专利名称：凝集素竞争法肝癌甲胎蛋白异质体afp－l3定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明提供了一种结合位点在甲胎蛋白异质体糖链附近，该位点能被扁豆凝集素竞争结合掩蔽掉的甲胎蛋白单抗，并提供了采用该单克隆抗体研制出的用于检测甲胎蛋白异质AFP-L3含量的试剂盒、其制备方法及其应用。利用该试剂盒可以快速、准确地对肝癌的发生情况进行早期诊断。
背景技术：
在世界范围内，肝细胞癌是第四种最常见的癌症，第三种最常见的癌症相关死亡原因。危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。
AFP-L3是唯一的由得病患者肝脏中癌细胞生成的蛋白。在加拿大和美国的一项多中心、前瞻性、双盲、长期临床试验中，对该检测方法进行了研究。结果显示AFP-L3％升高(15％以上)的患者，在接下来的21个月中，发生肝细胞癌的危险增加7倍之多。根据已有的肝细胞癌肿瘤学实践指南，这些患者肝细胞癌发生率极端增高。
甲胎蛋白(alpha2fetoprotein，AFP)是一种糖蛋白，在哺乳动物胚胎期由肝脏实质细胞和卵黄囊细胞合成，来源于内胚层的胃肠道粘膜细胞也可少量合成。正常情况下，AFP主要存在于胎儿循环中，随着胎儿发育成熟，AFP合成逐渐减少。出生时脐血中AFP浓度可达10～100mg/L，出生后一年降至正常成人水平。如果新生儿AFP明显升高提示新生儿肝炎、先天性胆道闭锁或有能分泌AFP的胚胎性恶性肿瘤。
早在1970年，就有学者发现肝细胞癌患者血清AFP淀粉凝胶电泳时常出现不同的迁移率，而新生儿、胎儿的AFP电泳迁移率相同。当时认为系AFP所含的唾液酸含量不同所致，并提出AFP异质体(AFP Variants)的概念。随后的研究表明，AFP的糖链结构存在不同程度的变异，而所谓的异质性主要是因为AFP所含碳水化合物不同所致。AFP异质体形成的确切机制还不十分清楚，其过程可能是这样的增生的肝细胞及肝癌细胞于G1期和S期合成AFP，并将其分布于核周、内质网腔及高尔基分泌小囊中，位于粗面内质网及高尔基体中的AFP在糖基化转移酶参与下受到不同的糖基化修饰后分泌到循环中。由于糖基化的不同，导致了AFP异质性的差异。另一可能的原因是糖基化转移酶异常造成糖基化后AFP构象的改变。AFP的糖链结构能与多种凝集素相作用，与不同凝集素结合的AFP分子结构蛋白部分基本相同，但糖链部分有所差异。不同的糖链决定其与凝集素的亲和力。根据亲和性的不同，可将AFP异质体分为不同类型，如扁豆凝集素(LCA)亲和型、豌豆凝集素不亲和型，刀豆凝集素(Con2A)亲和型和Con2A不亲和型。另有一种分类方法是将电泳获得的区带从阳极开始以1、2、3编号，结合凝集素进行命名。如使用LCA则命名为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3；使用Con2A则命名为AFP2C1、AFP2C2、AFP2C3。
AFP异质体许多糖链的结构尚未完全明了。与LCA相结合的基础是AFP糖链岩藻糖基化(LCA与岩藻糖有较强的亲和力)，由于胚胎期AFP几乎无岩藻糖成分，因而可以认为这种分子糖链的异常是糖基化异常的反映。AFP-L3与LCA的结合位点是门冬酰胺连接的岩藻糖化的N2乙酰葡萄糖胺。
AFP异质体检测的临床意义1)胚胎异常发育及胎儿先天性疾患正常妊娠期母体血清中AFP与胚胎中AFP处于平衡状态，一旦胎儿畸形或胎盘屏障发生异常，可导致胎儿血清渗入羊水中或羊水渗入母体血清，造成母体羊水或血清AFP急剧升高。但仅仅测定AFP总量有一定的局限性。实验表明妊娠早期羊水中的AFP12％～53％来自卵黄囊(Con2A非结合型)，而胎儿血清中的AFP主要来自胚肝(Con2A结合型)。观察两者的比值，若Con2A非结合型/Con2A结合型比值下降则反映胎儿血清中的AFP漏入羊水，胎儿有先天异常的可能，如神经管缺损、无脑儿或脊柱裂等。儿童肝母细胞瘤、胆道闭锁、性腺肿瘤、恶性畸胎瘤等可有AFP和/或AFP异质体的阳性。
2)鉴别肝癌与良性肝病原发性肝癌患者AFP常升高，但许多良性肝脏疾病也可有AFP升高，单凭AFP结果有时很难区分良、恶性病变。此时AFP异质体检测就具有良好的临床意义，尤其对于AFP在30～400ng/ml之间者具有较好的价值。Yozhiaki对361例肝硬化进行了前瞻性研究，在53例AFP在30ug/L以上的患者中，2年以后21例发展为肝癌，确诊肝癌时39％的患者AFP在400ug/L以下。对比研究开始时肝细胞肝癌(HCC)组与非HCC组AFP测定值，未发现差异有显著性，研究发现病变时AFP异质体的类型有所不同，对HCC诊断LCA阳性率87.12％假阳性率21.5％，ConA阳性率89.17％假阳性率17.15％。目前的研究结果把AFP-L3含量大于15％作为肝癌的阳性指标。
