结节性硬化症途径的缺陷引起的疾病的诊断和治疗的制作方法

专利名称：结节性硬化症途径的缺陷引起的疾病的诊断和治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定TSC信号传导途径中的异常的组合物和方法。特别地，本发明涉及诊断和治疗诸如结节性硬化症之类的病症的方法，所述病症是由TSC基因中的突变引起的。本发明还涉及用于治疗由TSC信号传导紊乱介导的癌症的方法和组合物。
背景结节性硬化症(Tuberous Sclerosis，TSC)是相对常见的可遗传性基因病症，在每6000人口中发生约1例，并以多种器官中错构瘤的形成为特征(Young&Povey，Mol.Med.Today 4，313-319(1998))。常见的临床症状包括颠痫发作、智力迟钝、孤独症、肾衰竭、面部血管纤维瘤和心脏横纹肌瘤(Gomez，Ann.NY Acad.Sci.615，1-7(1991))。另外，许多患病个体在某些骨骼区内，尤其是手指和脚趾骨骼(指骨和趾骨)内，具有囊肿样区域。特有的皮肤病变包括可能在幼年时期形成的清楚界定的皮肤着色下降(色素沉着不足)的区域、以及自约四岁开始出现在面颊和鼻翼上的相对小的微红色小结。这些微红色病变最终扩大，混为一体(聚结)，并形成疣样外观(皮脂腺瘤)。也可能形成另外的皮肤病变，包括皮肤色素沉着增加的扁平“咖啡色”区域(咖啡牛奶斑)；出现在指甲周围或其下的良性纤维状小瘤(纤维瘤)；或者下背上粗糙隆起的“多节”性病变(鲨鱼皮样斑)。
TSC可能在出生时就存在，但病症迹象会很微小，且充分的症状需要些许时日形成。结果，TSC经常多年不被识别和误诊。在多数情况下，识别TSC的最初线索就是癫痫发作或延缓发育的存在。在其它情况下，最初的迹象可能是皮肤上的白斑(黑色素沉着不足斑)。
这种病症的诊断基于仔细的临床检查，结合可以显示脑中结节的头颅计算机断层分析(CT)或磁共振成像(MRI)，以及可以显示那些器官之中的肿瘤的心、肝和肾的超声波。诊断也包括仔细检查皮肤各种各样的皮肤特征、手指甲和脚趾甲的指甲纤维瘤、牙齿和齿龈的牙洞和/或齿龈纤维瘤、以及眼睛放大的瞳孔。可利用伍德灯或紫外光定位黑色素沉着不足斑，它们有时难以在婴儿以及淡色或浅色皮肤的个体中发现。
在婴儿中，如果孩子在出生时具有心脏横纹肌瘤或癫痫发作(婴儿痉挛)，则TSC可疑。通过皮肤和大脑的仔细检查，有可能在极小的婴儿中诊断TSC。然而，多数孩子一直到后来存活到当其癫痫发作开始以及其它症状如面部血管纤维瘤出现时都未被诊断。
对于结节性硬化症没有特效的疗法。治疗是对症进行的，可包括针对癫痫发作的抗痉挛疗法、针对皮肤症状的皮肤擦除术和激光去除技术、针对神经行为问题的药物疗法、治疗由肾脏问题导致的高血压、以及外科手术以去除生长的肿瘤。
结节性硬化症个体的预后随症状的严重程度而变化。没有治愈的。具有温和症状的那些个体一般行为良好并且过着长期多产的生活，而具有更严重形式症状的个体可能具有严重的残疾。在罕见的情况下，癫痫发作、感染或者重要器官中的肿瘤可能造成一些器官(如肾脏和脑)中的并发症，这可引起严重的麻烦甚至死亡。
需要改善的TSC早期诊断以允许更早的治疗。也需要另外的疗法。优选疗法为系统性治疗症状的那些疗法。

发明内容
本发明涉及用于鉴定TSC信号传导途径中的异常的组合物和方法。特别地，本发明涉及诊断和治疗诸如结节性硬化症之类的病症的方法，所述病症是由TSC基因中的突变引起的。本发明还涉及用于治疗由TSC信号传导紊乱介导的癌症的方法和组合物。
从而，在有些实施方案中，本发明提供了检测受试者中增强的S6激酶活性的方法，包括提供来自受试者的生物学样品；并检测所述生物学样品中增强的S6激酶活性。在有些实施方案中，检测增强的S6激酶活性包括S6激酶磷酸酶测定。例如，在有些实施方案中，S6激酶磷酸酶测定包括使磷酸化特异性的(phosphospecific)抗体与S6激酶底物杂交。在某些实施方案中，增强的S6激酶活性可指示选自TSC1蛋白和TSC2蛋白的失活蛋白。在有些实施方案中，失活蛋白是由于编码所述TSC1蛋白或所述TSC2蛋白的基因中的突变(如截短)引起的。在有些实施方案中，本发明还包括基于所述增强的S6激酶活性的检测，为所述受试者提供诊断的步骤。在有些实施方案中，所述诊断是诊断所述受试者中的结节性硬化症。在有些实施方案中，本发明还包括对所述受试者提供有关结节性硬化症的治疗的步骤。在有些实施方案中，所述治疗包括向所述受试者施用S6激酶抑制剂。本发明不限于特定的S6激酶抑制剂。可考虑任何合适的S6激酶抑制剂，包括但不限于雷帕霉素(rapamycin)和雷帕霉素衍生物。
本发明也提供了用于结节性硬化症诊断的试剂盒，其包含用于在受试者检测增强的S6激酶活性的试剂。在有些实施方案中，所述试剂包括对S6激酶底物特异性的磷酸化特异性的抗体。在有些实施方案中，所述试剂盒还包含有关利用所述试剂在所述受试者中诊断结节性硬化症的说明书。在某些实施方案中，所述说明书包括美国食品药品监督管理局所要求的用于体外诊断产品的说明书。
本发明还提供了在受试者中治疗结节性硬化症的方法，包括提供诊断患结节性硬化症的受试者；和S6激酶抑制剂；并向所述受试者施用所述抑制剂。在有些优选的实施方案中，所述施用导致所述受试者中结节性硬化症症状的减少。本发明不限于特定的S6激酶抑制剂。可考虑任何合适的S6激酶抑制剂，包括但不限于雷帕霉素和雷帕霉素衍生物。
又在其它实施方案中，本发明提供了筛选化合物的方法，包括提供表达S6激酶的细胞；和一种或多种测试化合物；并筛选所述测试化合物抑制所述S6激酶的激酶活性的能力。在有些实施方案中，筛选所述化合物抑制S6激酶活性的能力包括S6激酶磷酸酶测定。在有些实施方案中，S6激酶磷酸酶测定包括使磷酸化特异性的抗体与S6激酶底物杂交。在有些实施方案中，所述细胞在体外。在有些实施方案中，所述细胞为TSC2-/-细胞。在其它实施方案中，所述细胞在体内。在有些实施方案中，所述细胞处于非人动物(如大鼠或小鼠)之中。在有些实施方案中，所述大鼠为Eker大鼠。在有些实施方案中，所述测试化合物为药物。在有些实施方案中，所述测试化合物为雷帕霉素。在其它实施方案中，所述测试化合物为雷帕霉素衍生物。本发明还提供了由所述方法鉴定到的药物。
在其它实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，包括提供患有疾病的受试者和能够降低细胞能水平的试剂，并向所述受试者施用该试剂。在优选的实施方案中，所述疾病包含缺陷型细胞。在其它实施方案中，所述缺陷型细胞包含缺陷型TSC途径。在更进一步的实施方案中，所述方法还提供了向所述受试者共施用雷帕霉素。
在优选的实施方案中，缺陷型TSC途径包含TSC途径的缺陷型元件，例如TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、S6K和/或4EBP-1。
在有些优选的实施方案中，所述试剂靶向缺陷型细胞。在其它实施方案中，所述试剂会抑制己糖激酶。在其它实施方案中，所述试剂为2-脱氧-葡萄糖。在其它实施方案中，所述试剂为线粒体解偶联剂FCCP。在其它实施方案中，所述试剂会抑制PKC。在其它实施方案中，所述试剂为楸毒素(Rottlerin)。在又一些其它实施方案中，所述试剂为5-氨基咪唑-4-氨基甲酰核糖核苷酸。
在其它优选的实施方案中，所述疾病是结节性硬化症。在其它实施方案中，所述疾病是癌症。
本发明还提供了治疗疾病的方法，包括提供患有疾病的受试者和能够降低细胞能水平的试剂，并向所述受试者施用该试剂。在一些这样的实施方案中，所述疾病由(kb)基因中的突变造成，例如波-杰综合征(Peutz-Jeghers syndrome)，Cowden′s disease(多发性错构瘤综合征)，青年性息肉病(juvenile polyposis)，Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合症(以前的Bannayan-Zonana-，Riley-Smith-，和Ruvalcaba-Myhre-Smith综合症)。
在有些实施方案中，将S6激酶抑制剂(例如，雷帕霉素)以治疗水平提供给患有波-杰综合征或有关的癌症和/或错构瘤的受试者，包括但不限于Cowden′s disease(多发性错构瘤综合征)，青年性息肉病，Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征(以前的Bannayan-Zonana-，Riley-Smith-，和Ruvalcaba-Myhre-Smith综合征)。


图1显示了TSC1-TSC2对S6K的抑制。图1a显示了TSC1-TSC2抑制S6K激酶活性。如图所示，在存在或缺乏TSC1-TSC2下，将HA-S6K转染到HEK293细胞中。图1b显示TSC1-TSC2选择性抑制S6K中Thr 389而非Thr 421/Ser 424的磷酸化。图1c显示了TSC1-TSC2并不抑制Ras诱导的ERK的活化。图1d显示了Thr 389上S6K磷酸化的剂量依赖性抑制(左)。TSC1-TSC2对Akt的基础的或者胰岛素刺激的磷酸化作用没有影响(右)。
图2显示了内源性TSC2和来自疾病的突变对S6K磷酸化作用的影响。图2a显示了TSC2 RNA干预对S6K的基础的和刺激的磷酸化作用的促进。图2b显示了TSC2RNA干预增强了内源性S6K和S6的磷酸化。图2c显示了来自疾病的TSC2突变体在其抑制S6K的能力方面受损。
图3显示了Akt对TSC2的磷酸化。图3a显示了TSC2的Akt-依赖性迁移率变动(mobility shift)。图3b显示了体内32P-标记的TSC2的二维磷肽(phosphopeptide)图谱。图3c显示了在胰岛素(400nM)、LY294002(50μM)或雷帕霉素(20nM)存在下HA-TSC2的二维磷肽图谱。
图4显示了TSC2中Akt-依赖性磷酸化位点的确定。图4a显示了TSC2中推测的Akt磷酸化位点的示意图。果蝇(Drosophila)dTsc2中的保守位点加框表示。标出了用于体外Akt磷酸化测定的TSC2片段1和片段2区域。图4b显示了Akt磷酸化位点的突变分析。突变体标示于各图下方。图VIII为加框区的示意图，表示因相应的丙氨酸取代而改变的特定磷酸化位点。各突变体中缺失的磷肽在图I、II、IV和VI中以空心圆表示。图4c显示了纯化的Akt对重组TSC2片段的磷酸化作用。也显示了体外磷酸化的TSC2片段的二维磷肽图谱(底部)。
图5显示Akt磷酸化位点的突变改变了TSC2活性。图5a显示丙氨酸取代磷酸化位点增强了TSC2活性，而由酸性残基取代则降低活性。图5b显示了TSC2突变体对4E-BP1磷酸化的抑制。图5c显示了酸性残基取代会破坏TSC1-TSC2复合体的形成。图5d显示了TSC2的磷拟态(phosphomimetic)突变体是不稳定的。TSC2的稳定性是在放线菌酮(300μM，0-6h)的存在下测定的。图5e显示磷拟态TSC2突变体是高度泛素化的。
图6a和6b显示了本发明的其它实施方案。TSC1-TSC2会抑制S6K的营养物刺激的磷酸化和激酶活性(图6a)，表明TSC1-TSC2也参与营养物反应。
图7显示TSC1-TSC2通过mTOR发挥功能而抑制S6K。图7a显示S6K-dC104突变体的Thr 389磷酸化不受雷帕霉素的抑制。图7b显示TSC1-TSC2并不抑制S6K-dC104突变体的Thr 389磷酸化。图7c显示TSC1-TSC2并不抑制胰岛素诱导的S6K-dNC激酶活性。图7d显示TSC1-TSC2抑制mTOR激酶活性。图7e显示TSC1-TSC2抑制mTOR的磷酸化。TSC1-TSC2的共转染会抑制mTOR上Ser 2448的磷酸化，正如通过使用抗-磷-mTOR抗体的免疫印迹所检测到的那样(左)。RNAi-C对内源TSC2的减少增强了mTOR的磷酸化(右)。图7f显示了提出的关于TSC1-TSC2调节细胞生长功能的模型。
图8显示了2-DG能量耗尽(energy depletion)对S6K、S6、4EBP1、mTOR、Akt、AMPK和TSC2磷酸化的影响。图8a显示了ATP耗尽对S6K和4EBP1的脱磷酸化作用。图8b显示了TSC2的迁移率变动。图8c显示2-DG诱导内源性S6K、S6、4EBP1、mTOR而非AKT的脱磷酸化。图8d显示2-DG诱导AMPK的磷酸化。图8e显示了2-DG处理的时间曲线。图8f显示2-DG降低胞内ATP水平。图8g显示2-DG提高AMP/ATP比。图8h显示低葡萄糖抑制S6K。
图9显示2-DG刺激内源性AMPK和TSC2的相互作用。图9a显示2-DG刺激内源性TSC2和AMPK之间的免疫共沉淀。图9b显示了内源性TSC2和AMPK的交互免疫沉淀。图9c显示了内源性TSC1、TSC2、pAMPK和AMPK在HEK293细胞中的表达水平。图9d显示TSC2的C-末端片段与内源性AMPK相互作用。
图10显示TSC2对于2-DG诱导的S6K去磷酸化是必需的。图10a显示RNA干预破坏(knockdown)TSC2阻断了2-DG反应。图10b显示RNA干预破坏TSC2后并不阻断雷帕霉素诱导的S6K脱磷酸化。图10c显示AMPK过表达对S6K的抑制作用被TSC2 RNAi阻断。图10d显示TSC2的破坏对2-DG诱导的ACC和eEF2磷酸化作用几乎没有影响。图10e显示雷帕霉素对2-DG诱导的ACC和eEF2磷酸化作用几乎没有影响。图10f显示ATP耗尽诱导的S6K和4EBP1脱磷酸化作用在TSC2-/-细胞中受损。图10g显示2-DG诱导的4EBP1脱磷酸化作用在TSC2-/-细胞中受损。
图11显示ATP耗尽和AMPK诱导了TSC2磷酸化。图11a显示2-DG诱导的TSC2迁移率变动归因于磷酸化作用。图11b显示AMPK表达诱导缓慢迁移形式的TSC2。如图所示，HA-TSC1和Myc-TSC2与或不与活性AMPKαI亚单位共转染，并分别由抗-HA和抗-Myc抗体印迹。图11c显示AMPK抑制剂阻断2-DG诱导的TSC2迁移率变动。如图所示，在2-DG处理前30分钟添加AMPK抑制剂(化合物C，10μM)。图11d显示激酶失活的AMPK突变体阻断2-DG诱导的S6K脱磷酸化。HEK293细胞用渐增含量的激酶失活的AMPK突变体(AMPKDN)转染。图11e显示AMPK抑制剂阻断2-DG诱导的S6K脱磷酸化。图11f显示AMPK抑制剂部分地阻断由葡萄糖剥夺(glucose deprivation)诱导的S6K脱磷酸化。
图12显示AMPK在S1227和S1345上磷酸化TSC2。图12a显示2-DG和AMPK在体内在多位点诱导TSC2磷酸化。图12b显示S1337和S1341为2-DG处理所磷酸化的AMPK-依赖性位点。图12c显示AMPK在体外在S1345而非S1337或1341上直接磷酸化TSC2。图12d显示TSC2中的Ser1345在体内被磷酸化。图12e显示TSC2中的T1227在体内被磷酸化。图12f显示AMPK在体外在T1227上磷酸化TSC2。图12g显示野生型TSC2而非S1337A/S1341A/S1345A突变体应答2-DG而表现出迁移率变动。
图13显示AMPK磷酸化对于TSC2应答能量限制调节S6K磷酸化的功能很重要。图13a显示TSC2中AMPK-依赖性位点的突变降低TSC2活性。图13b显示突变体TSC2可与TSC1形成复合体。图13c显示表达AMPK磷酸化突变体TSC2(T1227A/S1345A)的细胞对2-DG处理的应答较弱。图13d显示TSC2-3A突变体抑制S6K的活性较小。用TSC2逆转录病毒感染LEF(TSC2-/-上皮)细胞，并选择稳定表达新霉素抗性的细胞。图13e显示TSC2的AMPK-依赖性磷酸化对于葡萄糖剥夺诱导的S6K脱磷酸化很重要。
图14显示TSC2在保护细胞免于葡萄糖剥夺所诱导的细胞凋亡和细胞大小的调节中起着重要作用。图14a显示TSC2而非TSC2-3A保护LEF细胞免于葡萄糖剥夺所诱导的细胞死亡。图14b显示葡萄糖剥夺在载体和TSC2-3A中而非表达TSC2的LEF细胞中诱导DNA片段化。图14c显示葡萄糖剥夺在载体和TSC2-3A中而非表达TSC2的LEF细胞中诱导caspase-3和PARP的切割。图14d显示2-DG降低HEK293细胞的细胞大小。HEK293细胞在12.5mM 2-DG、TSC2 RNAi或20nM雷帕霉素存在下培养72小时。图14e显示低葡萄糖(2.8mM)降低HEK293细胞的细胞大小。图14f显示TSC2-3A在细胞大小调节方面是缺陷型的。图14g显示了提出的TSC2在细胞能量信号传导途径中的模型。
图15a显示了AMPK识别基序。Bas和Hyd分别定义了碱性和疏水性残基。图15b显示了已知的AMPK底物的比对。以粗体显示了磷酸化残基，且将拟合识别基序的残基加下划线。图15c显示了TSC2中的推定的AMPK位点的序列比对。
图16a-16f显示了TSC2在保护细胞免受葡萄糖耗尽-诱导的细胞凋亡中起作用。图16a显示了TSC2和雷帕霉素、而不是TSC2-3A会保护LEF细胞免受葡萄糖耗尽-诱导的细胞死亡。在25mM葡萄糖(G+)或没有葡萄糖的培养基(G-)中、含有或不含20nM雷帕霉素情况下，培养能稳定地表达载体、TSC2或TSC2-3A的LEF细胞。在培养72小时时照像。注意到TSC2野生型表达细胞在形态上更小。图16b显示了雷帕霉素会抑制葡萄糖耗尽-诱导的LEF细胞中的caspase-3活化。在没有葡萄糖的培养基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情况下培养能稳定地表达载体、TSC2或TSC2-3A的LEF细胞48小时。显示了抗剪切的-caspase-3和肌动蛋白的蛋白印迹。图16c显示了葡萄糖耗尽对EEF8(TSC2-/-)和EEF4(TSC2+/+)细胞中细胞死亡的作用。在没有葡萄糖的培养基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情况下培养EEF细胞96小时。图16d显示了葡萄糖耗尽对EEF细胞中caspase-3活化的影响。在没有葡萄糖的培养基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情况下培养EEF4和EEF8细胞72小时。显示了用剪切的caspase-3和肌动蛋白进行的蛋白印迹。图16e显示了葡萄糖耗尽对MEF(TSC1+/+)和MEF(TSC1-/-)细胞中细胞死亡的影响。在没有葡萄糖的培养基中培养MEF 48小时。图16f显示了葡萄糖耗尽对MEF(TSC1+/+)和MEF(TSC1-/-)细胞中的caspase-3活化的影响。在没有葡萄糖的培养基中、含有或不含20nM雷帕霉素的情况下培养MEF 16小时。显示了用剪切的-caspase-3和肌动蛋白进行的蛋白印迹。
