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
56.权利要求55的方法，其中所述的至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
57.权利要求55或权利要求56的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换为酸性氨基酸残基。
58.权利要求56或权利要求57的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
59.权利要求51-58中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与天然G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
60.权利要求59的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
61.权利要求51-60中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
62.权利要求61的方法，其中所述的A类GPCR选自图3中提供的组。
63.权利要求51-62中任意一项的方法，其中所述的第一种与第二种GPCR不同。
64.确定化合物对GPCR寡聚体具有的作用的方法，包括下列步骤a)使所述化合物与表达GPCR寡聚体的第一种细胞接触，所述的GPCR寡聚体含有(i)与G-蛋白结合的第一种GPCR，其中第一种GPCR被修饰，使得它相对于所述的G蛋白而言为非功能性的；和(ii)与G-蛋白结合的第二种GPCR，其中所述的G-蛋白被修饰，使得它为非功能性的；b)检测因所述化合物与所述GPCR寡聚体接触产生的细胞信号的存在；和c)确定所述化合物对GPCR寡聚体具有的作用。
65.权利要求64的方法，其中所述的第一种GPCR与其野生型GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
66.权利要求65的方法，其中至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
67.权利要求66的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换的酸性氨基酸残基。
68.权利要求65或权利要求66的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述的至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
69.权利要求64-68中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与野生型G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
70.权利要求69的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
71.权利要求64-70中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
72.权利要求71的方法，其中A类GPCR选自图3中提供的组。
73.权利要求64-72中任意一项的方法，其中所述的第一种与第二种GPCR不同。
74.权利要求64-73中任意一项的方法，进一步包括下列步骤将所述的作用与因所述化合物与未修饰的第一种GPCR接触产生的作用和/或与因所述化合物与未修饰的第二种GPCR接触产生的作用进行比较。
75.鉴定能够与GPCR寡聚体发生相互作用的化合物的方法，所述的方法包括下列步骤a)提供表达权利要求1-14中任意一项的生物学试剂的细胞；b)使所述的生物学试剂与所述的化合物接触；和c)测定所述化合物是否与GPCR寡聚体发生相互作用。
76.权利要求75的方法，其中通过鉴定因所述相互作用产生的细胞信号的存在来确定所述化合物与GPCR寡聚体之间的相互作用。
77.权利要求76的方法，其中根据Ca2+、cAMP、肌醇1，4，5三磷酸水平、蛋白激酶C活化、MAP激酶活化的存在测定细胞信号。
78.权利要求76的方法，其中使用报道基因试验测定所述的细胞信号。
79.权利要求75或权利要求76的方法，其中所述的细胞为色素细胞且通过细胞中色素聚集状态的改变来测定细胞信号。
80.权利要求79的方法，其中所述的色素细胞为黑素细胞。
81.权利要求75-80中任意一项的方法，其中所述的化合物与作为激动剂、拮抗剂或反激动剂的所述GPCR寡聚体发生相互作用。
82.权利要求75-81中任意一项的方法，其中所述的第一种GPCR与其野生型GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
83.权利要求82的方法，其中所述的至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
84.权利要求83的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换为酸性氨基酸残基。
85.权利要求82或权利要求83的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述的至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
86.权利要求75-85中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与野生型G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
87.权利要求86的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
88.权利要求75-87中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
89.权利要求88的方法，其中A类GPCR选自图3中提供的组。
