专利名称：肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种肝炎疫苗的口服壳聚糖纳米粒制剂。
背景技术：
病毒性肝炎是一种常见病、多发病，分布于世界各地，由于我国卫生条件和人群免疫状况地区差异明显，潜在的传染源数量巨大，难以防治和危害广，每年的经济损失极大。对于病毒性肝炎的治愈率不理想，虽有少数药物具有一定疗效，但副作用大、费用高。对病毒性肝炎以预防为主，肝炎疫苗是目前普遍使用的预防手段，但是疫苗接种通常采用注射方式给药，存在制作费用高，耐受性差和需专业技术人员给药等问题，因此开发一种使用方便的疫苗口服新制剂，对于肝炎的预防具有十分重要的意义。
由高分子材料制备的纳米粒载体对所包载的蛋白类药物具有保护作用，能抵御胃肠道酶、pH等因素的影响，可以实现口服给药。壳聚糖是自然界来源第二大丰富的亲水性多糖，其良好的生物相容性、无毒和可生物降解特性，赋予其广阔的医药应用前景。但由于无法实现对纳米粒的定位摄取作用，容易造成生物利用度的降低。
目前未见肝炎疫苗壳聚糖纳米粒口服制剂的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够实现疫苗的有效定位、提高疫苗的生物利用度、给药途径为口服的肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒制剂，及其制备方法。
本发明提供的一种肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂，是以壳聚糖作为载体，包载肝炎疫苗制得的纳米粒，该纳米粒表面经氨基活化后以凝集素修饰，纳米粒粒径为200nm～1.5μm，其中肝炎疫苗的浓度是0.1μg/ml～1g/ml。
上述纳米粒粒径优选为200nm～500nm。
上述凝集素是荆豆凝集素(Ulex europaeus lectin)、麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin)或番茄凝集素(Tomato lectin)。
上述肝炎疫苗是乙型肝炎疫苗。
本发明还提供了上述肝炎疫苗壳聚糖纳米粒口服制剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤I、制备壳聚糖溶液将一定量的壳聚糖溶解于烯醋酸中，得到壳聚糖溶液，浓度为0.1％～10％(w/v)；II、制备多聚磷酸钠溶液以蒸馏水溶解多聚磷酸钠，配制交联溶剂(0.1％～5％，w/v)；III、制备载药壳聚糖纳米粒取适量肝炎疫苗溶液(肝炎疫苗溶解于磷酸盐缓冲液中)分散于II中制得的多聚磷酸钠液或分散于I中配制的壳聚糖溶液中，肝炎疫苗浓度为0.1μg/ml～1g/ml；将II溶液，缓慢滴加于以600转/分钟持续搅拌下的含肝炎疫苗的壳聚糖溶液中，或将含肝炎疫苗的多聚磷酸钠溶液滴加入I液中，反应10分钟，即得肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒；IV、高压匀化将III中所得的肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒放入高压乳匀机，在100～1000Bar压力下，进行匀化，得到粒径分布范围较窄的肝炎疫苗壳聚糖纳米粒；V、壳聚糖表面氨基的活化向IV中制得纳米粒胶体液中加入25％(v/v)的戊二醛，混合振摇6小时，使壳聚糖纳米粒的表面氨基活化，高速离心后弃去上清液中多余的戊二醛；VI、凝集素溶液的制备取凝集素适量，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，浓度为0.5μg/ml～2g/ml；VII、将VI中的凝集素溶液加入V中的壳聚糖纳米粒中，漩涡混匀，在室温下孵育24小时，高速离心后弃去上清液中未结合的凝集素，即得凝集素修饰的壳聚糖纳米粒。
经NicompTM 380 ZLS Zeta电位及粒度测定仪测定，上述的纳米粒粒径在200nm～1.5μm之间。
本发明制备的肝炎疫苗纳米粒制剂，将乙肝疫苗包载于壳聚糖载体材料中，由壳聚糖这一高分子材料制备的纳米粒载体对所包载的蛋白类药物具有保护作用，能抵御胃肠道酶、pH等因素的影响，可以实现口服给药。本发明还以具有肠道特异性黏附作用的凝集素同壳聚糖纳米粒表面的活性氨基进行共价结合，外源性凝集素能同肠道微褶细胞上的岩藻糖发生特异的结合，以其锚定的材料制备成纳米粒，可穿越肠道黏膜和上皮细胞等形态学屏障，将包载疫苗运送至肠微褶细胞。用本发明方法制得的凝集素修饰的壳聚糖纳米粒，外观形态较为圆整，粒度分布较窄。该方法具有快速简便、成本低、可操作性强等特点，优于其他方法。
另外，可采用本领域公知技术将上述纳米粒制剂进一步制成片剂或胶囊剂，供口服接种使用。乙肝疫苗在壳聚糖纳米粒的保护和运载下，其活性可得到保持，壳聚糖纳米粒上键合的凝集素可将乙肝疫苗进一步定位转运至肠道黏膜内，高效触发免疫应答反应，实现口服接种，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
现结合实施例，对本发明作进一步的描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1材料与试剂壳聚糖上海如吉生物科技发展有限公司脱乙酰度为90％，平均分子为40-80kDa；三聚磷酸钠国药集团化学试剂有限公司批号F20050127 化学纯乙肝疫苗原液 北京天坛生物制品股份有限公司冰醋酸国药集团化学试剂有限公司 分析纯25％戊二醛 上海医药(集团)上海化学试剂公司 0.25g/10ml凝集素 Sigma试剂公司称取壳聚糖200mg，溶于100mL 0.5％的烯醋酸中，得到0.2％的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制0.2％的多聚磷酸钠溶液，并向其中加入乙肝疫苗原液，乙肝疫苗的浓度为200μg/ml。在以600转/分钟速度持续搅拌下，将含乙肝疫苗的多聚磷酸钠溶液缓慢滴加于壳聚糖溶液中，反应10分钟，即得乙肝疫苗的壳聚糖纳米粒。将上述纳米粒混悬液经高压乳匀机，在660Bar压力下进行1个循环的匀化，得到粒径分布范围较窄的乙肝疫苗壳聚糖纳米粒。