图17a-17c显示了TSC2在能量饥饿引起的细胞大小控制中起作用。图17a显示了2DG能减小HEK293细胞的细胞大小。在有12.5mM2DG、TSC2 RNAi，或20nM雷帕霉素存在下培养HEK293细胞72小时。收获细胞，进行FACS分析，以确定细胞大小。X-轴代表相对细胞大小。为了对比，将如灰色曲线所示的对照组细胞大小分布曲线包含在每个图中。图17b显示了低葡萄糖(2.8mM)能减小HEK293细胞的细胞大小。实验类似于在图A中的那些。图17c证实，TSC2的AMPK依赖型磷酸化对于TSC2在能量饥饿的细胞大小调节中的功能是重要的。如所示的，在含有25mM(上图)或1mM葡萄糖(下图)的培养基中，培养能稳定地表达TSC2、TSC2-3A和载体的TSC2-/-LEF细胞96小时。收获细胞，进行FACS分析。显示了G1群体的细胞大小分布。
定义为有助于对本发明的理解，许多术语和短语定义如下如本文所使用的，术语“S6K”和“S6激酶”可互换使用，指S6K激酶(如人或非人S6K激酶)。
如本文所使用的，术语“在所述生物学样品中检测增强的S6激酶活性”是指使用任何合适的方法，检测S6激酶的激酶活性相对于对照样品(如从已知具有正常水平的S6激酶活性的个体获得的对照样品)的激酶活性水平是否存在增强。在有些实施方案中，激酶活性利用下文实验部分描述的免疫测定予以测定。不过，可以使用能够提供相对于对照的激酶活性测量的任何测定。在有些实施方案中，增强的S6激酶活性可指示TSC1或TSC2蛋白的失活。
如本文所使用的，术语“所述受试者中结节性硬化症的阳性诊断”是指受试者中结节性硬化症的诊断。如本文所使用的，术语“所述受试者中结节性硬化症的阴性诊断”是指受试者不具有结节性硬化症的诊断。
如本文所使用的，术语“TSC途径”或“结节性硬化症复合体途径”一般是指涉及TSC-1基因、TSC-1蛋白、TSC-2基因和/或TSC-2蛋白的生物学(如分子、遗传、细胞、生物化学、药物、环境)事件(如细胞途径、细胞机制、细胞级联)。TSC途径组分的实例包括，但不限于TSC-1、TSC-2、TSC-1/TSC-2、Rheb、mTOR、S6K和4EBP-1。
如本文所使用的，术语“具有结节性硬化症的受试者”一般是指具有缺陷型TSC途径的受试者。缺陷型TSC途径可通过任何公认的鉴定方法识别(如在表型上、遗传上、生物化学上和分子上)。用于鉴定具有结节性硬化症的受试者的一种方法包括进行诊断测定，以检测缺陷型TSC途径(如文中所述的诊断测定试验)。
如本文所使用的，术语“诊断有结节性硬化症的受试者”是指已在医学上(如由治疗医师)确定具有结节性硬化症的受试者。
如本文所使用的，术语“缺陷型TSC途径”或“具有缺陷型TSC途径的样品”是指证实在TSC途径(如在表型上、遗传上、生物化学上和分子上)内表现出具有调节异常(如该途径的调节产生的生物学效应会导致针对细胞或组织的不利影响)的样品。鉴定缺陷型TSC途径的一种方法包括进行诊断测定，以鉴定缺陷型TSC途径(如文中所述的诊断测定试验)。
如本文所使用的，术语“降低细胞能量水平”或“细胞能量水平的下降”一般是指细胞葡萄糖水平、氨基酸水平或ATP水平的下降(如降低、削减、减小)。
如本文所使用的，术语“所述试剂降低细胞能量水平”或“降低细胞能量水平的方法”一般是以细胞能量为对象。实例包括但不限于ATP和葡萄糖。另外，该术语一般也是以辅助产生细胞能量的组分为对象。实例包括但不限于线粒体、用于产生ATP的酶(如己糖激酶)、能量产生途径(如三羧酸循环)以及调节ATP代谢的药物(如2-脱氧-葡萄糖)。
如本文所使用的，术语“肥大”一般是指器官或机体部分由于其组成细胞大小的增加所致的增大或过度生长。实例包括但不限于右心室肥大、肥厚型心肌病和良性前列腺肥大。
如本文所使用的，术语“S6激酶抑制剂”是指能抑制S6激酶的激酶活性的化合物。在优选的实施方案中，抑制剂将激酶活性抑制到对照样品中所见的激酶活性的水平。在特别优选的实施方案中，S6激酶抑制剂可减轻由增强的S6激酶活性所致疾病的症状(如结节性硬化症)。
如本文所使用的，术语“表位”是指与特定抗体进行接触的抗原部分。
当使用蛋白或蛋白片段免疫宿主动物时，该蛋白的众多区域可诱导产生与给定区域或者该蛋白上的三维结构特异性结合的抗体；这些区域或结构称之为“抗原决定簇”。抗原决定簇可与完整抗原(即用于引发免疫应答的“免疫原”)竞争与抗体的结合。
当术语“特异性结合”或“特异性地结合”用于指抗体与蛋白或肽之间的相互作用时，意味着所述相互作用依赖于蛋白上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在；换言之，抗体识别并结合特定的蛋白结构而不是通常意义上的蛋白。举例来说，如果一抗体是表位“A”特异性的，则在含标记的“A”和所述抗体的反应中存在含表位A的蛋白(或者游离的未标记的A)将降低与抗体结合的被标记A的含量。
如本文所使用的，当术语“非特异性结合”及“背景结合”用于指抗体与蛋白或肽之间的相互作用时，是指不依赖于特定结构的存在的相互作用(即抗体与通常的蛋白而不是特定结构如表位结合)。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物(如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等，所述受试者将是特定治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”在文中互换使用，用于指人类受试者。
如本文所使用的，术语“磷酸化特异性的抗体”是指能与磷酸化形式的多肽(如S6K)特异性结合而不与非磷酸化形式的多肽特异性结合的抗体。在有些实施方案中，磷酸化特异性的抗体与在特定位置磷酸化的多肽特异性结合。
如本文所使用的，术语“有关使用所述试剂盒在所述受试者中检测结节性硬化症的说明书”包括有关使用试剂盒中所含试剂在来自受试者的生物学样品中检测和/或表征结节性硬化症的说明书。在有些实施方案中，所述说明书还包括美国食品药品监督管理局(FDA)所要求的有关标注分析物特殊试剂(ASR)或体外诊断产品的目的用途的声明。FDA将体外诊断归类为医疗器械，并要求其通过510(k)手续批准。510(k)申请所需信息包括1)体外诊断产品的名称，包括商品或专有名、通用或常用名，以及装置的分类名；2)产品的目的用途；3)如果适用的话，递交510(k)呈递书的所有人或操作者的机构登记号；如果已知的话，所述体外诊断产品依FD&C法513章所处的分类、其合适的组别，或者如果所有人或操作者判定所述装置未依此章分类，(应提交)这种判定以及判定所述体外诊断产品未如此分类的根据的声明；4)建议的足以描述所述体外诊断产品的商记、标签及广告，其目的用途、以及使用说明书。适用的情况下，应提供照片或工程图；5)表明所述装置类似于和/或有别于美国商业流通中可比类型的其它体外诊断产品的声明，并附具支持该声明的数据；6)作为实质等同判定基础的安全性和有效性数据的510(k)总结；或者支持FDA发现实质等同的510(k)安全性和有效性信息将在书面请求书的30天之内公诸于众的声明；7)递交人确信据其所知在上市前通告中所递交的所有数据和信息真实准确且未遗漏重要事实的声明；8)FDA作出实质等同判定所必需的有关所请求体外诊断产品的任何附加信息。附加信息可由美国FDA的互联网页获得。
如本文所使用的，术语“计算机存储器”及“计算机存储装置”是指计算机处理器可读的任何存储介质。计算机存储器的实例包括但不限于RAM、ROM、计算机芯片、数字化视频光盘(DVD)、压缩盘(CD)、硬盘驱动器(HDD)以及磁带。
如本文所使用的，术语“基于所述检测增强的S6激酶活性，为所述受试者提供诊断”是指基于所述受试者中增强S6激酶活性的存在提供医学诊断(如结节性硬化症)。
如本文所使用的，术语“计算机可读介质”是指为计算机处理器提供存储和提供信息(如数据和指令)的任何装置或系统。计算机可读介质的实例包括但不限于DVD、CD、硬盘驱动器、磁带以及在网络上用于运行介质的服务器。
如本文所使用的，术语“处理器”和“中央处理器单元”或“CPU”互换使用，是指能够从计算机存储器(如ROM或其它计算机存储器)读取程序，并根据所述程序执行系列步骤的装置。
如本文所使用的，术语“非人动物”是指所有非人动物，包括但不限于脊椎动物如啮齿动物、非人灵长类动物、绵羊、牛、反刍动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等。
如本文所使用的，术语“核酸分子”是指含核酸的任何分子，包括但不限于DNA或RNA。该术语涵盖包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列，所述碱基类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮杂环丙烯基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、beta-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。
术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(如rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(如DNA)序列。多肽可由全长编码序列或者由编码序列的任何部分编码，只要保留了全长或片段的期望活性或功能特性(如酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)即可。该术语也涵盖结构基因的编码区以及在任一端位于靠近编码区5′和3′端1kb或更长距离的序列，从而该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5′端且存在于mRNA之上的序列称之为5′非翻译序列。位于编码区3′端或下游且存在于mRNA之上的序列称之为3′非翻译序列。术语“基因”涵盖了cDNA和基因组形式的基因。基因的基因组形式或克隆含有被称之为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列所打断的编码区。内含子为转录成核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可含调控元件如增强子。内含子被从核或初级转录物上去除或“剪接掉”；因此内含子在信使RNA(mRNA)转录物中是不存在的。mRNA在翻译期间行使功能，确定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
如本文所使用的，术语“异源基因”是指不在其天然环境中的基因。举例来说，异源基因包括来自一个物种、并被引入到另一个物种中的基因。异源基因也包括在某些方面已被改变了的生物体天然基因(如突变、以多拷贝加入、连接非天然调控序列等)。异源基因有别于内源基因，在于异源基因序列典型地与并非天然发现在染色体中与该基因序列有关的DNA序列相连接，或者结合有天然未见过的染色体部分(如在所述基因正常不表达的基因座中表达的基因)。
如本文所使用的，术语“基因表达”是指通过基因“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促反应)将基因中编码的遗传信息转换为RNA(如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，以及对蛋白编码基因而言，通过mRNA“翻译”转换为蛋白的过程。此过程中基因表达可在许多阶段被调控。“上调”或“激活”是指提高基因表达产物(如RNA或蛋白)产量的调控，而“下调”或“阻遏”是指降低产量的调控。参与上调或下调的分子(如转录因子)通常分别称之为“激活物”和“阻遏物”。
除了含有内含子，基因组形式的基因也可以包括位于存在于RNA转录物上的序列的5′和3′端的序列。这些序列称之为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5′或3′端)。5′侧翼区可含有调控序列，如调节或影响基因转录的启动子和增强子。3′侧翼区可含有指导转录终止、翻译后切割以及多聚腺苷酰化的序列。
术语“野生型”是指从天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在种群中最频繁观察到的基因，因而武断地指定为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”或“突变体”是指当与野生型基因或基因产物相比时，在序列上和或功能特性上表现出修饰(即改变的特征)的基因或基因产物。应当指出，天然存在的突变体可以是分离的；这些是通过当与野生型基因或基因产物相比时，它们具有改变的特征(如改变的核酸序列)这一事实鉴定的。
如本文所使用的，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指脱氧核糖核酸链上的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了多肽(蛋白)链上的氨基酸的顺序。因而DNA序列编码氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸”和“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”是指包含基因编码区，或者换言之，编码基因产物的核酸序列的核酸序列。所述编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA的形式存在时，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链(即有义链)或双链的。如果需要，可以将合适的控制元件如增强子/启动子、剪接结合处、多聚腺苷酰化信号等置于与基因编码区极为接近之处，以允许转录的准确起始和/或初级RNA转录物的正确加工。
备选地，本发明的表达载体中所用的编码区可含有内源性增强子/启动子、剪接结合处、间插序列、多聚腺苷酰化信号等，或者内源和外源控制元件的组合。
如本文所使用的，术语“互补的”或“互补”用来指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。举例来说，序列“A-G-T”和序列“T-C-A”互补。互补可以是“部分的”，其中仅仅某些核酸碱基依据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补。核酸链之间的互补程度对于核酸链间杂交的效率和强度具有重大影响。这在扩增反应、以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中尤为重要。
术语“同源”是指互补程度。可存在部分同源或完全同源(即相同)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源的”靶核酸杂交的核酸分子。完全互补的序列与靶序列的杂交的抑制可使用杂交测定(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)，在低严谨性条件下进行检查。在低严谨性条件下，基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的核酸分子与靶标的结合(即杂交)。这并不是说低严谨性条件是允许非特异性结合的条件；低严谨性条件要求两序列彼此之间的结合是特异性(即选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用基本上不互补(如小于约30％的同一性)的第二靶标进行测试；在非特异性结合不存在时，探针将不会与第二不互补靶标杂交。
当用于指双链核酸序列如cDNA或基因组克隆时，术语“基本上同源”是指在如上文所述的低严谨性条件下能与所述双链核酸序列的一条或两条链杂交的任何探针。
基因可产生多种RNA，它们是通过初级RNA转录物的差异性剪接产生的。作为同一基因剪接变体的cDNA将含有序列相同或完全同源的区域(代表两cDNA上存在同一外显子或同一外显子的一部分)，以及完全不同的区域(例如，代表cDNA 1上存在外显子“A”，而cDNA 2含有外显子“B”)。由于两cDNA含有序列相同的区域，它们都将与衍生自完整基因或含有见于两cDNA上的序列的基因部分的探针杂交；这两个剪接变体因此与此探针并且彼此之间基本上同源。
当用于指单链核酸序列时，术语“基本上同源”是指在如上文所述的低严谨性条件下能与所述单链核酸序列杂交(即是其互补物)的任何探针。
如本文所使用的，术语“杂交”用来指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间的结合强度)受到诸如核酸之间互补程度、涉及的条件的严谨性、形成的杂交链的Tm、以及核酸内G∶C比等因素的影响。在其结构内包含互补核酸配对的单个分子被表述为“自杂交的”。