90.鉴定具有调节GPCR寡聚体与其配体结合的能力的化合物的方法，所述的方法包括a)提供表达GPCR寡聚体的细胞，所述的GPCR寡聚体包括(i)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中GPCR相对于G-蛋白而言为非功能性的；(ii)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的；b)使所述的细胞与测试化合物在所述配体存在下接触；和c)将所述配体结合GPCR寡聚体的能力与所述配体在相差无几的条件，但不存在所述化合物下结合GPCR寡聚体的能力进行比较。
91.权利要求90的方法，其中所述的化合物为蛋白质。
92.权利要求91的方法，其中所述的蛋白质为第三种GPCR。
93.权利要求92的方法，其中所述的第一种、第二种和第三种GPCR被至少一种细胞类型内源性共表达。
94.权利要求90-93中任意一项的方法，其中所述的配体结合到通过权利要求51和55-74中任意一项的方法测定存在于所述寡聚体上的新的或改变的配体结合位点上。
95.权利要求90-94中任意一项的方法，其中所述的第一种GPCR与其野生型GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
96.权利要求95的方法，其中所述的至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
97.权利要求96的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换为酸性氨基酸残基。
98.权利要求95或权利要求96的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述的至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
99.权利要求90-98中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与野生型G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
100.权利要求99的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
101.权利要求90-100中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
102.权利要求101的方法，其中A类GPCR选自图3中提供的组。
103.用于评价差异性G-蛋白偶联的方法，包括下列步骤a)提供表达GPCR寡聚体的第一种细胞，所述的GPCR寡聚体包括(i)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中GPCR相对于G-蛋白而言为非功能性的；(ii)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的；b)提供表达GPCR寡聚体的第二种细胞，所述的GPCR寡聚体包括(i)与所述第一种G-蛋白结合的所述第一种GPCR，其中所述的第一种GPCR为功能性的且所述的G-蛋白为非功能性的；(ii)与所述第二种G-蛋白结合的所述第二种GPCR，其中所述的第二种GPCR相对于G-蛋白而言为非功能性的；(c)提供表达与所述第一种G-蛋白结合的所述第一种GPCR的单体的对照细胞，其中GPCR和G-蛋白均为功能性的；(d)使所述的第一种、第二种和对照细胞与能够结合到存在于第一种和/或第二种GPCR上的配体结合位点上的化合物接触；(e)使用不同的第一种和/或第二种G-蛋白重复步骤(a)-(d)；和(f)评价差异性G-蛋白偶联。
104.权利要求103的方法，其中所述的第一种和第二种G-蛋白选自Gs、Gi、Gq、G11、G12、G13、G15、G16、Go或Gz。
105.权利要求103的方法，其中所述的第一种和第二种G-蛋白选自调节胞内水平的G-蛋白，所述的胞内水平选自Ca2+、cAMP、cGMP、肌醇1，4，5三磷酸、二酰基甘油、蛋白激酶C活性或MAP激酶活性的胞内水平。
106.权利要求103-105中任意一项的方法，其中所述的第一种与第二种GPCR相同。
107.权利要求103-106中任意一项的方法，其中所述的第一种与第二种GPCR不同。
108.权利要求103的方法，其中野生型第一种和第二种GPCR在至少一种细胞类型中被内源性共表达。
109.权利要求103-108中任意一项的方法，其中所述的第一种GPCR与其野生型GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
110.权利要求109的方法，其中所述的至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
111.权利要求110的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换为酸性氨基酸残基。
112.权利要求109或权利要求110的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述的至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
113.权利要求103-112中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与野生型G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
114.权利要求113的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
115.权利要求103-114中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
116.权利要求115的方法，其中A类GPCR选自图3中提供的组。
