专利名称：抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂的制备方法，具体是一种抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法。用于生物工程领域。
背景技术：
犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)性肠炎是犬最常见的传染病之一，其发病率与死亡率高达50％～100％，严重影响犬的健康。近年来，随着城乡肉用犬及宠物犬饲养数量的增加，该病的发病率呈上升趋势。目前对患病犬一般采用对症和支持治疗，治愈率很低，尤其是对2～3月龄幼犬效果更差。有报道用犬、马、兔、猪、驴等动物制作抗病毒血清，将提纯的犬细小病毒性肠炎免疫球蛋白注射液用于治疗患病犬。自1992年Yokoyama等发现卵黄抗体能治疗仔猪大肠杆菌性腹泻以来，卵黄抗体已广泛应用于消化道疾病的防治中。卵黄中的IgY耐消化道屏障，性质稳定。
经对现有技术的文献检索发现，王玉燕等在《中国预防兽医学报》(2003年第25卷第3期)发表的“抗CAD、CAV卵黄抗体的制备”一文，该研究用CDV、CAV分别免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，用海藻酸钠-硫酸铵法提取卵黄抗体(IgY)，并对提取的IgY采用了SDS-PAGE和低压层析检测纯度，用间接ELISA测定提取的IgY的活性。但是该方法需对卵黄抗体进行多步提纯后使用，制备工艺繁琐，成本高且IgY的活性损失较大。
发明内容
本发明针对现有技术的不足和缺陷，自制疫苗，在强化免疫的基础上，提供一种抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，使其建立抗犬细小病毒抗体效价评定依据，将具有生物活性的卵黄抗体制备成无副作用的能直接饮用的口服生物制剂或利于保存的粉剂，该制剂也可作为宠物保健品或生物制药的原料。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤步骤一，采集诊断为细小病毒感染的病死犬的肠道及内容物按重量比1∶1加生理盐水研磨，离心去除沉渣，上清液20000rpm离心60分钟去除微小颗粒；步骤二，按去除微小颗粒后的上清液总体积的10％加入氯仿，剧烈振荡，离心去除脂溶性物质；步骤三，取去除脂溶性物质后的上清液，按其总体积的10％加入用体积百分比浓度为2.5％戊二醛醛化、洗涤后的猪红细胞，摇匀4℃放置2小时进行病毒吸附，离心沉淀猪红细胞，用体积比为4％的盐水配成体积比10％的红细胞悬液，37℃放置2小时进行病毒释放，离心去除猪红细胞，取病毒释放液，释放液中的病毒HA效价达1∶4096有效；步骤四，取上述病毒释放液经甲醛灭活后加入褐藻多糖，使每毫升液体含4毫克，制备成油乳剂疫苗，即犬细小病毒疫苗；将制备的犬细小病毒疫苗免疫20周龄以上经产母鸡后，用血凝抑制试验(HI)进行效价测定，当卵黄中HI效价达1∶256以上时收集免疫卵，效价低于1∶128时进行第三次免疫；步骤五，收获卵黄用无菌蒸馏水对倍稀释，用乳酸液调pH4.4进行酸处理去除杂蛋白、-40℃冻融处理2次去除脂质，抽滤液经35％饱和硫酸铵盐析、除盐后即可获得IgY，稀释封装在安培瓶中，放65℃水浴箱处理20分钟，经口服安全性检验、微生物检验合格后即成安全的口服生物制剂，其IgY的得率达95％以上，活性不受任何影响，5毫升卵黄混合液中提取后可获得IgY26毫克以上，一个免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。本发明制得的制剂喷雾干燥成粉剂后IgY的活性不变。
本发明的基本原理是利用家禽作为生物反应器生产各类生物活性物质。当供试鸡免疫后即产生特异性抗体，血液中的抗体逐渐进入卵黄并蓄积。该抗体稳定，经口服后能抵抗胃酸的破坏，活性物质封闭胃肠中的特异性病原入侵受体或直接中和特异性病原体或毒素，从而达到预防和治疗的目的。
与现有技术相比，本发明的有益效益是感染细小病毒的病犬，可直接口服生物制剂替代其他生物制剂的注射治疗，幼犬临床治愈率高达95％以上，也可添加于宠物保健品中口服，可预防幼犬感染细小病毒。该方法成本低，见效快，一个免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1犬细小病毒野毒采集取诊断为细小病毒感染的病死犬的肠道及内容物按重量比1∶1加生理盐水研磨，离心去除沉渣，上清液20000rpm高速离心60分钟去除微小颗粒。
病毒初提按上清液总量的10％加入氯仿，剧烈振荡，离心去除脂溶性物质。
病毒吸附取上清液按总量的10％加入用体积百分比浓度为2.5％的戊二醛醛化的洗涤后的猪红细胞，摇匀4℃放置2小时，离心沉淀猪红细胞。
病毒释放用4％浓度的高渗盐水将沉淀的猪红细胞配成体积比10％的悬液，37℃2小时，离心去除猪红细胞。
HA效价测定释放液中的病毒效价用HA试验进行检测，达1∶4096有效。
疫苗水相制备取上述病毒释放液经甲醛灭活后加入褐藻多糖，使每毫升释放病毒液体含4毫克褐藻多糖，并加入无菌的吐温80。
疫苗油相制备在10号白油中加入硬脂酸铝和司本80，灭菌后备用。
疫苗制备按水相与油相之比1∶1在高速捣碎机中进行乳化，制备成油乳剂疫苗。
免疫选择20周龄以上经产母鸡，用上述制备的油乳剂疫苗(即犬细小病毒油乳剂苗)进行免疫，第一次肌注0.5ml，10天后第二次免疫，肌注1ml，14天后用血凝抑制试验(HI)进行效价测定，当卵黄中HI效价达1∶256以上时收集免疫卵。
IgY提取收获卵黄用无菌蒸馏水对倍稀释，用乳酸液调pH4.4进行酸处理去除杂蛋白、-40℃冻融处理2次去除脂质，抽滤液备用。
IgY纯化经35％饱和硫酸铵盐析、除盐后即可获得较纯的IgY。