如本文所使用的，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群半数解离为单链的温度。用于计算核酸Tm的公式是本领域众所周知的。正如标准文献中所指出的那样，如果核酸处于1MNaCl的水溶液中的话，简单估计的Tm值可通过公式Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算(参见Anderson和Young，Quantitative FilterHybridization，in Nucleic Acid Hybridization )。其它方法包括更为复杂的将结构还有序列特征考虑到Tm的计算中的算法。
如本文所使用的，术语“严谨性”用来进行核酸杂交的有关温度、离子强度、以及存在化合物如有机溶剂的存在情况的条件。在“低严谨性条件”下，目的核酸序列将与其精确互补物、具有单碱基错配的序列、密切相关的序列(如具有90％或更高同源性的序列)、以及仅有部分同源性的序列(如具有50-90％同源性的序列)杂交。在“中严谨性条件”下，目的核酸序列将仅与其精确互补物、具有单碱基错配的序列、以及密切相关的序列(如90％或更高同源性)杂交。在“高严谨性条件”下，目的核酸序列将仅与其精确互补物以及(取决于条件如温度)具有单碱基错配的序列杂交。换言之，在高严谨性条件下，可提高温度从而排除与具有单碱基错配序列的杂交。
当“高严谨性条件”用于指核酸杂交时，包括等同于如下的条件在由5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH由NaOH调整至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中于42℃结合或杂交，接着在包括0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液中于42℃洗涤(如果使用的是长度约500个核苷酸的探针)。
当“中严谨性条件”用于指核酸杂交时，包括等同于如下的条件在由5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH由NaOH调整至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中于42℃结合或杂交，接着在包括1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液中于42℃洗涤(如果使用的是长度约500个核苷酸的探针)。
“低严谨性条件”包括等同于如下的条件在由5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH由NaOH调整至7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt′s试剂[50×Denhardt′s每500ml含5g Ficoll(型号400，Pharamcia)、5g BSA(级分V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中于42℃结合或杂交，接着在包括5×SSPE、0.1％SDS的溶液中于42℃洗涤(如果使用的是长度约500个核苷酸的探针)。
本领域熟知可采用众多的等同条件构成低严谨性条件；可考虑诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液之中或者固定的等)以及盐和其它组分的浓度(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)等因素，并且可改变杂交溶液以产生不同于但又等同于上文所列条件的低度严谨杂交条件。另外，本领域公知促进在高严谨性条件下杂交的条件(如提高杂交和/或洗涤步骤的温度、在杂交溶液中使用甲酰胺等)(见上文“严谨性”定义)。
如本文所使用的，当术语“部分”用于指核苷酸序列(如同在“给定核苷酸序列的一部分”中那样)时，是指该序列的片段。所述片段大小可从四个核苷酸到全部核苷酸序列减去一个核苷酸(10个核苷酸、20、30、40、50、100、200等)的范围内变化。
当术语“分离的”用于核酸时，如同在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中那样，是指经鉴定并与在其天然来源中其通常所结合的至少一种组分或污染物分离出来的核酸序列。分离的核酸是以有别于其天然所见的形式或背景下存在的核酸。相反，未分离的核酸是以它们天然存在的状态所见到的核酸如DNA和RNA。举例来说，给定的DNA序列(如基因)见于宿主细胞染色体上靠近相邻基因之处；RNA序列例如编码特定蛋白的特定mRNA序列作为与编码众多蛋白的众多其它mRNA的混合物见于细胞之中。然而，编码给定蛋白的分离的核酸包括例如通常表达所述给定蛋白的细胞之中所述核酸处于不同于天然细胞内的染色体位置、或者以其它方式侧接了与天然所见的不同的核酸序列的此种核酸。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链的形式存在。当分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸待用于表达蛋白时，所述寡核苷酸或多核苷酸将至少包含有义或编码链(即所述寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但也可以包含有义和反义链两者(即所述寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。
如本文所使用的，术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中除去组分(如污染物)。例如，抗体可通过除去污染的非免疫球蛋白类蛋白而纯化；它们也可通过除去不与靶分子结合的免疫球蛋白而纯化。非免疫球蛋白类蛋白的去除和/或不与靶分子结合的免疫球蛋白的去除导致样品中靶-反应性免疫球蛋白的百分比增大。在另一个实例中，重组多肽在细菌宿主细胞中表达，并且通过除去宿主细胞蛋白而纯化所述多肽；由此提高样品中重组多肽的百分比。
“氨基酸序列”以及术语如“多肽”或“蛋白”并不意味着将氨基酸序列限定于与所述蛋白分子有关的完整的天然氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“天然蛋白”表示蛋白不含由载体序列编码的氨基酸残基；也就是说，天然蛋白仅含天然存在的蛋白中所见的那些氨基酸。天然蛋白可通过重组手段生产，或者可从天然来源中分离。
如本文所使用的，当术语“部分”涉及蛋白(如同在“给定蛋白的一部分”中那样)时，是指该蛋白的片段。所述片段大小可从四个氨基酸残基到全部氨基酸序列减去一个氨基酸的范围内变化。
术语“DNA印迹”是指在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上分析DNA，以根据大小分级分离DNA，接着将DNA从凝胶中转移到固相支持物例如硝酸纤维素或尼龙膜上。然后用标记探针探测固定的DNA，以检测与所用探针互补的DNA物质。所述DNA可在电泳前由限制性酶切割。电泳后，所述DNA可在向固相支持物转移之前或期间部分脱嘌呤和变性。DNA印迹是分子生物学家的标准工具(J.Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY，pp9.31-9.58 )。
如文中所用的，术语“RNA印迹”是指通过琼脂糖凝胶上的RNA电泳以根据大小分级分离RNA，接着将RNA从凝胶中转移到固相支持物例如硝酸纤维素或尼龙膜上的RNA分析。然后用标记探针探测固定的RNA，以检测与所用探针互补的RNA物质。RNA印迹是分子生物学家的标准工具(J.Sambrook等，前文，pp 7.39-7.52 )。
术语“蛋白印迹”是指对固定于支持物如硝酸纤维素或膜上的蛋白(或多肽)的分析。将蛋白在丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所述蛋白，接着将蛋白从凝胶中转移到固相支持物例如硝酸纤维素或尼龙膜上。然后将固定的蛋白暴露于具有针对目的抗原的反应性的抗体。抗体的结合可通过多种方法检测，包括使用放射标记的抗体。
如本文所使用的，术语“细胞培养物“是指细胞的任何体外培养物。该术语包含连续传代细胞系(如具有永生表型)、原代细胞培养物、转化的细胞系、有限细胞系(如未转化的细胞)、以及体外维持的任何其它细胞群。
如本文所使用的，术语“真核细胞”是指有别于“原核细胞”的生物体。该术语旨在涵盖具有表现出真核细胞的常见特征的所有生物体，所述特征包括例如存在由核膜包绕的真正的细胞核(其内存有染色体)、存在膜包绕的细胞器、以及在真核生物体中通常观察到的其它特征。因而，该术语包括但不限于诸如真菌、原生动物及动物(如人)的生物体。
如本文所使用的，术语“在体外”是指人工环境以及在人工环境中发生的过程或反应。体外环境可包括但不限于试管和细胞培养物。术语“在体内”是指天然环境(如动物或细胞)以及在天然环境内发生的过程或反应。
术语“测试化合物”以及“候选化合物”是指用于治疗或预防疾病、病患、不适、或身体机能紊乱(如结节性硬化症)的候选物的任何化学实体、试剂、药物等。测试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物两者。测试化合物可通过使用本发明的筛选方法筛选而判定为治疗剂。在本发明的有些实施方案中，测试化合物包括反义化合物。
如本文所使用的，术语“样品”以其最广泛的意义使用。在一种意义上，它意味着包括由任何来源获得的样本或培养物，以及生物学和环境样品。生物学样品可从动物(包括人)获得，并且涵盖体液(如血液或尿液)、固体、组织和气体。生物学样品包括血液制品，例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。不过此类实例不应解释为限制适用于本发明的样品类型。
发明详述本发明涉及用于鉴定TSC信号传导途径中的异常的组合物和方法。特别地，本发明涉及诊断和治疗诸如结节性硬化症之类的病症的方法，所述病症是由TSC基因中的突变引起的。例如，在有些实施方案中，本发明提供了通过诊断由TSC1或TSC2基因中的突变引起的S6K激酶活性的增强而诊断结节性硬化症的方法。在其它实施方案中，本发明提供了通过施用抑制S6K激酶活性的化合物(如雷帕霉素)治疗结节性硬化症的方法。本发明还涉及用于治疗由TSC信号传导紊乱介导的癌症的方法和组合物。
I.TSC1和TSC2TSC1(也称之为错构瘤蛋白(hamartin))编码具有130,000(130K)相对分子量(Mr)的蛋白，它含有卷曲螺旋结构域，但没有明显的催化结构域。TSC2(也称之为抗结核菌素(tuberin))编码200K的蛋白，它含有卷曲螺旋结构域和羧基末端区域，与Rap GTPase-激活蛋白(GAP)3享有同源性。TSC2对Rap和Rab5具有弱的GAP活性。在小鼠中，TSC1或TSC2的纯合性失活都是胚胎致死性的，而杂合型动物倾向于长瘤(Onda等，J.Clin.Invest.104，687-695(1999)；Au等，Am.J.Hum.Genet.62，286-294(1998)；Kobayashi，T.等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，8762-8767(2001)；每一篇都特此并入作为参考)。在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中，dTsc1或dTsc2的失活都增加细胞大小和增殖，而dTsc1和dTsc2一起而非个别地过表达则降低细胞大小，表明Tsc1和Tsc2形成调节细胞生长的功能性复合体(Gao和Pan，Genes Dev.15，1383-1392(2001)；Ito等，Cell96，529-539(1999)；Potter等，Cell 105，357-368(2001)；Tapon等，Cell 105，345-355(2001)；每一篇都特此并入作为参考)。此外，遗传分析显示dTsc1和dTsc2在细胞生长的调节中在胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)受体下游发挥作用(Gao和Pan，前文；Potter等，前文；Tapon等，前文)。已充分确认了胰岛素途径的组分在细胞生长中很重要(Kozma等，Bioessays 24，65-71(2002)；Stocker和Hafen，Curr.Opin.Genet.Dev.10，529-535(2000)；每一篇都特此并入作为参考)。该途径的成员包括正调节子胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物(IRS)、磷脂酰肌醇-3-OH激酶、(PI(3)K)、PDK-1、Akt、TOR、S6K和eIF4E(真核细胞起始因子4E)。这些正调节子的过表达将增加细胞大小和/或数目，而正调节子的减效或无义突变在果蝇中则降低细胞数目和大小(Weinkove和Leevers，Curr.Opin.Genet.Dev.10，75-80(2000)；特此并入作为参考)。在小鼠中，心脏中组成型活性的PI(3)K或Akt的过表达导致肥大(Shioi，T.等，EMBO J.19，2537-2548(2000)；Shioi，T.等，Mol.Cell.Biol.22，2799-2809(2002)；每一篇都特此并入作为参考)。缺失编码IGF或者其受体(DeChiara等，Nature 345，78-80(1990)；Liu等，Cell 75，59-72(1993))IRSs20或S6K IRSS20或S6K的基因导致小鼠矮小(Shima等，EMBO J.17，6649-6659(1998)；特此并入作为参考)，说明这些基因在细胞生长调控中的功能重要性。尽管TSC1和TSC2肿瘤抑制蛋白已证明参与调控增殖和细胞大小，TSC1-TSC2复合体在胰岛素信号传导途径中的精确功能尚未被阐明，其作为肿瘤抑制物发挥作用的分子机制也未被阐明。
在人类肿瘤中有众多的遗传和外在变化会造成PI(3)K信号传导的增强(Vogt，Trends Mol.Med.7，482-484(2001))。在人类中，胰岛素/IGF信号传导途径中细胞生长的负调节子PTEN的突变，导致Akt、mTOR、S6K和eIF-4E的过度激活，并引起几类肿瘤，包括错构瘤(Young和Povey，前文；Neshat等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，10314-10319(2001)；每一篇都特此并入作为参考)。在胰岛素信号传导的正组分中，mTOR对于通过S6K和4E-BP1的翻译调控进行细胞生长和增殖的调节是至关重要的(Schmelzle和Hall，Cell 103，253-262(2000)；特此并入作为参考)。S6K和4E-BP1的磷酸化介导了有丝分裂原和营养物信号的转导以刺激翻译。编码众多核糖体蛋白和翻译因子的mRNA含5′末端寡聚嘧啶串(TOP)。所述TOP序列应答有丝分裂原刺激而赋予选择性翻译诱导。top mRNA的翻译与S6K对40S核糖体S6蛋白的磷酸化作用相关(Shah等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.279，E715-E729(2000)；特此并入作为参考)。磷酸化不足的4E-BP1结合并抑制含CAP mRNA的e1F4E-依赖性翻译(Shah等，前文)。这些e1F4E-调控的信息通常编码参与增殖的蛋白，例如c-Myc和细胞周期蛋白D1(Sonenberg和Gingras，Curr.Opin.Cell Biol.10，268-275(1998)；特此并入作为参考)。S6K磷酸化的激活以及4E-BP1磷酸化的失活与PI(3)K-诱导的肿瘤形成相关(Neshat等，PNAS 98，10314(2001)；特此并入作为参考)。mTOR在肿瘤形成中的重要性得到了雷帕霉素抑制肿瘤生长的事实的支持(Podsypanina等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，10320-10325(2001)；特此并入作为参考)。
在本发明形成过程期间进行的实验(见实验部分)证明了TSC1-TSC2抑制S6K和4E-BP1的磷酸化。数据显示TSC1-TSC2通过mTOR发挥其调控S6K和4E-BP1活性的功效。进一步的实验证明TSC1-TSC2的功能应答胰岛素处理而受Akt-依赖性磷酸化的负调控，并且TSC2抑制S6K的活性与其肿瘤抑制功能相关。
哺乳动物细胞中的已有研究已证实，Akt能促进S6K的活化(Aoki等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 98，136-141(2001)；Burgering等，Nature 376，599-602(1995)；每一篇都特此并入作为参考)。胰岛素对Akt的活化或者组成型活性的Akt突变体的表达导致S6K磷酸化和激酶活性的增强。Akt对S6K的活化为一间接过程，并且可由mTOR介导(Scott等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 95，7772-7777(1998)；Sekulic，A.等，Cancer Res.60，3504-3513(2000)；每一篇都特此并入作为参考)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为在本发明形成过程期间进行的实验提供了Akt调控S6K的可能机制。在该模型中，TSC1-TSC2在Akt下游和mTOR上游发挥功能以控制哺乳动物细胞中S6K和4E-BP1的活性(图7f)。还认为TSC1-TSC2的生理功能之一在于抑制S6K和4E-BP1的磷酸化，而它们是翻译和细胞生长的关键调节子(Dufner和Thomas，Exp.Cell Res.253，100-109(1999)；特此并入作为参考)。TSC1-TSC2的这种活性对于其生理功能很重要，因为它受到疾病相关TSC2突变的损害(图2c)。与此一致，已在TSC1无效细胞中观察到S6K磷酸化作用的增强(Kwiatkowski等，Hum.Mol.Genet.11，525-534；特此并入作为参考)。目前尚无有关TSC1-TSC2的功能测定，不过，在有些实施方案中，本发明提供了有关S6K和4E-BP1磷酸化作用的抑制和增强的测定，这提供了简单且相关的TSC1-TSC2功能测定。