117.用于评价差异性G-蛋白偶联的方法，包括下列步骤a)提供表达GPCR寡聚体的第一种细胞，所述的GPCR寡聚体包括(i)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中GPCR相对于G-蛋白而言为非功能性的；(ii)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中第二种G-蛋白为非功能性的；b)提供表达与第一种G-蛋白结合的第二种GPCR的第二种细胞，其中GPCR和G-蛋白均为功能性的；(c)使所述的第一种和第二种细胞与能够结合到存在于第二种GPCR上的配体结合位点上的化合物接触；(d)使用不同的第一种G-蛋白将步骤(a)-(c)重复一次或多次；和(e)任选地使用不同的第一种GPCR将步骤(a)-(d)重复一次或多次；和(f)用第二种GPCR评价差异性G-蛋白偶联。
118.权利要求117的方法，其中所述的第一种和第二种G-蛋白选自Gs、Gi、Gq、G11、G12、G13、G15、G16、Go或Gz。
119.权利要求117的方法，其中所述的第一种和第二种G-蛋白选自调节胞内水平的G-蛋白，所述的胞内水平选自Ca2+、cAMP、cGMP、肌醇1，4，5三磷酸、二酰基甘油、蛋白激酶C活性或MAP激酶活性的胞内水平。
120.权利要求117-119中任意一项的方法，其中所述的第一种与第二种GPCR不同。
121.权利要求120的方法，其中野生型第一种和第二种GPCR在至少一种细胞类型中被内源性共表达。
122.权利要求117-121中任意一项的方法，其中所述的第一种GPCR与其野生型GPCR相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
123.权利要求122的方法，其中所述的至少一种氨基酸存在于GPCR的第2胞内环中。
124.权利要求123的方法，其中所述的至少一种氨基酸为疏水氨基酸残基且被替换为酸性氨基酸残基。
125.权利要求122或权利要求123的方法，其中所述的第2胞内环带有选自图3中所示的组的序列且所述的至少一种氨基酸残基选自突出显示的氨基酸残基。
126.权利要求117-125中任意一项的方法，其中所述的第二种G-蛋白与野生型G-蛋白相比通过至少一种氨基酸残基的替换而得到突变。
127.权利要求126的方法，其中被替换的氨基酸残基为甘氨酸。
128.权利要求117-127中任意一项的方法，其中所述的第一种和第二种GPCR为A类GPCR。
129.权利要求128的方法，其中A类GPCR选自图3中提供的组。
130.生产药物组合物的方法，该药物组合物包含能够与GPCR寡聚体发生相互作用的化合物，所述的方法包括下列步骤a)提供表达权利要求1-14中任意一项的生物学试剂的细胞；b)使所述的生物学试剂与所述的化合物接触；c)测定所述的化合物是否与GPCR寡聚体发生相互作用；和d)将所述的化合物与药物上可接受的载体混合以便生产药物组合物。
131.生产药物组合物的方法，该药物组合物包括具有调节GPCR寡聚体与其配体结合的能力的化合物，所述的方法包括a)生产表达GPCR寡聚体的细胞，所述的GPCR寡聚体包括(i)与第一种G-蛋白结合的第一种GPCR，其中GPCR相对于G-蛋白而言为非功能性的；(ii)与第二种G-蛋白结合的第二种GPCR，其中所述的第二种G-蛋白为非功能性的；b)使所述细胞与测试化合物在所述配体存在下接触；c)将所述配体结合GPCR寡聚体的能力与所述配体在相差无几的条件，但不存在所述化合物下结合GPCR寡聚体的能力进行比较；和d)将所述的化合物与药物上可接受的载体混合以便生产药物组合物。
132.治疗个体疾病的方法，包括对所述的个体给予有效量的权利要求75-90鉴定的化合物，其中所述的疾病与已知内源性共表达所述第一种GPCR和所述第二种GPCR的细胞类型相关。
133.权利要求132的方法，其中所述的第一种GPCR和所述的第二种GPCR被表1中包括的细胞类型共表达。
134.权利要求132或权利要求133的方法，其中所述的化合物为激动剂且所述的疾病通过增加所述寡聚体的活性被缓解。
135.权利要求132或权利要求133的方法，其中所述的化合物为拮抗剂且所述的疾病通过降低所述寡聚体的活性被缓解。
136.权利要求132或权利要求133的方法，其中所述的化合物为反激动剂且所述的疾病通过降低所述寡聚体的活性被缓解。
137.治疗个体疾病的方法，包括对所述的个体给予有效量的权利要求75-90鉴定的化合物，其中所述的疾病与已知内源性共表达所述第一种GPCR和所述第二种GPCR的细胞类型相关。
138.权利要求137的方法，其中所述的第一种GPCR和所述的第二种GPCR被表1中包括的细胞类型共表达。
139.权利要求137或权利要求138的方法，其中所述的配体为激动剂，所述的化合物增加所述激动剂与所述寡聚体的结合且所述的疾病通过增加所述寡聚体的活性被缓解。
140.权利要求137或权利要求138的方法，其中所述的配体为激动剂，所述的化合物减少所述激动剂与所述寡聚体的结合且所述的疾病通过降低所述寡聚体的活性被缓解。
141.权利要求137或权利要求138的方法，其中所述的配体为拮抗剂，所述的化合物增加所述拮抗剂与所述寡聚体的结合且所述的疾病通过降低所述寡聚体的活性被缓解。
142.权利要求137或权利要求138的方法，其中所述的配体为拮抗剂，所述的化合物减少所述拮抗剂与所述寡聚体的结合且所述的疾病通过增加所述寡聚体的活性被缓解。
143.权利要求137或权利要求138的方法，其中所述的配体为反激动剂，所述的化合物增加所述反激动剂与所述寡聚体的结合且所述的疾病通过降低所述寡聚体的活性被缓解。
144.权利要求137或权利要求138的方法，其中所述的配体为反激动剂，所述的化合物减少所述反激动剂与所述寡聚体的结合且所述的疾病通过增加所述寡聚体的活性被缓解。
全文摘要
本发明提供了涉及G－蛋白偶联受体(GPCR)寡聚体的材料和方法。本发明提供了与G－蛋白结合的两种或多种GPCRs的复合物。本发明还提供了包括GPCR和G－蛋白的融合蛋白、核酸、表达载体和宿主细胞。本发明还提供了生产本发明复合物和融合蛋白的方法。
文档编号G01N33/68GK1809587SQ200480017258
公开日2006年7月26日 申请日期2004年5月18日 优先权日2003年5月20日
发明者G·米利根, D·贝汉 申请人:格拉斯哥大学管理处