向高压匀化后的纳米粒胶体液(含纳米粒20mg)中加入25％(v/v)的戊二醛1mL，振摇混合6小时，活化壳聚糖纳米粒表面的氨基，然后高速离心(10000rpm，30分钟)并弃去上清液中多余的戊二醛(防止其交联乙肝疫苗和凝集素)。取荆豆凝集素(Ulex europaeus lectin)200μg，溶于1000μL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，将该凝集素溶液加入到匀化后的壳聚糖纳米粒中，漩涡混匀，于室温条件下孵育24小时，高速离心(10000rpm，30分钟)后弃去上清液中未结合的凝集素，收集下层离心胶体液，即得凝集素修饰的壳聚糖纳米粒。经NicompTM 380 ZLS Zeta电位及粒度测定仪测定，粒径为293.2nm。
实施例2壳聚糖用量为300mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.5％，戊二醛用量为1.2mL。其余同实施例1，粒径为496.3nm。
实施例3壳聚糖用量为100mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.2％，戊二醛用量为0.5mL，其余同实施例1，粒径为330.5nm。
实施例4壳聚糖用量为100mg，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.1％，戊二醛用量为0.5mL，所用凝集素为200μg麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin)，其余同实施例1，粒径为276.8nm。
实施例5制备方法同实施例1，多聚磷酸钠溶液的浓度为0.1％，戊二醛用量为0.5mL，所用凝集素为200μg番茄凝集素(Tomato lectin)。乙肝疫苗原液加入壳聚糖溶液中，然后以多聚磷酸钠溶液进行交联，其余同实施例1，粒径为201.4nm。
权利要求
1.一种肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂，其特征在于该制剂是以壳聚糖作为载体，包载肝炎疫苗制得的纳米粒，该纳米粒表面经氨基活化后以凝集素修饰，纳米粒粒径为200nm～1.5μm，其中肝炎疫苗的浓度是0.1μg/ml～1g/ml。
2.根据权利要求1所述的一种肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂，其特征在于纳米粒粒径为200nm～500nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂，其特征在于其中的凝集素是荆豆凝集素、麦胚凝集素或番茄凝集素。
4.根据权利要求1或2所述的一种肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂，其特征在于其中的肝炎疫苗是乙型肝炎疫苗。
5.一种如权利要求1所述的肝炎疫苗壳聚糖纳米粒口服制剂的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤I、制备壳聚糖溶液将一定量的壳聚糖溶解于烯醋酸中，得到壳聚糖溶液，浓度为0.1％～10％w/v；II、制备多聚磷酸钠溶液以蒸馏水溶解多聚磷酸钠，配制交联溶剂，浓度为0.1％～5％w/v；III、制备载药壳聚糖纳米粒取适量肝炎疫苗溶液分散于II中制得的多聚磷酸钠液或I中配制的壳聚糖溶液中，肝炎疫苗浓度为0.1μg/ml～1g/ml；将II溶液，缓慢滴加于以600转/分钟持续搅拌下的含肝炎疫苗的壳聚糖溶液中，或将含肝炎疫苗的多聚磷酸钠溶液滴加入I液中，反应10分钟，即得肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒；IV、高压匀化将III中所得的肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒放入高压乳匀机，在100～1000Bar压力下，进行匀化，得到粒径分布范围较窄的肝炎疫苗壳聚糖纳米粒；V、壳聚糖表面氨基的活化向IV中制得纳米粒胶体液中加入25％v/v的戊二醛，混合振摇6小时，使壳聚糖纳米粒的表面氨基活化，高速离心后弃去上清液中多余的戊二醛；VI、凝集素溶液的制备取凝集素适量，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，浓度为0.5μg/ml～2g/ml；VII、将VI中的凝集素溶液加入V中的壳聚糖纳米粒中，漩涡混匀，在室温下孵育24小时，高速离心后弃去上清液中未结合的凝集素，即得凝集素修饰的壳聚糖纳米粒。
6.根据权利要求5所述的一种肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂的制备方法，其特征在于其中的凝集素是荆豆凝集素、麦胚凝集素或番茄凝集素。
7.根据权利要求5或6所述的一种肝炎疫苗的壳聚糖纳米粒口服制剂的制备方法，其特征在于其中的肝炎疫苗是乙型肝炎疫苗。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，目前肝炎疫苗常用于肝炎的预防接种，现有的剂型为注射剂，存在制作费用高、耐受性差和需专业技术人员给药等问题。本发明以肝炎疫苗为模型、壳聚糖为载体材料，采用离子交联－高压匀化工艺，将其制成壳聚糖纳米粒制剂，并进一步用凝集素对壳聚糖纳米粒进行表面修饰，制得适合口服接种的纳米粒制剂。本发明所涉及的疫苗纳米粒制剂，制备过程操作性强、成本低，可为乙型肝炎的预防提供一种新的口服接种途径。
文档编号A61K47/36GK101036785SQ20071004026
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者胡晋红, 费轶博, 李凤前, 王晶, 刘继勇 申请人:中国人民解放军第二军医大学