果蝇中的遗传研究调查了TSC1-TSC2在细胞生长调控中的功能。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为TSC1-TSC2参与了细胞大小和细胞生长的调节，并且TSC1-TSC2信号传导途径为抑制细胞生长提供了靶标(如在癌症中)。
在本发明形成过程期间进行的研究显示Akt能刺激mTOR，从而通过解除TSC1-TSC2的抑制而刺激S6K活性(图7f)。果蝇中dS6K的激活需要dPDK1而不是dPI(3)K和dAkt46。然而，转基因小鼠模型表明了Akt在S6K活化和细胞大小调节中的正面作用(Tuttle等，NatureMed.7，1133-1137(2001)；特此并入作为参考)。在本发明形成过程期间进行的实验表明Akt促进S6K的活化。Akt对TSC2的磷酸化通过至少两种机制影响其功能第一，磷酸化降低TSC2的活性；第二，磷酸化使得TSC2蛋白不稳定。这种去稳定化是通过破坏TSC1和TSC2之间复合体的形成并诱导游离TSC2的泛素化实现的。TSC1-TSC2介导的mTOR抑制的解阻遏是胰岛素途径中S6K激活的一种可能机制。在本发明形成过程期间进行的实验显示了TSC1-TSC2是如何作为肿瘤遏制剂发挥功能而抑制细胞生长以及如何界定其在胰岛素信号传导中的角色的分子基础。TSC1-TSC2的主要生理功能是抑制mTOR、S6K和4E-BP1活性。
Akt和mTOR在胰岛素信号传导中的作用很复杂。mTOR中的Ser2448已证明是Akt40的直接磷酸化靶标。Ser 2448的磷酸化受胰岛素刺激(Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，7772-7777(1998)；特此并入作为参考)并与mTOR活性相关，但用丙氨酸取代Ser2448并不影响mTOR激活S6K42的能力，表明Akt在mTOR活化中的作用更为复杂。不过，这种突变是在雷帕霉素抗性mTOR突变体(含S2035I突变)中构建的，该突变体对4E-BP1具有低活性(Reynolds等，J.Biol.Chem.277，17657-17662(2002)；特此并入作为参考)。因此，此结果不足以排除Ser2448磷酸化在mTOR功能中的重要性。实际上，最近的研究还证实了Ser2448磷酸化在mTOR活化中的正面作用(Reynolds等，前文)。mTOR中Ser2448的磷酸化由于氨基酸补充而增强，支持了Ser2448磷酸化在mTOR活化中的作用(Reynolds等，前文；Nave等，Biochem J.344，427-431(1999)；特此并入作为参考)。在本发明形成过程期间进行的实验发现mTOR中Ser2448的磷酸化因营养物剥夺而减弱，且因营养物刺激而增强。雷帕霉素对S6K的抑制是通过蛋白磷酸酶PP2A49介导的。雷帕霉素处理或氨基酸饥饿会激活针对S6K的PP2A-样活性，并已检测到PP2A和S6K之间的弱结合(Peterson等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 96，4438-4442(1999)；特此并入作为参考)。已经确认了mTOR在S6K活化中的正面功能。在本发明形成过程期间进行的实验显示TSC1-TSC2抑制mTOR的激酶活性和磷酸化。
本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为雷帕霉素衍生物及S6K的其它抑制剂可作为TSC及其它细胞生长紊乱(如癌症)的治疗试剂进行应用。
以前的研究指出，mTOR对S6K和4EBP1的磷酸化在翻译调控中扮演着重要角色(Brown等，Nature 377441-446(1995)；Hara等，J.Biol.Chem.27314484-94(1998)；Shah等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.，279E715-729(2000))。TSC1或TSC2突变体细胞表现出S6K和4EBP1两者提高的磷酸化作用(Goncharova等，J.Biol.Chem.27730958-30967(2002)；Kenerson等，Cancer Res.625645-5650(2002)；Kwiatkowski等，Hum.Mol.Gen.11525-534(2002)；Onda等，Mol.Cell Neurosci.21561-574(2002)。相反，TSC1和TSC2过表达抑制S6K和4EBP1的磷酸化(Goncharova等，2002；Inoki等，Nat.Cell Bio.4648-657(2002)；Tee等，Proc.Natl.Acad.Sci.9913571-13576(2002)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为TSC1/TSC2的主要细胞功能之一在于通过抑制S6K和4EBP1的磷酸化而抑制翻译。
翻译速率受多个信号传导途径的调控，包括营养物的可获得性、生长因子、胞内ATP水平以及环境压力(Browne和Proud，Eur.J.Biochem.2695360-5368(2002)；Proud，Eur.J.Biochem.2695338-5349(2002)。ATP耗尽可降低S6K和4EBP1的磷酸化并抑制翻译。以前的研究提示mTOR可能介导ATP耗尽信号，因为mTOR对ATP具有毫摩尔级的Km，这与生理ATP水平相当(Dennis等，Genes Dev.161472-1487(2001)。然而，正常细胞ATP水平在生理学能量饥饿的条件下并不显著改变。相反，由于细胞ATP浓度比AMP浓度要高得多，ATP水平相对小的下降将导致AMP水平相对显著的升高，这由5′AMP活化的蛋白激酶(AMPK)感知并刺激所述酶(Hardie等，Ann.Rev.Biochem.67821-855(1998)。D-葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖(2-DG)以及5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)激活AMPK(Corton等，Eur.J.Biochem.229558-565(1995)。2-DG和AICAR已证明可增强真核延伸因子2(eEF2)的磷酸化作用，表明AMPK在翻译中起着负面作用(Horman等，Curr.Bio.121419-1423(2002)。也已报道2-DG和AICAR两者都抑制S6K活性(Kimura等，Genes Cells 865-79(2003)；Krause等，Eur.J.Biochem.2693751-3759(2002)。AMPK的S6K抑制机制似乎是通过mTOR途径进行的(Kimura等，2003)。
在本发明形成过程期间进行的研究显示TSC2受细胞能量水平的调控。能量饥饿对AMPK的激活导致TSC2在T1227和S1345处的直接磷酸化(图12)。RNA干预对TSC2蛋白的破坏消除了ATP耗尽诱导的S6K脱磷酸化(图10)。而且，TSC2-/-细胞应答能量饥饿而表现出S6K脱磷酸化的缺陷型应答(图10)。此外，能量耗尽诱导的S6K脱磷酸化通过表达野生型TSC2而恢复，但在TSC2-/-细胞中的AMPK磷酸化突变体并不如此，证明了AMPK对TSC2的磷酸化在通过细胞能量饥饿进行的翻译调控中有重大功能(图13)。
本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为TSC2在保护细胞免于葡萄糖剥夺所诱导的细胞凋亡中扮演着至关重要的角色。TSC2的AMPK-依赖性磷酸化对于细胞能量应答中TSC2的功能很重要，因为TSC2-/-细胞中野生型TSC2的表达而非AMPK磷酸化突变体的表达防止了葡萄糖剥夺所诱导的凋亡(图13)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为TSC2和AMPK磷酸化在细胞能量应答中具有至关重要的作用。
II.诊断应用在有些实施方案中，本发明提供了诊断TSC的方法。TSC的早期诊断允许及早干预。例如，可识别肿瘤并在它们造成伤害之前除去，并且可在较早的时间点开始药物治疗(如用本发明的药物)。
在有些实施方案中，本发明提供了直接诊断TSC1或TSC2中的突变的方法。在其它实施方案中，本发明提供了间接诊断TSC1或TSC2中的突变的方法(如通过增强的S6K活性的诊断)。下文的说明提供了示例性的诊断筛选方法。本领域熟练技术人员公认可以使用替代性的诊断方法。
A.直接检测在有些实施方案中，本发明提供了直接检测TSC1或TSC2中的突变的方法。TSC1和TSC2中的突变一般是随机的。多数突变导致移码或者过早发生的终止密码子。因而，在有些实施方案中，突变体TSC1或TSC2基因是截短的。
1.直接检测在有些实施方案中，突变是通过TSC1或TSC2基因的DNA测序检测的。在有些实施方案中，利用本领域众所周知的自动化测序法。使用DNA测序检测改变的TSC1或TSC2核酸序列(如含移码或过早发生的终止密码子)，从而诊断TSC。
2.截短的TSC1或TSC2蛋白的检测在其它实施方案中，检测的是截短的TSC1或TSC2蛋白。可使用任何合适的方法检测截短的TSC1或TSC2蛋白。例如，在有些实施方案中，利用来自Ambergen有限公司(Boston，MA)的无细胞翻译法。Ambergen有限公司已开发了用于标记、检测、定量、分析以及分离由无细胞或细胞翻译系统产生的新生蛋白而无需使用放射性氨基酸或其它放射性标记的方法。标记被氨酰化至tRNA分子上。潜在的标记包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物或衍生物或者化学部分。这些标记在翻译过程期间从所得的误氨酰化tRNA中被引入到新生蛋白之中。
Ambergen的蛋白标记技术的一项应用是无凝胶截短试验(GFTT)测定(参见美国专利6,303,337，特此并入作为参考)。在有些实施方案中，利用这种测定筛选TSC1或TSC2蛋白中的截短突变。在GFTT测定中，标记(如荧光团)在翻译期间被引入到新生蛋白靠近蛋白的N-末端处。第二且不同的标记(如具有不同发射波长的荧光团)被引入到新生蛋白靠近蛋白的C-末端处。然后从翻译系统中分离蛋白并测量来自标记的信号。来自N和C末端信号的测量值的比较提供了有关具有C-末端截短的分子的分数的信息(即如果来自C-末端标记的标准化信号为来自N-末端标记信号的50％，则50％的分子具有C-末端截短)。
又在另一个实施方案中，截短的蛋白通过抗体结合检测。例如，在有些实施方案中，利用两种抗体。设计一种抗体(参见下文抗体产生的说明)识别TSC1或TSC2的C-末端，而设计第二抗体识别TSC1或TSC2的N-末端。被N-末端而非C-末端抗体识别的蛋白是截短的。在有些实施方案中，使用定量免疫测定确定C-末端与N-末端抗体结合的比率。
抗体结合通过本领域公知的技术检测(如放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(如使用胶体金、酶或者例如放射性同位素标记)、蛋白印迹、沉淀反应、凝集试验(如凝胶凝集试验、血细胞凝集试验等)、补体结合试验、免疫荧光测定、蛋白A试验以及免疫电泳测定等。
在一个实施方案中，抗体结合通过检测一抗上的标记进行检测。在另一个实施方案中，一抗通过检测二抗或试剂与一抗的结合进行检测。在另一实施方案中，二抗是标记的。许多方法在本领域公知可用于在免疫测定中检测结合，并且落在本发明的范围之内。
在有些实施方案中，利用自动化检测分析。免疫测定自动化的方法包括美国专利5,885,530、4,981,785、6,159,750和5,358,691中所述的那些，每一篇都特此并入作为参考。在有些实施方案中，结果的分析和说明也被自动化。例如，在有些实施方案中，使用基于免疫测定结果产生预后的软件。
在其它实施方案中，免疫测定描述在美国专利5,599,677和5,672,480之中，每一篇都特此并入作为参考。
B.间接检测在其它实施方案中，TSC1或TSC2中的突变是间接检测的。在本发明形成过程期间进行的实验证明，TSC1和TSC2能抑制S6K激酶活性(见实验部分)。TSC1或TSC2中的突变会导致S6K激酶活性的增强。在有些实施方案中，S6K激酶活性的增强使用磷-S6K特异性抗体进行分析(见图1和2以及下文的实验部分)。本发明并不局限于检测S6K激酶活性的特定方法。可利用任何合适的方法，包括本领域公知的那些。
III.抗体本发明提供了分离的抗体或抗体片段(如FAB片段)。在优选的实施方案中，本发明提供了与包含本文公开的蛋白(如TSC1、TSC2、S6K、mTOR及Akt)的至少五个氨基酸残基的分离多肽特异性结合的单克隆抗体或片段。这些抗体可应用于本文中所述的诊断和药物筛选方法中。
针对本发明蛋白的抗体可以是任何单克隆、多克隆或重组(如嵌合、人源化等)抗体，只要它能够识别所述蛋白即可。通过使用本发明的蛋白作为抗原，根据常规的抗体或抗血清制备过程，可生产抗体。
本发明涵盖单克隆、重组及多克隆抗体或其片段的应用。可使用任何合适的方法产生在本发明的方法和组合物之中使用的抗体，包括但不限于文中所公开的那些。例如，为制备单克隆抗体，在允许产生抗体的条件下向动物(如哺乳动物)给予蛋白本身或者连同合适的载体或稀释剂一起给予蛋白。为增强抗体生产能力，可给予完全或不完全弗氏佐剂。通常地，蛋白每2周到6周给予一次，总计约2次到约10次。适用于此类方法的动物包括但不限于灵长类动物、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。
为制备单克隆抗体生产细胞，选择其抗体效价已得到证实的个体动物(如小鼠)，并且在末次免疫2天到5天后收集其脾脏或淋巴结，并使其中所含的抗体生产细胞与骨髓瘤细胞相融合，以制备期望的单克隆抗体生产者杂交瘤。例如，可如下文所述通过使标记蛋白与抗血清反应，然后测量与抗体结合的标记试剂的活性，进行抗血清中抗体效价的测量。细胞融合可根据已知的方法进行，例如Koehler和Milstein所描述的方法(Nature 256495 ；特此并入作为参考)。作为融合促进剂，可使用例如聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(HVJ)，优选PEG。
骨髓瘤细胞的实例包括NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等。抗体生产细胞(脾细胞)数目与待用骨髓瘤细胞数目的比例优选为约1∶1到约20∶1。PEG(优选PEG 1000-PEG 6000)优选以约10％到约80％的浓度添加。通过于约20℃到约40℃、优选约30℃到约37℃，将两种细胞的混合物温育约1分钟至10分钟，可有效地进行细胞融合。
可使用多种方法以筛选产生抗体(如针对本发明的蛋白)的杂交瘤。例如，将杂交瘤上清添加到抗体直接地或者连同载体吸附在其上的固相(如微板)上，然后添加抗-免疫球蛋白抗体(如果细胞融合中使用的是小鼠细胞，则使用抗-小鼠免疫球蛋白抗体)或者由放射性物质或酶标记的蛋白A，以检测针对结合在固相上的蛋白的单克隆抗体。备选地，将杂交瘤上清添加到其上吸附了抗-免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相上，然后添加由放射性物质或酶标记的蛋白，以检测针对结合在固相上的蛋白的单克隆抗体。
单克隆抗体的选择可依据任何已知的方法或其修饰型进行。通常地，采用其中添加了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)的动物细胞培养基。可采用任何选择和生长培养基，只要杂交瘤能够生长即可。例如，可使用含1％到20％、优选10％到20％胎牛血清的RPMI 1640培养基、含1％到10％胎牛血清的GIT培养基、用于杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101，Nissui Seiyaku)等。通常地，培养在约5％CO2气体下于20℃到40℃、优选37℃进行约5天到3周、优选1周到2周。杂交瘤培养物上清的抗体效价可按照与如上针对抗血清中抗-蛋白的抗体效价所述相同的方式测量。
单克隆抗体(如针对本发明的多肽)的分离和纯化可根据与常规多克隆抗体相同的方式进行，例如免疫球蛋白的分离和纯化，例如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、离子交换剂(如DEAE)的吸附以及解吸附、超速离心、凝胶过滤、或者其中由活性吸附剂如结合抗原的固相、蛋白A或蛋白G仅收集一种抗体、并使结合解离以获得抗体的特殊纯化方法。
