专利名称：一种融合多肽及其在制备烫伤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，是一种具有促进烫伤创面组织修复、抗炎、抗渗和抗休克作用的融合多肽及其在制备烫伤药物中的应用。
背景技术：
胸腺肽α1(thymosinα1，简称Tα1)是一种具有免疫功能的多肽，其相对分子量为3108，由28个氨基酸组成，具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，目前临床上作为一种免疫增强剂，用于病毒性乙肝、恶性肿瘤、免疫缺陷疾病的辅助治疗。另外，Tα1还具有刺激血管内皮细胞迁移，促进血管生成和伤口愈合等作用。(参见文献GoldsteinA L，Low TL，McAdoo M，et al.Thymosin alpha 1isolation and sequenceanalysis of an immunological active thymic peptide.Proc Natl Acad SciUSA，1977，74(2)725-729.)。
肥大细胞脱粒肽(Mast Cell Degranulating Peptide，简称MCD-肽)，是一种抗炎性较强的多肽，分子量2593，由22个氨基酸残基组成，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，MCD-肽能降低毛细血管通透性、阻止白细胞游走及抑制前列腺素E2的合成。临床上作为蜂毒中一种有效成分用于治疗风湿性关节炎，类风湿性关节炎，周围神经炎及神经痛等。(参见文献Buku A，Reibman J，Pistelli A，et al.Mast celldegranulating(MCD)peptide analogs with reduced ring structure.J ProtChem 1992，11275-280.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合多肽，它是由胸腺肽α1和肥大细胞脱粒肽融合形成的。该融合多肽具有促进烫伤创面组织修复、抗炎、抗渗和抗休克作用。
本发明提供一种融合多肽(M-Tα1)，具有胸腺肽α1(SEQ ID NO1)的氨基酸序列和肥大细胞脱粒肽(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，以及位于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2之间的连接肽序列。
上述连接肽序列是由4个Gly或Ser组成。
本发明的融合多肽(M-Tα1)，具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本发明的融合多肽(M-Tα1)的制备方法利用Fmoc保护氨基酸人工固相合成融合肽M-Tα1，将合成的融合肽M-Tα1粗品进行HPLC纯化，HPLC采用Waters600泵，Waters2487检测器及HS(V4.0)色谱数据工作站处理数据，收集活性峰成分，分装后冷冻干燥即得融合肽样品。
本发明的融合多肽(M-Tα1)经药效学动物实验证实确实有效促进烫伤创面愈合的作用。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述试剂与材料Piperidine 上海医药公司制剂公司产品 分析纯DMF 上海医药公司制剂公司产品 分析纯MeOH 上海医药公司制剂公司产品 分析纯CH2Cl2 上海医药公司制剂公司产品 分析纯Fmoc-Ile-Wang Resin 上海吉尔生化有限公司 100-200mesh 1％DVBDIC 上海吉尔生化有限公司 98％HOBt(无水) 上海吉尔生化有限公司 98％三氟乙酸(TFA)上海吉尔生化有限公司 95％实施例1融合肽M-Tα1的制备和分离纯化1.制备融合肽人工合成融合肽M-Tα1，合成方法是Fmoc保护氨基酸进行固相合成，缩和试剂为DIC、HOBt(无水)。反应溶剂为DMF，反应后的洗涤试剂为DMF、MeOH、CH2Cl2。合成过程投入0.6g的Fmoc-Ile-Wang Resin在接肽瓶内，用CH2Cl2膨胀树脂然后抽干，再将Fmoc-Pro和缩和试剂DIC、HOBt(无水)，并加DMF反应40min，抽干，洗涤3次，直到Kaiser test不显色。脱Fmoc(20％piperidine)，洗涤后接下一个氨基酸，以此类推。当接好最后一个氨基酸后脱Fmoc，抽干，取出树脂。倒入切割液(TFA 95％)切割2-3小时，洗涤并用氮气保护，最后抽干。液相色谱质谱联用仪(LCMS-2010A型)检测MS。
2.纯化融合肽将合成的融合肽M-Tα1粗品分别溶于10ml无菌Milli-Q水中，分2ml依次进样进行HPLC纯化。HPLC采用Waters600泵，Waters2487检测器及HS(V4.0)色谱数据工作站处理数据。吸附住采用SymmetryTM3.9×150mm的C18柱。流动相A是含0.1％三氟乙酸(TFA)的Milli-Q水，流动相B是含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈。
洗脱条件时间 流动相A流动相B0.01min 100％ 0％35.00min 0％100％用流动相A将体系平衡后，在35分钟内按上述条件以1ml/min的洗脱流速线性梯度洗脱，收集活性峰成分，将各个活性峰收集液混匀，每管2ml分装，冷冻干燥后即得融合肽样品。
实施例2融合肽M-Tα1的药效学动物实验选用体重约20g左右的昆明小鼠60只，雌雄各半，随机分为两组。乙醚轻度麻醉后，恒温恒压电烫仪80±2℃，10秒，在小鼠表皮建立直径为2.5cm的深II°烫伤模型。清创后从烫伤当日起分别于各组小鼠创面涂抹受试药物，第1组为阴性对照组，涂抹生理盐水100μl/只；第2组涂抹500g/只M-Tα1；每天1次，连续给药21天，记录伤口的反应情况。分别于用药后第10天和第14天，切取愈合创面组织，按常规将组织固定取材、包埋、制片、HE染色和免疫组化染色观察，同时对伊文思蓝检测烫伤皮肤组织标本血管通透性和酶联免疫吸咐试验(ELISA)检测血液标本TNF-α的含量变化。