口服制剂制备用无菌水将提纯的抗细小病毒IgY稀释成每毫升加入褐藻多糖后的释放病毒液体含2毫克IgY，封装在安培瓶中，放65℃水浴箱处理20分钟，经口服安全性检验、微生物检验合格后即成安全的口服生物制剂。
实施例2犬细小病毒野毒采集、病毒初提、病毒吸附释放试验提纯、HA价检测、疫苗制备同实施例1。第一次免疫，免疫剂量每头份0.5ml。间隔10天进行第二次免疫，免疫剂量为1ml。免疫14天后，用血凝抑制试验对卵黄进行效价测定，当效价低于1∶128时，进行第三次免疫，免疫剂量为1ml，14天后收集免疫卵，其后抗细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法同实施例1。
用上述方法制备疫苗、免疫、IgY提取与纯化，IgY的得率达95％以上，活性不受任何影响，5毫升卵黄混合液中提取后可获得IgY26毫克以上，一个免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。该制剂喷雾干燥成粉剂后IgY的活性不变。
细小病毒感染犬，每次按每公斤体重0.5ml，口服生物制剂不少于1ml，连用3天，能有效治愈病犬，细小病毒病幼犬的治愈率达95％以上，或制备成宠物保健品，或用于治疗犬细小病毒病的药物中。
权利要求
1.一种抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一，采集诊断为细小病毒感染的病死犬的肠道及内容物按重量比1∶1加生理盐水研磨，离心去除沉渣，上清液离心去除微小颗粒；步骤二，在去除微小颗粒后的上清液中加入氯仿，剧烈振荡，离心去除脂溶性物质；步骤三，取去除脂溶性物质后的上清液，加入醛化、洗涤后的猪红细胞，摇匀放置进行病毒吸附，离心沉淀猪红细胞，加入高渗盐水后放置进行病毒释放，离心去除猪红细胞，取病毒释放液，测HA效价，达1∶4096有效；步骤四，取上述病毒释放液经甲醛灭活后加入褐藻多糖，制备成油乳剂犬细小病毒疫苗，将制备的犬细小病毒疫苗免疫20周龄以上经产母鸡，用血凝抑制试验进行效价测定，当卵黄中HI效价达1∶256以上时收集免疫卵，效价低于1∶128时进行第三次免疫；步骤五，收获卵黄用无菌蒸馏水对倍稀释，用乳酸液进行酸处理去除杂蛋白、冻融去脂，抽滤液经硫酸铵盐析提取IgY，除盐后稀释封装安培瓶中，放水浴箱处理，经口服安全性检验及微生物检验合格后即成口服生物制剂。
2.根据权利要求1所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤一中，所述上清液离心去除微小颗粒，是指上清液在20000rpm离心60分钟去除微小颗粒。
3.根据权利要求1所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤二中，所述加入氯仿，是指按去除微小颗粒后的上清液总体积的10％加入氯仿。
4.根据权利要求1所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤三中，所述醛化，是指用体积百分比为2.5％的戊二醛对猪红细胞进行醛化；所述摇匀放置进行病毒吸附，是指摇匀4℃放置2小时进行病毒吸附。
5.根据权利要求1或4所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤三中，所述加入高渗盐水后放置，是指加入体积比为4％的盐水配成体积比10％的红细胞悬液，在37℃放置2小时。
6.根据权利要求1所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤四中，所述褐藻多糖，其使用量为每毫升释放病毒液体含4毫克褐藻多糖。
7.根据权利要求1所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤五中，所述用乳酸液进行酸处理去除杂蛋白，是指用乳酸液调pH4.4进行酸处理去除杂蛋白。
8.根据权利要求1或7所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤五中，所述冻融去脂，是指-40℃冻融处理2次去除脂质。
9.根据权利要求1或7所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤五中，所述经硫酸铵盐析提取IgY，采用的硫酸铵饱和度为35％；所述稀释，是指用无菌水稀释成每毫升加入褐藻多糖后的释放病毒液体含2毫克IgY。
10.根据权利要求1或7所述的抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，其特征是，步骤五中，所述放水浴箱处理，是指放65℃水浴箱处理20分钟。
全文摘要
一种抗犬细小病毒卵黄抗体生物制剂的制备方法，采集诊断为细小病毒感染的病死犬病料，离心去除沉渣，上清液离心，取上清液加入氯仿，剧烈振荡，离心取上清液加入醛化洗涤后的猪红细胞，摇匀放置，离心取沉淀，加入盐水后放置，离心取病毒释放液测HA效价，达14096有效；取上述病毒释放液经甲醛灭活后加入褐藻多糖制备成油乳剂犬细小病毒疫苗，将该疫苗免疫经产母鸡后用血凝抑制试验测定免疫卵HI效价，达标后收获卵黄用无菌蒸馏水对倍稀释，用乳酸液进行酸处理去除杂蛋白、冻融去脂，抽滤液进行盐析，除盐后调整IgY的浓度分装，放水浴箱处理，即成口服生物制剂，其IgY的得率达95％以上，活性不受任何影响，一个免疫卵一般可得IgY 70－100mg。
文档编号A61P31/00GK101062413SQ20071004047
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者刘永德, 唐峰, 叶陈梁, 汪毅 申请人:上海交通大学