在其它实施方案中，本发明考虑针对本发明蛋白的重组抗体或其片段。重组抗体包括但不限于人源化及嵌合抗体。产生重组抗体的方法是本领域公知的(参见美国专利6,180,370和6,277,969以及″Monoclonal Antibodies″H.Zola，BIOS Scientific PublishersLimited 2000.Springer-Verlay New York，Inc.，New York；每一篇都特此并入作为参考)。
多克隆抗体可通过任何已知的方法或者这些方法的改动形式进行制备，包括从患者获得抗体。例如，制备免疫原(针对蛋白的抗原)和载体蛋白的复合物，然后根据针对上文单克隆抗体制备所述相同的方式用所述复合物免疫动物。从免疫动物中回收含有所针对的抗体的物质，并分离和纯化所述抗体。
关于待用来免疫动物的免疫原和载体蛋白的复合物，可采用任何载体蛋白以及载体和半抗原的任意混合比例，只要针对在载体上交联并用于免疫的半抗原的抗体有效产生即可。例如，可以每1份半抗原应用约0.1份到约20份、优选约1份到约5份的重量比率，将牛血清白蛋白、牛环球蛋白(cycloglobulin)、匙孔血蓝蛋白等与半抗原偶联。
另外，多种缩合剂可用于半抗原和载体的偶联。例如，戊二醛、碳化二亚胺、马来酰亚胺活化酯、含巯基或二硫基吡啶基的活化酯试剂等可应用于本发明中。向允许抗体生产的动物位点给予缩合产物本身或将其连同合适的载体或稀释剂一起给予。为增强抗体生产能力，可给予完全或不完全弗氏佐剂。通常地，将蛋白以每2周到6周给予一次，总计约3次到约10次。
从由上述方法免疫的动物的血液、腹水等回收多克隆抗体。抗血清中的抗体效价可根据上文针对杂交瘤培养物上清所述相同的方式测量。抗体的分离和纯化可根据针对上文单克隆抗体所述相同的免疫球蛋白分离和纯化方法进行。
本文中用作为免疫原的蛋白不限于任何特定类型的免疫原。例如，本发明的多肽(还包括核苷酸序列部分改变的基因)可用作为免疫原。此外，可使用蛋白片段。片段可通过任何方法获得，包括但不限于表达所述基因的片段、蛋白的酶促加工、化学合成等。
IV.药物筛选在有些实施方案中，本发明提供了筛选测定(如筛选抑制S6K的激酶活性的药物)。本发明提供了体外(如在细胞培养物中)和体内(如在TSC动物模型中)筛选任何数目的候选治疗化合物的测定。
A.候选化合物本发明的药物筛选方法使用可用于TSC治疗的任何数目的候选化合物。在有些实施方案中，候选化合物为雷帕霉素或雷帕霉素衍生物。雷帕霉素为抗真菌抗生素，其可自链霉菌如吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中提取。用于制备雷帕霉素的方法在Sehgal等的美国专利号3,929,992和3,993,749中公开，每一篇都特此并入作为参考。另外，雷帕霉素的单酰基和二酰基衍生物及其制备方法在美国专利号4,316,885中公开，特此并入作为参考。美国专利号4,650,803(特此并入作为参考)公开了雷帕霉素的水溶性前药，即雷帕霉素衍生物，包括如下雷帕霉素前药甘氨酸盐(酯)前药、丙酸盐(酯)前药以及吡咯烷丁酸盐(酯)前药。美国专利号5,118,678(特此并入作为参考)公开了雷帕霉素的氨基甲酸盐(酯)。美国专利号5,100,883(特此并入作为参考)公开了雷帕霉素的氟化酯。美国专利号5,118,677(特此并入作为参考)公开了雷帕霉素的酰胺酯。美国专利号5,130,307(特此并入作为参考)公开了雷帕霉素的氨基酯。美国专利号5,117,203(特此并入作为参考)公开了雷帕霉素的磺酸盐(酯)以及氨基磺酸盐(酯)。美国专利号5,194,447(特此并入作为参考)公开了雷帕霉素的磺酰氨基甲酸盐(酯)。
本发明的药物筛选方法不限于雷帕霉素。可使用任何数目的候选化合物。在有些实施方案中，对商业上可获得的或者已知的候选化合物文库进行筛选。组合化学文库的制备和筛选是本领域熟练技术人员众所周知的。此类组合化学文库包括但不限于肽文库(参见美国准里No.5,010,175、Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)以及Houghton等，Nature 35484-88(1991)；每一篇都特此并入作为参考)。也可以使用产生化学多样性文库的其它化学组成。此类化学组成包括但不限于类肽(peptoid)(PCT公开号WO 91/19735；特此并入作为参考)、编码肽(PCT公开号WO93/20242；特此并入作为参考)、随机生物寡聚体(PCT公开号WO92/00091；特此并入作为参考)、苯并二氮杂(美国专利号5,288,514；特此并入作为参考)、多构体(diversomers)例如乙内酰脲、苯并二氮杂和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993)；每一篇都特此并入作为参考)、类乙烯基(vinylogous)多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992)；特此并入作为参考)、具有β-D-葡萄糖骨架的非肽酰肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992)；特此并入作为参考)、模拟有机合成的小化合物文库(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994)；特此并入作为参考)、低聚氨基甲酸盐(酯)(Cho等，Science 2611303(1993)；特此并入作为参考)、和/或肽酰膦酸盐(酯)(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994)；特此并入作为参考)、核酸文库(见Ausubel、Berger及Sambrook，均见前文)、肽核酸文库(参见美国专利号5,539,083；特此并入作为参考)、抗体文库(参见Vaughn等，NatureBiotechnology，14(3)309-314(1996)以及PCT/US96/10287；每一篇都特此并入作为参考)、碳水化合物文库(参见Liang等，Science，2741520-1522(1996)以及美国专利号5,593,853；每一篇都特此并入作为参考)、小有机分子文库(参见苯并二氮杂，Baum C&EN，January18，page 33(1993)；类异戊二烯，美国专利号5,569,588；噻唑烷酮及间胺苯硫酮(metathiazanones)，美国专利号5,549,974；吡咯烷类，美国专利号5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利No.5,506,337；苯并二氮杂，美国专利号5,288,514等；每一篇都特此并入作为参考。
在其它实施方案中，化合物文库为空间上可寻址的并行固相或液相文库；要求去卷积的合成文库法；“一珠一化合物”的文库法；以及使用亲合层析选择的合成文库法。生物学文库和类肽文库途径优选用于肽文库；而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145；特此并入作为参考)。
合成分子文库的实例可见于现有技术，例如在DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909 ；Erb等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 9111422 ；Zuckermann等，J.Med.Chem.372678 ；Cho等，Science 2611303 ；Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059 ；Carell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061 以及Gallop等，J.Med.Chem.371233 之中。每一篇都特此并入作为参考。
化合物文库可存在于溶液中(如Houghten，Biotechniques 13412-421 ；特此并入作为参考)、或者珠子(Lam，Nature35482-84 )、芯片(Fodor，Nature 364555-556 ；每一篇都特此并入作为参考)、细菌或芽孢(美国专利号5,223,409；特此并入作为参考)、质粒上(Cull等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA8918651869 ；特此并入作为参考)或者噬菌体上(Scott和Smith，Science 249386-390 ；Devlin Science 249404-406 ；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.876378-6382 ；Felici，J.Mol.Biol.222301 ；每一篇都特此并入作为参考)。
B.体外药物筛选在有些实施方案中，本发明提供了体外药物筛选测定。在有些实施方案中，所述体外药物筛选测定为细胞培养物测定。在一个实施方案中，所述测定是基于细胞的测定，其中表达突变体TSC1或TSC2的细胞与测试化合物相接触，并确定测试化合物调整S6K活性的能力。确定测试化合物调整S6K活性的能力可使用任何合适的方法实现，包括但不限于文中所公开的那些。例如，所述细胞可以是哺乳动物来源的。
在其它实施方案中，提供了无细胞测定法，其中S6K或mTOR蛋白或其生物学活性部分与测试化合物相接触，并评价测试化合物改变S6K激酶活性或mTOR活性的能力。无细胞测定法包括在足以允许两组分相互作用和结合的条件和时间下，制备靶基因蛋白和测试化合物的反应混合物，从而形成可以取出和/或检测的复合物。
在更进一步的实施方案中，细胞系(如啮齿动物或人类细胞系如TSC2-/-细胞系(如LexF2细胞))用候选化合物处理，并评价这些细胞系在裸鼠中诱导肿瘤的能力(参见美国专利6,235,873，特此并入作为参考)。例如，在有些实施方案中，将用候选化合物处理过的细胞系诱导肿瘤的能力与未用候选化合物处理的对照细胞系的能力进行比较。
C.体内药物筛选在其它实施方案中，使用了体内药物筛选方法。在有些实施方案中，使用作为TSC动物模型的Ecker大鼠(可获自如Fox Chase CancerCenter，Philadelphia，PA)。在其它实施方案中，使用TSC小鼠模型(参见Kwiatkowski等，Hum Mol Genet 2002 Mar 1；11(5)525-34；特此并入作为参考)。向动物模型给予候选化合物，并观察候选化合物对TSC症状的影响。优选的化合物是可减轻或消除TSC症状但不对动物造成其它不利影响的那些化合物。还利用动物模型(例如文中所述的那些)确定用此种试剂进行的治疗的效力、毒性、副作用或作用机制。此外，通过上文所述的筛选测定法鉴定到的新试剂可以例如用于如本文所述的治疗中。
V.疗法在有些实施方案中，本发明提供了用于治疗TSC的疗法。在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的疗法。
A.TSC疗法在有些实施方案中，本发明提供了治疗TSC的方法。在有些实施方案中，该方法包括施用S6K或mTOR抑制剂(如在上文所述药物筛选测定中鉴定的化合物)。在有些实施方案中，治疗包括施用雷帕霉素或雷帕霉素衍生物或者利用上文所述药物筛选方法鉴定的其它治疗性化合物。在另一些实施方案中，所述TSC疗法包括遗传疗法(如基因治疗)。在更进一步的实施方案中，所述治疗包括抗体治疗(如人源化抗体治疗)。
1.药物疗法在有些实施方案中，利用上文所述药物筛选方法鉴定的小分子治疗剂被用作TSC治疗剂。化合物优选配制为药物化合物(例如，如下文所述)。剂量使用例如下文所述方法确定。相关技术领域熟练技术人员熟知如何配制、确定剂量和施用本发明的治疗化合物。
2.遗传疗法本发明考虑使用任何遗传操作以调整TSC1和TSC2的表达。例如，在有些实施方案中，遗传疗法包括向受试者给予野生型形式的TSC1或TSC2。在体外或体内向细胞递送核酸构建体可利用任何合适的方法进行。合适的方法是将核酸构建体引入到细胞中从而期望的事件得以发生(如野生型TSC1或TSC2基因的表达)的方法。
向细胞中引入携带遗传信息的分子可通过多种方法中的任一种实现，包括但不限于直接注射裸DNA构建体、用载有所述构建体的胶体金颗粒轰击、以及使用例如脂质体、生物聚合物等高分子介导的基因转移。优选的方法使用衍生自病毒的基因递送载体，包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒以及腺伴随病毒。因为与逆转录病毒相比效率更高，衍生自腺病毒的载体是优选的用于将核酸分子体内转移到宿主细胞中的基因递送载体。腺病毒载体已证明能提供极为有效的体内基因转移到动物模型的多种实体瘤内以及免疫缺陷小鼠的人实体瘤异体移植物中。腺病毒载体以及基因转移方法的实例描述在PCT公开WO 00/12738和WO 00/09675以及美国专利申请号No.6,033,908、6,019,978、6,001,557、5,994,132、5,994,128、5,994,106、5,981,225、5,885,808、5,872,154、5,830,730和5,824,544中，每一篇都特此全文并入作为参考。
载体可以多种方法给予受试者。例如，在本发明的有些实施方案中，利用直接注射向肿瘤或与肿瘤有关的组织中给予载体。在其它实施方案中，施用是经由血液或淋巴循环(参见PCT公开99/02685，特此全文并入作为参考)。腺病毒载体示例性的剂量水平优选为向灌注液中添加108到1011个载体颗粒。
3.抗体疗法在有些实施方案中，本发明提供了利用抗体疗法抑制S6K或mTOR的方法。优选的抗体是减轻TSC症状(如通过抑制S6K或mTOR的信号传导功能)的那些抗体。优选的针对S6K的抗体是抑制S6K的激酶活性的抗体。任何合适的抗体(如单克隆、多克隆或合成的)可用在本文所公开的治疗方法中。在优选的实施方案中，用于癌症治疗的抗体为人源化抗体。人源化抗体的方法是本领域众所周知的(参见上文的描述以及美国专利6,180,370、5,585,089、6,054,297和5,565,332；每一篇都特此并入作为参考)。在优选的实施方案中，将基于抗体的治疗剂如下文所述配制为药物组合物。
B.癌症疗法本发明并不局限于TSC的治疗。如上文所述，还认为雷帕霉素及雷帕霉素衍生物(如上文所描述的那些)可用于多种癌症的治疗中。雷帕霉素及衍生物可利用任何合适的筛选方法(如上文所描述的那些)就其降低肿瘤生长的能力进行筛选。例如，在有些实施方案中，癌症动物模型用雷帕霉素治疗。在其它实施方案中，具有肿瘤的裸鼠或肿瘤细胞系被用于药物筛选。本发明并不局限于雷帕霉素作为癌症治疗剂的用途。如上文所述，认为抑制mTOR和S6K信号传导的化合物可作为癌症治疗剂得到应用。
C.药物组合物本发明还提供了药物组合物(如，包括上文所述的药物化合物)。本发明的药物组合物可以许多方式施用，取决于是否期望局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部(包括眼部以及粘膜施用，包括阴道和直肠递送)、肺部(如通过粉剂或气溶胶的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或者颅内，如鞘内或心室内施用。
用于局部施用的药物组合物和试剂可包括经皮贴片、膏剂、洗液、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体及粉剂。常规的药学载体、水性、粉末或油基(oily bases)、增稠剂等可能是期望的。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒、悬液或者水或非水介质中的溶液、胶囊、囊剂或片剂。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或者粘合剂。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其可能也含缓冲剂、稀释剂及其它合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物及其它药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分产生，包括但不限于预形成的液体、自乳化的固体以及自乳化的半固体。
本发明的药物制剂可方便地以单位剂量的形式存在，可通过制药业中众所周知的常规技术制备。此类技术包括使活性成分与药学载体或赋形剂进行结合的步骤。通常制剂通过均一和紧密地使活性成分与液体载体或者精细分开的固体载体或两者兼而有之进行结合来制备，然后如有必要，对产品塑形。
本发明的组合物可配制为许多可能的剂型中的任一种，例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以配制为处于水性、非水性或混合介质中的悬液。水性悬液还可以含有提高悬液粘度的物质，例如包括羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬液也可以含有稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可作为泡沫配制和使用。药物泡沫包括诸如但不限于乳剂、微乳剂、霜剂、果冻和脂质体等的制剂。尽管在性质上基本上相似，这些制剂在组分以及成品的一致性方面变化不等。
在细胞水平促进寡核苷酸摄入的试剂也可以添加到本发明的药物及其它组合物中。例如，阳离子脂质如脂质转染试剂(lipofectin)(美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物、以及多聚阳离子分子如多聚赖氨酸(WO97/30731)，也促进寡核苷酸的细胞摄入。