创面组织病理观察结果1.皮肤病理HE染色变化结果用药后10天，HE染色切片可见用药组治疗的皮肤浅层结缔组织仅有少量肉芽增生改变，皮肤深层结缔组织内有血管增生，开始向正常的组织结构转变，深层细胞坏死也相对较少，炎症反应也较对照组轻；对照组创面真皮浅层有明显肉芽组织增生，深层仍有大片坏死细胞，炎症反应剧烈。
用药后14天，用药组创面已经愈合，主要组织形态恢复接近正常，深层细胞边界清楚，接近正常皮肤形态；而对照组真皮深层细胞结构不清楚，仍有部分变性坏死。
说明合成的融合肽M-Tα1对烫伤创面愈合具有促进作用。
2.免疫组化分析结果用药10天，免疫组化分析结果(1)M-Tα1治疗的创面成纤维细胞及细胞周基质表现出I型胶原强阳性结果，而对照组为阴性；(2)M-Tα1治疗的创面表皮基底层上皮细胞增殖细胞核抗原(PCNA)呈阳性，成纤维细胞和血管壁细胞也见阳性反应，而对照组的表皮基底层细胞表达呈阴性；(3)M-Tα1治疗的创面表皮细胞角蛋白(CK)呈阳性，而对照组创面表皮仅见少数基底层细胞呈弱阳性；(4)M-Tα1治疗的创面血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达呈阳性，而对照组未见有明显VEGF阳性表达。说明合成的融合肽M-Tα1能促进与烫伤创面组织修复相关的蛋白的表达，从而促进创面的修复。
3.伊文思蓝检测烫伤皮肤组织标本血管通透性分析结果用药后1、3、5、7、10、14、21天，所测结果绘制的图谱说明M-Tα1组所测OD值在组织恢复早期明显的大幅度下降，表明对烫伤组织血管通透性有较明显的抑制作用，而未用药组所测OD值则相对缓慢平滑的改变。在第14天M-Tα1组的烫伤小鼠创面已经愈合，其OD值一直延续到第21天都浮动地很小；未用药对照组的OD值在第14天到第21天之间仍持续下降，直到第21天才与M-Tα1组和M-T508组OD值趋于接近。
说明融合肽M-Tα1具备降低毛细血管通透性的作用，可以起到抗渗、抗休克的作用。
4.酶联免疫吸咐试验(ELISA)检测血液标本TNF-α的含量。
用药后1、3、5、7、10、14、21天，在所测的TNF-α浓度与测定时间绘成的图表中，可以看到融合肽M-Tα1组在组织恢复早期第1天到第3天TNF-α浓度有所上升，第5天TNF-α浓度有明显的下降，说明烫伤始期炎症反应强烈，但在M-Tα1作用下，逐渐开始下降，表明M-Tα1对烫伤组织炎症反应有抑制作用。而未用药组所测TNF-α浓度在烫伤早期持续上升，直到一个星期后才开始缓慢的下降。这在愈合时相上落后于用药组，与对照组自然愈合相比，M-Tα1在烫伤组织中起到抗炎的作用。这从一个侧面说明M-Tα1组确实能加快烫伤创面的愈合。
由上可见，在融合肽M-Tα1的作用下，组织修复的各种因素如表皮血管生长增强、胶原表达增强细胞核抗原表达提高，创面血管通透性降低，炎症反应降低，说明M-Tα1具有促进烫伤创面组织修复的作用，所以这种融合肽可以根据药学领域的常规方法，用于制备治疗烫伤的药物。
SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军第二军医大学<120>一种融合多肽及其在制备烫伤药物中的应用<130>说明书，权利要求书<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>PRT<213>人工序列<400>1Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu1 5 10 15Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn20 25<210>2<211>22<212>PRT<213>人工序列
<400>2Ile Lys Cys Asn Cys Lys Arg His Val Ile Lys Pro His Ile Cys Arg1 5 10 15Lys Ile Cys Gly Lys Asn20<210>3<211>54<212>PRT<213>人工序列<400>3Ile Lys Cys Asn Cys Lys Arg His Val Ile Lys Pro His Ile Cys Arg1 5 10 15Lys Ile Cys Gly Lys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Ala Val Asp20 25 30Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val35 40 45Val Glu Glu Ala Glu Asn50
权利要求
1.一种融合多肽，具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，以及位于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2之间的连接肽序列。
2.根据权利要求1所述的一种融合多肽，其特征在于其中的连接肽序列是由4个Gly或Ser组成。
3.根据权利要求1所述的一种融合多肽，其特征在于它具有SEQ IDNO3所示的氨基酸序列。
4.权利要求1、2或3所述的融合多肽在制备烫伤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药技术领域，胸腺肽α1是一种具有免疫功能的多肽，具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；肥大细胞脱粒肽是一种抗炎性较强的多肽，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明的目的在于提供一种融合多肽，它是由胸腺肽α1和肥大细胞脱粒肽融合形成的。该融合多肽具有促进烫伤创面组织修复、抗炎、抗渗和抗休克作用。本发明的融合多肽(M－Tα1)，具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，经药效学动物实验证实确实有效促进烫伤创面愈合的作用。
文档编号A61K38/16GK101054418SQ200710040858
公开日2007年10月17日 申请日期2007年5月18日 优先权日2007年5月18日
发明者郭葆玉, 方晨 申请人:中国人民解放军第二军医大学