本发明的组合物可以另外含有常见于药物组合物之中的其它佐剂组分。从而，例如，组合物可以含有附加的、相容的药学活性物质，例如象止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎因子，或者可以含有用于在物理学上配制本发明组合物的各种剂型的附加物质，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。不过，此类物质在加入时，不应当过度地干扰本发明组合物组分的生物学活性。制剂可以被灭菌，并且如果期望，可与辅剂混合，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、颜料、调味料和/或芳香物质等，它们并不会有害地与制剂的核酸相互作用。
本发明的有些实施方案提供了含有(a)一种或多种本发明的化合物和(b)一种或多种其它化疗剂的药物组合物。此类化疗剂的实例包括但不限于抗癌药物例如柔红霉素、放线菌素、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟脱氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、依托泊甙、替尼泊苷(teniposide)、顺铂及乙烯雌酚(DES)。抗炎药，包括但不限于非甾体类抗炎药和皮质类固醇，以及抗病毒药物，包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可以组合到本发明的组合物中。其它化疗剂也落在本发明的范围之内。两种或多种组合的化合物可一起或者相继使用。
给药取决于待治疗疾病状态的严重度和反应性，疗程从数天持续到数月，或者直到实现了治愈或者达到了疾病状态的减轻。最佳给药日程可根据患者体内药物累积的测量值计算。施用医师能够容易地确定最佳剂量、给药方法及重复频率。最佳剂量可根据个别寡核苷酸的相对效力而变，并且一般可根据发现在体外及体内动物模型中有效的EC50或者根据本文所描述的实施例予以估计。一般而言，剂量为每kg体重0.01μg到100g，并且可以每日、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医师能够根据测量的体液或组织中药物的残留时间及浓度估计施用的重复频率。在成功治疗之后，可能期望对受试者进行维持治疗以防止病态的复发，其中的寡核苷酸以维持剂量给药，每kg体重从0.01μg到100g的范围内变化，从每日一次或多次到每20年一次。
VI.讨论蛋白合成是受广泛系列的胞内和胞外条件如促有丝分裂生长因子、氨基酸浓度以及细胞能量水平调控的主要细胞过程(Schmidt，Oncogene 182988-2996(1999)。主要的翻译控制之一是由mTOR对S6K和4EBP1的磷酸化介导的(Proud，2002)。在本发明形成的过程期间进行的研究证明了TSC2响应于细胞能量水平而中起着主要的生理作用(图7G)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为Akt对TSC2的磷酸化传递生长因子信号并阻抑了TSC2抑制S6K和4EBP1磷酸化的能力。相反，由低细胞能量水平发动的AMPK对TSC2的磷酸化刺激了TSC2活性。这些结果证明了TSC2的AMPK-依赖性磷酸化是ATP耗尽诱导的S6K脱磷酸化所必需的。
蛋白合成使用约25-30％的总细胞能量，因此必需与细胞能量状态密切协调。翻译抑制可能代表了能量限制条件下细胞中主要的生理应答。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，在图7G中还是提出了一种机制。基于图7G中所示的模型，mTOR处于TSC1/TSC2下游的能量感测途径中。不过，AMPK很可能是细胞能量感受器，并在TSC1/TSC2上游发挥功能。AMPK可通过至少两种机制抑制翻译，一种是通过真核细胞延伸因子2(eEF2)的磷酸化(Horman等，2002)，而另一种是通过TSC2的磷酸化。不过，AMPK对eEF2的磷酸化并不依赖于TSC-mTOR途径。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为AMPK的激活通过响应于能量饥饿和低代谢状况而阻抑包括S6K、4EBP1和eEF2在内的多个翻译调节子的功能在蛋白合成的抑制中起着主要作用。TSC2是AMPK的关键下游靶标。
葡萄糖剥夺在TSC2-/-LEF细胞中诱导大规模的细胞凋亡。野生型TSC2的表达彻底阻断了细胞凋亡，而TSC2-3A突变体的表达则不能保护细胞免于细胞凋亡。而且，TSC2仅保护免于葡萄糖剥夺所致的影响，而不保护免于DNA损伤所诱导的细胞凋亡。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为TSC2在细胞能量应答中起着至关重要并且是特定的作用。TSC2在细胞能量应答中的功能还得到了因葡萄糖剥夺或2-DG处理所致的能量限制也降低细胞大小这一事实的支持。另外，TSC2表达也降低细胞大小。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为能量限制和TSC2类似地调控培养的哺乳动物细胞的大小。本研究也确立了AMPK对TSC2的磷酸化在针对细胞能量限制的生理应答中的重要性。认为AMPK-依赖性磷酸化对TSC2的激活导致了蛋白合成的下降和细胞能量的保全(图7G)。与该模型相一致，雷帕霉素显著地保护LEF细胞免于葡萄糖剥夺所诱导的细胞凋亡(未发表的数据)。能量饥饿条件下TSC2-/-细胞无能力阻抑翻译可招致有害效应并引发细胞凋亡。本发明披露了TSC2在细胞生长和细胞存活中的重要生理学功能。在有些实施方案中，认为降低细胞能量水平的任何方法(如葡萄糖或氨基酸、调控ATP代谢的药物的供给的减少等)可应用于本发明的治疗方法中。
值得一提的是已发现AMPK中的突变牵涉到家族性肥厚型心肌病(Hardie和Hawley，2001)。此外，在心脏肥大的阻抑中雷帕霉素对mTOR的抑制已得到文献的充分记载(Shioi等，Circulation 1071664-1670(2003)。在果蝇以及来自本研究的哺乳动物细胞中，TSC2为细胞大小控制的显性负调节子(Potter和Xu，Curr.Opin.Genet.Dev.11279-286(2001)。所有这些观察结果与TSC2在AMPK下游起作用而抑制mTOR的这种非限制性模型相一致。这提供了TSC2在心脏肥大中介导AMPK功能的用途。
LKB 1是一种肿瘤抑制基因。LKB 1的突变是波-杰综合症的起因(Hemminki等，Nature 391184-187(1998)；and Jenne等，Nat.Genet.1838-43(1998))。尚不清楚LKB1作为肿瘤抑制剂的分子机理，因为以前不知道LKB1的关键生理底物。近来已经证实，LKB1是AMPK的上游活化激酶(Hong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1008839-8843(2003)；Sutherland等Curr Biol 131299-1305(2003；Hawley等J.Biol.2(28)(2003))。LKB1能在活化环中直接磷酸化AMPK，并提高AMPK激酶活性。波-杰综合症的特征在于主要在肠中的多错构瘤。有趣地，波-杰综合症中的错构瘤类似于在TSC中看到的良性肿瘤，尽管肿瘤发生在不同的组织中(Yoo等Nat.Rev.Cancer2529-535(2002))。本发明不限于特定的机理。实际上，对机理的理解并非实施(制备和使用)本发明所必需的。尽管如此，认为这些观察和在形成本发明形成过程中产生的其它数据一起，暗示着LKB1的肿瘤抑制剂功能的一种可能的分子机理，其中LKB1肿瘤抑制剂会通过AMPK活化TSC2肿瘤抑制剂。LKB1通过间接抑制mTOR途径和蛋白合成，抑制细胞生长。
在一些实施方案中，将S6激酶抑制剂(如雷帕霉素等)以治疗水平提供给患有波-杰综合症或有关的癌症和/或错构瘤的受试者，包括但不限于，Cowden′s disease(多发性错构瘤综合症)，青年性息肉病，Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合症(以前的Bannayan-Zonana-，Riley-Smith-，和Ruvalcaba-Myhre-Smith综合症)。本发明不限于特定的机理。实际上，对机理的理解并非实施(制备和使用)本发明所必需的。尽管如此，认为这LKB1肿瘤抑制剂会通过AMPK活化TSC2肿瘤抑制剂，因此，LKB1通过间接抑制mTOR途径和蛋白合成而抑制细胞生长。
总而言之，肿瘤抑制剂TSC2整合了来自多个途径的信号以调控翻译、细胞大小和细胞凋亡。TSC2参与了针对代谢状态和能量水平的细胞应答。TSC2的AMPK-依赖性磷酸化激活为细胞防备不利生长环境，并保护其免于细胞死亡。除了引起结节性硬化症，TSC1/TSC2肿瘤抑制剂复合体的失活在致癌途径和细胞肥大中也具有作用。本发明提供了耗尽细胞能量水平、选择性杀死TSC1-或TSC2-癌细胞的方法，从而提供了对癌症及其它病况的治疗。
实验提供如下实施例是为了证明和进一步阐释本发明的某些优选实施方案和方面，而不应当解释为对其范围的限制。
在下面的实验内容中，适用如下缩略语N(正常)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；pmol(皮摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)以及℃(摄氏度)。
A.方法抗体、质粒及试剂抗-S6K、抗-磷S6K、抗-mTOR、抗-磷mTOR、抗-Akt、抗-磷Akt、抗磷4EBP-1以及抗-磷ERK抗体来自Cell Signalling有限公司。抗-TSC2和抗-Myc抗体来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。抗-HA和抗-Flag抗体分别来自Covance(Princeton，NJ)和Sigma(St Louis，MO)。HA-标记的S6K1(α11)和GST-S6构建体获自于J.Blenis(Columbia Univ，NY，NY)。Flag-标记的mTOR和激酶失活的mTOR获自于S.Schreiber(Harvard Univ，Cambridge，MA)。所有其它DNA构建体，包括H-RasV12、PTEN、PTEN-CS、Akt、Akt-KM、Flag-泛素和Flag-4E-BP1均为实验室储存。所有TSC2的突变构建体是通过PCR诱变产生的，并通过DNA测序验证。LY294002来自Calbiochem(San Diego，CA)；磷酸酶来自New England Biolabs(Beverly，MA)。MG132来自Peptide Institute。放线菌酮和渥曼青霉素来自Sigma。D-PBS来自Gibco。雷帕霉素来自Cell Signalling。
细胞培养、转染和免疫沉淀将HEK293细胞接种并维持在含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。在无血清条件下，利用Lipofectamine试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)，依照制造商的说明书进行转染。简言之，转染后4小时，细胞在含10％FBS的DMEM中恢复16小时，然后饥饿16-24小时。然后在裂解缓冲液(pH 7.5的10mM Tris-HCl，100mM氯化钠，1％NP-40，1％Triton X-100，50mM氟化钠，2mM EDTA，1mM苯甲磺酰氟，10μg ml-1亮抑酶肽和10μg ml-1抑酶肽)中裂解细胞并由所示抗体和蛋白G-Sepharose珠免疫沉淀。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析免疫复合物。
激酶测定对于S6K测定法，连同或不连同各种质粒，用10-20ng HA-S6K构建体转染生长于6孔板中的HEK293细胞，如图所示。HA-S6K由抗-HA抗体自血清饥饿的细胞中免疫沉淀，并利用纯化的GST-S6作为底物，通过体外激酶测定法予以分析(Pearson等，EMBO J.14，5279-5287(1995))。
对于Akt激酶测定法，在2μg RasV12的存在下将10μg GST-Akt或GST-Akt-KM(激酶失活)DNA转染到10cm板的HEK293细胞中。纯化GST-Akt并用于在体外磷酸化5μg纯化的GST-TSC2片段1(氨基酸910-1112)或片段2(氨基酸1357-1765)。mTOR激酶测定法如以前所描述的那样进行(Dennis等，Science 294，1102-1105(2001))。简要地，HEK293细胞用Flag-mTOR瞬时转染，连同或不连同TSC1-TSC2进行。裂解细胞，并由抗-Flag抗体免疫沉淀，并利用纯化的GST-S6K作为底物通过体外激酶测定法予以分析。mTOR激酶缓冲液含2mM ATP。GST-S6K的磷酸化由抗-磷-Thr 389 S6K抗体通过免疫印迹分析予以测定。
RNA干预(RNA interference)RNAi-N和RNAi-C代表对应于TSC2氨基酸残基164-170(RNAi-N)和1518-1524(RNAi-C)的双链RNA寡核苷酸(Elbashir等，Nature 411，494-498(2001))。HEK293细胞利用Lipofectamine试剂由200-1000ng RNAi连同或不连同所示质粒进行转染，如上文所述。内源TSC2水平由抗-TSC2抗体通过免疫印迹予以测定。
代谢标记和二维磷肽作图HEK293细胞用HA-标记的TSC2、Myc-标记的TSC1以及所示质粒共转染。对细胞进行4小时磷酸盐及血清饥饿，之后与0.25mCi ml-132P-正磷酸盐(ICN)温育4小时。
细胞用冰冷PBS洗涤一次并裂解。免疫沉淀HA-标记的TSC2，通过SDS-PAGE拆分，并转移到PVDF膜上。磷酸化的TSC2通过放射自显影显像，然后进行磷肽作图分析。简言之，切下磷酸化的TSC2条带，甲醇固定并在500μl溶于100mM乙酸的0.5％聚乙烯吡咯烷酮-40中于37℃温育30分钟。然后将样品用20μg TPCK-处理的胰蛋白酶(Sigma)于37℃在pH 8.0含5％乙腈的75mM碳酸氢铵缓冲液中消化。消化后，样品真空干燥，并悬浮于10μl水中。将样品点到纤维素板上，并利用pH 8.9的1％碳酸氢铵缓冲液进行第一维电泳。板在层析缓冲液(正丁醇∶嘧啶∶乙酸∶水；20∶24∶6∶30)中通过第二维层析予以分离。干燥板，且通过放射自显影显像磷肽。
B.结果TSC1-TSC2对S6K活性的影响为阐释TSC1-TSC2在细胞生长调节中的功能机制，研究了哺乳动物细胞中TSC1-TSC2对S6K活性的影响。除胰岛素-及Ras-刺激的S6K激酶活性之外，TSC1和TSC2的共表达还抑制基础S6K激酶活性(图1a)。TSC1-TSC2的这种抑制活性与其在细胞生长调节中的负作用一致。S6K活性因几个残基(包括Thr 389、Thr 421和Ser 424)上的磷酸化而激活(Dufner和Thomas，Exp.Cell Res.253，100-109(1999))。这些残基的磷酸化被胰岛素、Akt和激活的Ras所刺激(图1b)。另外，TSC1-TSC2的共表达在所有三种条件下均抑制Thr389的磷酸化(图1b)。Thr 389是已知的与S6K29的激活相关的雷帕霉素敏感型磷酸化位点。TSC1和TSC2的共表达对S6K中Thr 421或Ser 424(其为雷帕霉素非敏感位点(Dufner等，同上))的磷酸化几乎没有影响(图1b)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为这些结果表明TSC1-TSC2复合体可通过mTOR发挥作用。
为测试TSC1-TSC2在S6K活化中的特异性，研究了TSC1-TSC2对ERK的作用，该ERK也为Ras所激活。结果显示TSC1-TSC2的过表达对Ras-诱导的ERK磷酸化没有影响，而相同实验中S6K的磷酸化被抑制(图1c)。这些观察结果证明TSC1-TSC2特异性地抑制S6K的磷酸化及活化。
为确定TSC1-TSC2在胰岛素途径中的位置，研究了TSC1-TSC2过表达对处于mTOR和S6K上游的胰岛素诱导的Akt磷酸化的影响。结果证明TSC1-TSC2不能抑制胰岛素诱导的Akt磷酸化，但的确以剂量依赖型的方式抑制S6K的磷酸化(图1d)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，预计TSC1-TSC2在Akt下游或与之平行地发挥功能。
RNA干预利用RNA干预(RNAi)测试内源TSC2对S6K的影响。使用对应于TSC2氨基端(RNAi-N)或者C-末端(RNAi-C)区域的两种RNA双链体来抑制内源TSC2的表达(图2a)。RNAi-C或RNAi-N的转染导致HEK293细胞中内源TSC2蛋白水平的显著下降，而TSC2 RNAi对MEK2的表达水平没有影响。该数据证明TSC2 RNAi对内源TSC2蛋白水平的降低增强了转染的S6K的基础及胰岛素刺激的磷酸化(图2a)。采用不相关RNA寡核苷酸的对照实验对S6K磷酸化没有影响。也研究了TSC2 RNAi对内源Akt、S6K和S6磷酸化的影响。TSC2 RNAi的转染诱导了内源S6K和S6两者而非Akt磷酸化小量但可重复的增长(图2b)。S6磷酸化的增长说明TSC2 RNAi增强了S6K活性。与共转染的血细胞凝集素(HA)-标记的S6K相比，内源S6K磷酸化的增长不太显著。这是因为转染效率小于100％。未转染细胞中的内源S6K稀释了RNAi在转染细胞中的效应。因此，由TSC2 RNAi转染的细胞中内源S6K的实际增长应当比图2b中所示数据更为显著。上述观察结果证明TSC1-TSC2的一种生理功能在于抑制S6K激酶的磷酸化及活化。
TSC突变对激酶活性的影响以前已在患者中鉴定了TSC1和TSC2中的许多突变(Dabora等，Am.J.Hum.Genet.68，64-80(2001)；Jones等，Am.J.Hum.Genet.64，1305-1315(1999)；特此并入作为参考)。下面测试了这些疾病来源的突变对TSC2抑制S6K活性的能力的影响。具体地，测试了亲水性或带电残基的点突变，因为表面残基的突变不太可能影响TSC2的三级结构。与野生型对照相比，在所分析的11种疾病相关的突变体中，全部都表现出抑制S6K磷酸化的能力下降(图2c)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，预计这些数据表明TSC1-TSC2对S6K活性的抑制是生理学相关的。
Akt对TSC2的磷酸化尽管果蝇中的遗传研究已确认dTsc1-dTsc2可拮抗IR在细胞生长控制中的功能，该途径中dTsc1-dTsc2的精确功能尚不清楚。遗传证据也显示dTsc1-dTsc2可能在Akt下游或与之平行地发挥功能(Gao和Pan，Genes Dev.15，1383-1392(2001)；Potter等，Cell 105，357-368(2001))。为区别这种两种可能性，研究了Akt对TSC1和TSC2的影响。Akt而非激酶失活突变体Akt-KM的共表达导致慢迁移形式TSC2的累积，表明Akt可促进TSC2的磷酸化(图3a)。相反，Akt对TSC1没有影响。另外，用阻断Akt的内源激活的PI(3)K抑制剂LY294002处理，也提高了TSC2的迁移率。此外，采用PTEN或催化失活突变体PTEN-CS的实验也支持Akt负责TSC2的磷酸化的观点。PTEN而非PTEN-CS的表达提高了TSC2的迁移率(图3a)。磷酸酶处理证实迁移率变动是磷酸化的结果(图3a)。
为表征Akt对TSC2的磷酸化，进行了体内32P-标记和二维磷肽作图分析。结果显示TSC2在体内在多位点磷酸化(图3b)。Akt或PTEN的共表达影响了一个磷肽亚组(图3b，小图V和VI)。Akt可提高这些磷肽的强度，而PTEN则降低此强度。这些结果也示意性地列出(图3b，小图IV)。阴影点表示其强度因Akt或PTEN的共表达而改变的磷肽。胰岛素刺激稍微地提高了由Akt增强的相同磷肽的磷酸化(图3c，小图II)。用间接抑制Akt的LY294002处理也降低了相同磷肽亚组的磷酸化(图3c，小图III)。相反，雷帕霉素对mTOR的抑制对TSC2磷酸化没有影响(图3c，图IV)。这些结果表明胰岛素-Akt途径负责TSC2的磷酸化，而mTOR或S6K不参与其中。
TSC2的突变分析TSC2的序列分析证明它含有八个推断的Akt共有磷酸化位点(Datta等，Genes Dev.13，2905-2927(1999))，其中两个在dTsc2中是保守的(图4a)。获得了具有两个推断Akt位点内部缺失的大鼠TSC2 cDNA。本研究中使用这种短形式的TSC2，其也在表达序列标签(EST)数据库的若干克隆中鉴定到。为进一步研究TSC2的磷酸化，对这六个推断的Akt磷酸化位点(图4a)进行个别(A1-A5)或者组合突变(6A)(图4b)。Ser 939(A1；小图I)、Ser 1086/Ser1088(A2；小图II)、Thr 1422(A4；小图IV)而非Ser 1378(A3；小图III)或Ser1756(A5；小图V)的突变影响了TSC2的磷肽模式(图4b)。6A突变体中消失的磷肽(小图VI)在小图VIII中表示为阴影点。这些磷肽的模式与Akt或PTEN的共表达(比较图3b小图IV和图4b小图VIII)或者由LY294002处理(图3c，图III)所改变的那些磷肽模式精确匹配。这些数据证明Ser 939、Ser1086/Ser 1088和Thr 1422是TSC2的正确体内磷酸化所必需的。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，我们认为这些位点是Akt-依赖性的磷酸化位点。
为证明Akt在上文所鉴定的残基上磷酸化TSC2，利用纯化的重组蛋白研究了Akt是否在体外磷酸化TSC2。从转染的HEK293细胞中纯化谷光甘肽S-转移酶(GST)-Akt，而TSC2片段1和2在大肠杆菌中表达和纯化。野生型Akt而非激酶失活的Akt-KM突变体有效地在体外磷酸化TSC2片段1和2(图4a，c)。此外，片段1中的Ser 939、Ser 1086和Ser 1088突变以及片段2中的Thr 1422突变均消除了体外的Akt-依赖性磷酸化(图4c)。该数据显示无论在体内还是体外，Akt都直接在多位点磷酸化TSC2。
根据Akt和TSC2在果蝇细胞生长控制中相反的功能，似乎可能被Akt磷酸化则抑制TSC2功能。Akt磷酸化位点突变为丙氨酸增强了TSC2抑制S6K的能力，而突变为磷拟态酸性残基则降低TSC2的抑制活性(图5a)。Akt信号传导途径的另一个下游靶标为4E-BP1，其参与PI(3)K/Akt-诱导的细胞生长调控(Miron等，Nature Cell Biol.3，596-601(2001))。与此相一致的，磷拟态TSC2突变体在抑制4E-BP1磷酸化方面不如丙氨酸突变体有效(图5b)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，这些数据被认为表明了Akt依赖性的磷酸化会抑制TSC2功能。
TSC1和TSC2之间复合体的形成对于其生物学功能很重要。疾病相关的TSC2突变削弱了与TSC1的相互作用(图2c)，这还支持了TSC1-TSC2复合体形成的功能重要性。也发现TSC2中Akt位点的磷酸化模拟突变削弱了其与TSC1的相互作用，如通过免疫共沉淀实验所测定的那样(图5c)。游离TSC2由于其对泛素-依赖性降解的敏感性而不稳定，而TSC1-TSC2复合体的形成稳定了TSC2(Benvenuto等，Oncogene 19，6306-6316(2000))。当利用同量的DNA进行转染时，磷拟态TSC2突变体一致地以比野生型或TSC2突变体更低的水平表达。TSC2的磷酸化模拟突变体，与疾病来源的TSC2R611Q突变体类似，不如野生型TSC2或丙氨酸突变体稳定(图5d)。在10μM MG132——一种蛋白体依赖性蛋白降解抑制剂——的存在下研究了TSC2突变体的泛素化。如所预期的那样，磷拟态突变体被泛素化，而野生型TSC2和丙氨酸取代突变体以较小的程度被泛素化(图5e)。同样地，疾病来源的TSC2R611Q突变体也是高度泛素化的。因此，Akt-依赖性的磷酸化通过使其与TSC1的结合去稳定化、促进泛素介导的降解来抑制TSC2的功能。
营养物刺激营养物刺激激活S6K而失活4E-BP1(Shah等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.279，E715-E729(2000))。营养物诱导的S6K和4E-BP1磷酸化被雷帕霉素阻断，说明了mTOR在营养物信号传导中的主要作用。相反，营养物刺激对Akt35的活化没有影响。营养物刺激的S6K磷酸化和激酶活性受TSC1-TSC2抑制(图6a)，表明TSC1-TSC2也参与所述营养应答。与S6K相比少得多的TSC1-TSC2蛋白被表达的条件下观察到S6K活性的抑制。未检测到S6K和TSC1-TSC2之间直接的相互作用，TSC1-TSC2选择性抑制S6K中雷帕霉素敏感型位点Thr389的磷酸化(图1b)。4E-BP1的磷酸化对于雷帕霉素抑制很敏感，而mTOR已证明直接磷酸化4E-BP1(Gingras等，Genes Dev.13，1422-1437(1999))。TSC1-TSC2的共表达也应答营养物的刺激而抑制4E-BP1的磷酸化(图5b)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，综上认为，这些观察结表明TSC1-TSC2可能通过mTOR发挥功能而调控S6K和4E-BP1的磷酸化。
为研究mTOR在TSC1-TSC2功能中的作用，分析了雷帕霉素抗性突变体S6K-dC104和S6KdNC(Dennis等，Science 294，1102-1105(2001)；Weng等，Mol.Cell.Biol.15，2333-2340(1995)；每一篇都特此并入作为参考)。S6K-dC104含C-末端缺失，S6K-dC104中Thr 389的磷酸化受LY249002而非雷帕霉素的抑制(Dennis等，前文)。与此形成对照，S6K-dC104的激酶活性受雷帕霉素抑制(Weng等，前文；Schalm等，Curr.Biol.12，632-639(2002))。与所报道的观察结果一致，S6K-dC104中Thr 389的磷酸化受渥曼青霉素或LY294002而非雷帕霉素的抑制(图7a)。TSC1-TSC2既不抑制基础的也不抑制胰岛素刺激的S6K-dC104中Thr 389的磷酸化(图7b)。S6K-dC104的激酶活性受TSC1-TSC2抑制(图7c)。这些结果说明TSC1-TSC2的效果与雷帕霉素的效果相仿。S6K的N-末端区含TOR信号传导(TOS)基序(Schalm等，同前)。TOS基序的缺失会严重降低激酶活性，并消除mTOR的刺激。然而，进一步缺失C末端会部分地拯救N-末端缺失的激酶活性，并使得S6K-dNC对雷帕霉素具完全抗性(Schlam等，同前)。S6K-dNC的激酶活性也抗TSC1-TSC2的抑制(图7c)。TSC1-TSC2对S6K突变体的影响与雷帕霉素的效力严格相关，因此支持TSC1-TSC2和mTOR在同一途径中行使功能的模型。
为确定TSC1-TSC2对mTOR的影响，进行了免疫沉淀的mTOR的体外激酶测定。TSC1-TSC2共转染抑制了mTOR激酶使S6K的Thr 389磷酸化的能力(图7d)，表明mTOR活性受TSC1-TSC2抑制。为进一步测试TSC1-TSC2对mTOR活性的影响，研究了mTOR在牵涉到mTOR激活的Ser 2448处的磷酸化作用(Nave等，Biochem J.344，427-431(1999))。结果证明TSC1-TSC2的过表达以剂量依赖性的方式抑制mTOR中Ser 2448的磷酸化(图7e)。此外，RNAi对内源TSC2的降低造成了mTOR中Ser 2448磷酸化的提高，这支持了TSC1-TSC2在mTOR调节中的负作用。推测Akt可使MTOR中的Ser2448磷酸化(Nave等，前文；Scott等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 95，7772-7777(1998)；Sekulic等，Cancer Res.60，3504-3513(2000))。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为，由于Akt的活化不受TSC1-TSC2的抑制，TSC1-TSC2介导的mTOR在Ser 2448处磷酸化的抑制是竞争共用激酶Akt的结果。也有可能是TSC1-TSC2阻断了mTOR对Akt的可接近性和/或促进了mTOR的磷酸化。
ATP耗尽诱导了TSC2磷酸化蛋白合成受多种细胞条件包括细胞能量水平的调控。已观察到葡萄糖类似物2-脱氧-葡萄糖(2-DG，其通过间接抑制己糖激酶而阻断细胞葡萄糖利用)、线粒体解偶联剂FCCP以及PKC抑制剂楸毒素(Rottlerin)(Soltoff，J.Biol.Chem.27637986-37992(2001)对细胞ATP的耗尽造成了S6K和4EBP1的脱磷酸化(图8A)。另外，在D-PBS中培养细胞所致的营养物耗尽会抑制S6K和4EBP1的磷酸化(Hara等，1998)。ATP耗尽和营养物剥夺也导致TSC2在5％SDS-PAGE凝胶上分辨时有明显的迁移上移(upshift)(图8B)，说明TSC2磷酸化很可能被这些细胞条件加强。
以前已报道过使用20-100mM浓度的2-DG处理可实现胞内ATP水平的20-50％下降，并导致对S6K和4EBP1磷酸化的抑制(Dennis等，2001)。其结论是2-DG对S6K和4EBP1磷酸化的抑制直接地归结于mTOR对降低ATP水平的感测，其中mTOR对ATP具有1mM左右的Km(Dennis等，2001)。在本发明形成过程期间进行的实验观察到100mM的甘露醇(一种渗透剂)也显著抑制S6K的磷酸化(图8C)，表明高浓度2-DG的效应是归因于细胞ATP水平耗尽及其作为渗透剂的混合应答。还观察到在低浓度2-DG如25mM时，S6K上T389的磷酸化被有效抑制，而相似浓度的甘露醇几乎没有作用(图8C)。对于S6和4EBP1的磷酸化观察到相似的结果(图8C)。与mTOR活性相关的mTOR S2448磷酸化(Nave等，1999；Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.957772-7777(1998)；Sekulic等，2000)也被25mM 2-DG抑制(图8C)。相反，25mM 2-DG对于Akt磷酸化几乎没有作用(图8C)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果证明2-DG特异性地抑制S6K、4EBP1和mTOR的磷酸化，但并不通过Akt进行信号传导。
AMPK较之于mTOR对细胞能量状态的变化更为敏感，因为它受AMP/ATP比率的激活。25mM 2-DG激活AMPK，如AMPK中T172磷酸化的显著提高所示(图8D)。25mM 2-DG诱导快速的AMPK激活，并伴随着作为处理时间的函数的S6K脱磷酸化(图8E)。这些数据与AMPK激活与作用于S6K和4EBP1的抑制密切关联的最近报道相一致(Horman等，2002；Kimura等，2003；Krause等，2002)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果证明了AMPK的活化可能对ATP耗尽诱导的S6K和4EBP1脱磷酸化负有责任。在用25mM 2-DG处理的细胞中观察到统计学上显著的ATP水平的下降和AMP/ATP比率的升高(图8F，G)。然而，根据以前发表的数据，ATP浓度的下降并不显著影响mTOR的激酶活性(Dennis等，2001)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为在对轻度能量耗尽的应答中，AMPK是首要的能量传感器。葡萄糖限制也会降低S6K磷酸化、提高AMPK磷酸化并导致TSC2的迁移率变化(图8H)。
2-DG刺激内源AMPK和TSC2之间的相互作用为确定AMPK是否负责TSC2的磷酸化，研究了AMPK和TSC2相互作用的存在。AMPK的免疫沉淀显示TSC1和TSC2两者都微弱地被AMPK免疫共沉淀(图9A)。已发现TSC2和TSC1在2-DG刺激后优先地与AMPK相互作用。也进行了与识别活性形式的AMPK的抗-磷AMPK抗体(pAMPK)的免疫共沉淀。该抗体特异性地沉淀来自对照和经2-DG处理的细胞裂解物二者中的活性形式AMPK(图9A)。然而，在抗-pAMPK免疫沉淀中未回收到TSC2或TSC1。这种观察现象并不令人惊讶，因为在AMPK中T172位于活化环之中(Scott等，J.Mol.Bio.317309-323(2002)；Stein等，Biochem.J.345(part 3)437-443(2000)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为，基于已知的激酶结构这些结果证明，AMPK与活化环的结合可阻断底物结合。
为确定活性AMPK是否与TSC2相关，进行了抗-TSC2抗体的相互免疫共沉淀，继之以抗-AMPK和抗-pAMPK抗体的蛋白印迹。观察到内源AMPK和TSC2之间的相互作用被2-DG促进(图9B)。这种相互作用通过将TSC2抗体和竞争肽事先温育而被有效竞争，证明了免疫共沉淀的特异性(图9B)。图9C显示裂解物中的蛋白水平相似。上述观察结果证明2-DG处理可刺激内源TSC2和AMPK之间的相互作用。
也进行了内源AMPK和过表达的TSC2之间的共免疫沉淀研究，证实了2-DG促进TSC2和AMPK之间的相互作用(图9D)。缺失分析表明，TSC2的C-末端结构域负责与AMPK的相互作用，而N-末端结构域并非必需的。
TSC2是介导细胞能量应答所必需的为确定在2-DG对S6K的失活中TSC2的作用，用TSC2 RNAi寡聚物处理HEK293细胞。TSC2 RNAi显著降低内源TSC2蛋白水平，但对无关蛋白MEK2没有影响(图10A)。2-DG诱导的S6K脱磷酸化在TSC2破坏细胞中被阻断，但对照细胞中没有。相反，TSC2的破坏对应答2-DG的AMPK磷酸化没有显著影响。即使当TSC2表达被破坏时，雷帕霉素对mTOR的抑制也阻断了S6K的磷酸化，表明mTOR处于TSC2的下游(图10B)。
还研究了AMPK在S6K调控中的作用。活性AMPKαI或αII催化亚基的共表达导致了S6K磷酸化的下降(图10C)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为AMPK可对S6K磷酸化负调控。RNAi对TSC2的破坏阻断了AMPK表达的抑制效应，表明TSC2在AMPK下游起作用。TSC2 RNAi和雷帕霉素都不影响乙酰CoA羧化酶(ACC)和真核细胞延伸因子2(eEF2)两种AMPK底物——的磷酸化(图10D，E)，支持了TSC2在介导AMPK对S6K调控中的特异性作用。
推测认为，如果TSC2在介导ATP耗尽对S6K的抑制中发挥作用，则EEF8(TSC2-/-)和EEF4(TSC2+/+)成纤维细胞应当对各种ATP耗尽试剂有不同的应答。正如所预期的那样，EEF8细胞表现出高得多的S6K磷酸化水平(图10F)。为比较EEF4和EEF8细胞的结果，长时和短时曝光的S6K磷酸化免疫印迹都示于图10F中。观察到楸毒素、FCCP、以及在更小程度上叠氮化物、寡霉素和鱼藤酮(retenone)导致EEF4细胞中S6K磷酸化的下降。这些试剂对S6K磷酸化的影响在EEF8细胞中更微弱(图10F)。对于4EBP1的磷酸化观察到相似的结果。不过，EEF4和EEF8细胞之间AMPK的激活没有差别(图10F)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为TSC2在介导ATP耗尽对S6K和4EBP1磷酸化的影响中起着重要作用。用2-DG和D-PBS处理进行了类似实验。在EEF8(TSC2-/-)细胞中，2-DG和D-PBS4EBP1磷酸化几乎没有影响。这与EEF4(TSC2+/+)细胞中对4EBP1磷酸化的抑制形成对照(图10G)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些数据与以前发表的营养物耗尽诱导的S6K脱磷酸化在TSC2-/-细胞中受损的观察结果相一致(Gao等，Nat.Cell Biol.4699-704(2002)。
TSC2被AMPK所磷酸化用λ磷酸酶进行的处理将TSC2转换为更快的迁移条带(图11A)，表明2-DG-诱导的迁移率变化归因于磷酸化。TSC1也是磷蛋白，其因λ磷酸酶处理而迁移下移(downshift)(图11A)。不过，2-DG处理并不改变TSC1的迁移率。活性AMPKαI的共转染也诱导TSC2而非TSC1的迁移上移(upshift)，表明AMPK调控TSC2的磷酸化(图11B)。利用AMPK抑制剂(化合物C)测定了内源AMPK是否参与TSC2磷酸化(Zhou等，J.Clin.Invest.1081167-1174(2001)。将HEK293细胞和10μM AMPK抑制剂一起温育可提高TSC2的迁移率，支持了内源AMPK在TSC2磷酸化中的作用(图11C)。
通过表达显性失活的AMPK研究了AMPK和2-DG-诱导的S6K脱磷酸化之间的功能关系。AMPK的激酶失活催化亚基αII(AMPK-DN)的剂量依赖性表达部分地阻断了2-DG处理对S6K的抑制(图11D)。此外，温育HEK 293细胞与AMPK抑制剂显著逆转了2-DG对S6K磷酸化的抑制效应(图11E)。相反，AMPK抑制剂的处理对Akt磷酸化没有影响。AMPK抑制剂也显著阻断葡萄糖剥夺所诱导的S6K脱磷酸化(图11F)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，认为这些数据表明AMPK激活应答能量饥饿而在TSC2磷酸化和S6K抑制中起着重要作用。
TSC2中的T1227和S1345是主要的AMPK磷酸化位点为阐述AMPK对TSC2调控的机制，对TSC2进行了体内标记和二维磷肽作图分析。2-DG刺激(25和40mM)增强了多种肽的磷酸化(比较图12A中小图a、b和c)。有意思的是，活性AMPKαI亚基的共表达也提高了为2-DG处理所刺激的相同肽的磷酸化(比较图12A中小图a和d)。小图e中的阴影点表示由2-DG或AMPK诱导的磷肽。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果清楚地证明了2-DG处理会刺激TSC2磷酸化，而AMPK在TSC2磷酸化中起着主要作用。
以前，寻找了TSC2序列中用于AMPK识别的共有位点(Hardie等，1998)，并且发现大鼠TSC2含8个推断的AMPK位点。所有推断的AMPK位点被单独突变，并对每个单独的突变体进行二维磷肽作图分析。这些数据显示除T1227A和S1345A外的所有单独突变体都具有与野生型TSC2相似的磷肽图谱。S1345A突变体影响大多数2-DG和AMPK可诱导的磷肽(图12A小图f中的斑点1、2、3、5、6、7、8)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果表明S1345很可能是体内AMPK磷酸化位点。此外，S1345的磷酸化影响其它残基的磷酸化，例如邻近于AMPK位点S1345的S1337和S1341(图12B)。
为证实S1345能否被AMPK直接在体外磷酸化，自大肠杆菌中表达并纯化了含S1345的TSC2片段(图12C)。该TSC2片段被免疫沉淀的AMPK而非激酶失活的AMPK突变体磷酸化(图12C，顶部小图)。将S1345突变为丙氨酸(S1345A)或天冬氨酸(S1345D)彻底消除了AMPK对TSC2的体外磷酸化，显示S1345是直接的AMPK磷酸化位点。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些数据说明S1337和S1341并非直接的AMPK磷酸化位点(图12C)，尽管这些残基的磷酸化被2-DG和AMPK所增强(图12A，B)。为了确认体外AMPK磷酸化位点也在体内在TSC2中被磷酸化，将体外AMPK磷酸化的TSC2的二维磷肽图谱与体内标记的TSC2进行了比较(图12D)。体外磷酸化的TSC2片段与体内磷酸化的TSC2-S1345A突变体的混合证明了斑点3和6是归因于直接AMPK磷酸化(图12D)。
观察到TSC2-T1227A突变体中斑点4消失，而斑点9减轻(图12E，比较小图a和b)。免疫沉淀的AMPK对纯化的TSC2-F2片段的体外磷酸化表明AMPK特异性地在T1227处使TSC2磷酸化(图12F)。二维磷肽作图分析证实T1227对应于2D图谱中的斑点4(图12E)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为AMPK在T1227处使TSC2磷酸化。
S1345的突变影响多个磷酸化位点，包括S1337和1341，尽管这些位点不是AMPK共有位点(图12A，B)。建立了TSC2-S1337/1341/1345A(TSC2-3A)三联突变体，并测试了由2-DG诱导的迁移率变化。2-DG依赖性迁移上移在该三联突变体中大量消除(图12G)，说明这些残基是被能量耗尽诱导的主要磷酸化位点。
AMPK磷酸化增强了TSC2功能利用TSC2磷酸化突变体评估了AMPK磷酸化的功能重要性。转染有TSC2-3A突变体的HEK 293细胞表现出该突变体不大能应答2DG处理而抑制S6K(图13A)。该结果与被AMPK磷酸化促进了TSC2抑制S6K能力的观念一致。也测试了TSC2-3A与TSC1相互作用的能力，并发现突变体TSC2能够正常地与TSC1形成复合体(图13B)。
为研究AMPK对TSC2的磷酸化是否在应答2-DG处理的S6K和4EBP1脱磷酸化中起作用，EEF8(TSC2-/-)成纤维细胞用表达野生型或者T1227A/S1345A突变体的逆转录病毒瞬时转染。TSC2的表达降低了S6K和4EBP1的基础磷酸化(图13C)。在载体转染的细胞中，2-DG处理几乎不导致S6K和4EBP1磷酸化降低。相反，在野生型TSC2表达细胞中，2-DG显著降低S6K和4EBP1的磷酸化(图13C)。表达TSC2T1227A/S1345A突变体的细胞与表达野生型的相比，对2-DG处理反应较小(图13C)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些数据证明TSC2中T1227和S1345的AMPK-依赖性磷酸化在针对2-DG处理的细胞应答中起着重要作用。
为进一步确立TSC2和AMPK磷酸化在应答细胞能量改变中的功能重要性，建立了来自上皮起源的TSC2-/-LEF细胞的稳定TSC2表达细胞系。TSC2的表达降低了S6K磷酸化，而TSC2-3A的表达对S6K具有弱得多的影响，尽管野生型和该3A突变体二者以相似的水平表达(图13D)。16小时的葡萄糖剥夺降低了野生型TSC2表达细胞中S6K的磷酸化，但在载体或TSC2-3A表达细胞中具有小得多的效应，尽管AMPK活化未受影响(图13E)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果证明TSC2是葡萄糖剥夺对S6K的失活所必需的。此外，TSC2磷酸化是针对能量限制的细胞应答所必需的。逆转录病毒感染的LEF细胞中TSC2的表达水平比HEK293细胞中TSC2的内源表达水平稍微低一些。因此，TSC2在用于此实验的稳定细胞中并未过表达。
TSC2保护细胞免于葡萄糖剥夺所诱导的细胞凋亡载体感染的LEF细胞在移至无葡萄糖条件之后72小时经历重大的细胞死亡(图14A和图16A)。相反，表达TSC2的LEF细胞几乎未表现出细胞死亡的增加。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施(制备和应用)本发明所必需的。尽管如此，本发明认为，这些数据表明TSC2能通过葡萄糖饥饿挽救细胞死亡。同样地，在EEF8(TSC2-/-)而非对照EEF4(TSC2+/+)细胞中观察到葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实现本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果令人信服地确立了TSC2在保护细胞免于能量饥饿诱导的细胞死亡中起着至关重要的作用。
为确定AMPK磷酸化在TSC2功能中的重要性，也研究了表达TSC2-3A的LEF细胞。TSC2-3A不能保护LEF细胞免于葡萄糖剥夺所诱导的细胞死亡(图14A和图16A)。尽管本发明并不局限于特定的机制，且对于机制的理解并非实施本发明所必需的，但这些数据表明，在能量饥饿条件下，未受控制的高mTOP活性对细胞死亡负有责任。通过DNA损伤诱导细胞凋亡的鬼臼亚乙苷能在表达载体及野生型TSC2的细胞中均造成细胞死亡，表明TSC2特异性地参与能量而非DNA损伤应答。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些数据证明AMPK对TSC2的磷酸化在保护细胞免于葡萄糖剥夺所诱导的细胞死亡中起着关键作用。
还进行实验以进一步研究葡萄糖剥夺所诱导的细胞凋亡。基于荧光的DNA片段化测定显示，葡萄糖剥夺在表达载体和TSC2-3A而非表达TSC2的LEF细胞中诱导细胞凋亡(图14B)。细胞凋亡标志的蛋白印迹揭示，caspase 3和PARP二者在葡萄糖剥夺所诱导的细胞死亡中都被切割，证明细胞确实在经历细胞凋亡(图14C)。在有些实施方案中，雷帕霉素处理抑制了TSC2-/-和TSC2-3A表达细胞中的caspase 3活化(图16B)。在形成本发明的过程中进行的其它实验还证实了能量剥夺在其它细胞系中的影响，包括TSC2-/-EEF8细胞(成纤维细胞)和TSC1-/-MEF细胞。已观察到葡萄糖剥夺诱导了TSC2-/-EEF8(图16C和16D)和TSC1-/-MEF细胞(图16E和16F)中的细胞凋亡。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果证明了TSC1和TSC2二者在细胞能量应答中起作用，并提供了调节细胞能量反应的靶物。
ATP耗尽和TSC2对细胞大小的调控已证明TSC2在果蝇细胞大小的控制中起着关键作用。观察到RNAi对TSC2的破坏会导致HEK293细胞大小的可再现的增大(图14D和图17A)。RNAi对细胞大小的微小作用可能是因为RNAi对TSC2的不完全消除。现发现2-DG处理能显著降低细胞大小(图14D和图17A)。RNAi对TSC2的破坏部分地阻断了2-DG诱导的细胞大小效应。TSC2和2-DG的细胞大小效应是细胞周期依赖性的，因为这些处理类似地影响G1和G2两类细胞。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些结果证明TSC2在2-DG诱导的细胞大小减小中起着重要作用。
也研究了葡萄糖饥饿对细胞大小的影响。在2.8mM葡萄糖(正常培养基中具有25mM葡萄糖)中培养72小时的HEK293细胞表现出细胞大小的显著下降(图14E和图17B)。用雷帕霉素处理也能降低细胞大小，如以前所报道的那样(Fingar等，Genes Dev.161472-1487(2002)。这些数据与TSC2介导能量限制信号而调控细胞大小相一致。
也观察到表达TSC2的LEF细胞比表达载体或TSC2-3A的细胞显著更小(图14A和图16A)。FACS分析研究证实，TSC2的表达能显著降低LEF TSC2-/-细胞的大小(图14F)。有意思的是，当与野生型TSC2相比时，TSC2-3A表现出弱化的降低LEF TSC2-/-细胞的细胞大小的能力。另进行了雷帕霉素处理作为对照。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施本发明所必需的。尽管如此，现认为这些观察结果与以前的生物学观察结果一致，并首次提供了令人信服的实验证据证明TSC2负调控哺乳动物细胞的细胞大小。此外，这些数据证明AMPK依赖性磷酸化为TSC2的生理学功能提供了至关重要的作用。
在其它的实施方案中，进行实验来证实TSC2的AMPK磷酸化在细胞大小控制中的生理学相关性，以及葡萄糖限制对细胞大小的影响。测试了不同浓度的葡萄糖，发现1mM葡萄糖是不会在TSC2-/-LEF细胞中诱导明显细胞凋亡的最低浓度。FACS分析证实，1mM葡萄糖不会降低TSC2-/-LEF细胞的细胞大小(图17C)。有趣地，1mM葡萄糖明显地增加了TSC2-/-细胞的细胞大小。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施(制备和使用)本发明所必需的。尽管如此，现认为这些数据表明TSC2在应答能量饥饿而进行细胞大小控制中起重要作用。也在1mM葡萄糖中培养了表达TSC2和TSC2-3A的细胞。野生型TSC2的表达恢复了正常的细胞能量应答，能量饥饿引起的显著的细胞大小减少(图17C)。相反，表达TSC2-3A的细胞没有恢复正常的细胞能量应答，且其行为与TSC2-/-细胞没有差别。能量饥饿造成表达TSC2-3A的细胞的显著细胞大小增加(图17C)。本发明并不局限于特定的机制。实际上，对于机制的理解并非实施(制备和使用)本发明所必需的。尽管如此，现认为这些数据表明AMPK依赖型磷酸化在TSC2的生理学功能中起重要作用，以应答细胞能量饥饿而调节细胞大小。关于TSC2-/-细胞的细胞大小增加的一个示例性的且非限制性的可能解释是，TSC2-/-细胞不能应答能量饥饿，并不管低能量水平而继续生长。但是，能量限制可能通过活化细胞周期检验点而阻止细胞周期进展。因此，在低葡萄糖条件下，TSC2-/-和表达TSC2-3A的细胞的细胞大小会增加，但是在没有葡萄糖的条件下会死亡。这些结果与观察到的TSC2在细胞生长和细胞能量水平之间的协调中起作用相一致。
特此将上述说明书中提及的所有出版物和专利并入作为参考。尽管本发明是结合具体的优选实施方案描述的，应当理解所主张的发明不应不适当地局限于此类具体的实施方案。实际上，实施本发明所述方式的各种修饰对相关技术领域熟练技术人员是显而易见的，旨在落入如下权利要求书的范围之内。
权利要求
1.检测在受试者中增强的S6激酶活性的方法，包括a)提供来自受试者的生物学样品；和b)检测所述生物学样品中增强的S6激酶活性的存在与否。
2.权利要求1的方法，其中所述检测增强的S6激酶活性的存在与否包括S6激酶磷酸酶测定法。
3.权利要求2的方法，其中所述S6激酶磷酸酶测定法包括使磷酸化特异性的抗体与S6激酶底物杂交。
4.权利要求1的方法，其中所述增强的S6激酶活性是选自TSC1蛋白和TSC2蛋白之中的失活蛋白的指征。
5.权利要求1的方法，其中还包括基于所述的检测增强的S6激酶活性的存在与否而向所述受试者提供诊断。
6.权利要求1的方法，其中还包括向所述受试者提供治疗结节性硬化症的步骤，其中所述的治疗包括向所述受试者施用S6激酶抑制剂。
7.权利要求6的方法，其中所述的S6激酶抑制剂包含雷帕霉素。
8.筛选化合物的方法，包括a)提供i)表达S6激酶的细胞；和ii)一种或多种测试化合物；以及b)筛选所述测试化合物抑制所述S6激酶的激酶活性的能力。
9.权利要求8的方法，其中所述筛选所述化合物抑制S6激酶活性的能力包括S6激酶磷酸酶测定法。
10.治疗疾病的方法，包括a)提供i)受试者，其中所述受试者患有疾病，该疾病包含缺陷型细胞，其中所述缺陷型细胞包含缺陷型TSC途径；ii)药剂；其中所述药剂能降低细胞ATP水平；以及b)向所述受试者施用所述药剂；其中所述药剂靶向所述缺陷型细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述药剂选自己糖激酶抑制剂、2-脱氧-葡萄糖、PKC抑制剂、楸毒素和5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸。
12.权利要求10的方法，其中所述药剂为线粒体解偶联剂FCCP。
13.权利要求10的方法，还包括共施用雷帕霉素。
14.权利要求10的方法，其中所述的疾病是结节性硬化症。
15.权利要求10的方法，其中所述的疾病是癌症。
16.权利要求10的方法，其中所述的疾病是心脏肥大。
17.权利要求16的方法，其中所述药剂是雷帕霉素。
18.权利要求10的方法，其中所述缺陷型TSC途径包括选自TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、S6K和4EBP-1中的所述TSC途径的缺陷型元件。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定TSC信号传导途径中的异常的组合物和方法。特别地，本发明涉及诊断和治疗诸如结节性硬化症之类病症的方法，所述病症是由TSC基因中的突变引起的。本发明还涉及用于治疗由TSC信号传导紊乱介导的癌症的方法和组合物。
文档编号G01N33/53GK1910291SQ200480040394
公开日2007年2月7日 申请日期2004年11月24日 优先权日2003年11月24日
发明者K-L·关 申请人:密歇根大学董事会