3)肝癌术后的监测肝癌切除术后，血清AFP含量随之下降，其下降速度取决于体内残留AFP量及半衰期，一般2月内转阴，转阴时AFP异质体随之消失。如果AFP明显下降但不转阴，异质体变化不明显，则提示手术不彻底，可能还存在边缘残留、血管癌栓、卫星结节或转移等。如果异质体下降至25％以下，AFP和异质体浓度相对恒定，则可能是患者有肝炎或肝硬化所致。
AFP-L3含量的判断目前的研究标明AFP-L3的含量大于15％可以作为原发性肝癌阳性的指标。
但是长期以来，国内只有少数临床实验室能够测定AFP异质体，只有少数城市能满足临床测定AFP异质体的要求。迄今为止的异质体测定方法(目前主要方法为电泳分离亲合吸附法)，对于技术的要求较高、操作繁琐、试剂昂贵。
发明内容
本发明提供了诊断试剂盒及其制备方法，通过该试剂盒可以准确地诊断出早期原发性肝癌。由于筛选出了结合位点位于AFP-L3糖链附近、且该位点很容易被凝集素所结合掉的单抗，采用凝集素液相竞争方法，能真实地反应出血清中甲胎蛋白异质体的含量水平，显示出极高的灵敏度，方法快速简便。
一方面，本发明提供了一种单克隆抗体，该单抗结合位点在甲胎异质体的糖链附近，当与该糖链特异结合的凝集素结合上去之后，形成位阻，特异的影响该单抗的结合。因此通过对比加入凝集素进行封闭竞争前后的变化，就可以计算出该血清中甲胎蛋白所含异质体的含量。所述的单克隆抗体是由下述方法筛选制备出的采用肝癌病人腹水中提取的甲胎蛋白进行包被后，加入凝集素和对照缓冲液，再加入要筛选的单克隆株，最后采用标记HRP的抗鼠IgG进行反应，然后显色，筛选的标准是在加入凝集素结合后，对比对照缓冲液该孔显色OD值显著下降(OD值变化≥50％)的克隆株。筛选该杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
另一方面，本发明还提供了上述的单克隆抗体在制备用于检测甲胎蛋白异质体含量的试剂盒中的应用。
上述的本发明的试剂盒还可以含有甲胎蛋白标准品、凝集素溶液、空白对照液、酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP-L3单克隆抗体、辅助试剂，其中，所述的单克隆抗体是标记于HRP上的。
另一方面，本发明还提供了上述试剂盒的制作方法，其包括阳性对照、阴性对照的制备、单克隆抗体包被板的制作、酶标单抗体的制备、以及辅助试剂的配制。
本发明试剂盒中的阳性、阴性对照是从人血清中制备的。一种制备步骤包括收集肝癌病人腹水和健康正常人血清，过滤除菌、分装，即获得阳性、阴性对照。
本发明试剂盒中的单克隆抗体包被板是用普通高滴度的甲胎蛋白单克隆抗体(这种抗体可以商品化获得)包被酶标板而制作的。酶标板可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、12X4可拆条板。
一种单克隆抗体包被酶标板的制作步骤如下包被将上述单克隆抗体用0.05M碳酸缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。
酶标记单抗本发明试剂盒中的酶标单克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记AFP-L3单克隆抗体而制备的。一种酶标单克隆抗体的制备步骤如下a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml。
b)单克隆抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜。
c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗AFP-L3单克隆抗体。
本发明试剂盒中的辅助试剂包括凝集素溶液、对照缓冲液、酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，一种配制辅助试剂的方法如下a)凝集素溶液20mmol/LPBS配制的扁豆凝集素溶液，浓度为5ug/ml，对照缓冲液为20mmol/L PBS.
b)底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；
c)显色液B四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；d)反应终止液2mol/L硫酸；e)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
另一方面，本发明还提供了检测甲胎异质体的含量的方法，其中包括使上述试剂盒与血清或血浆样品相接触的步骤。
更具体地，本发明的检测方法包括下述步骤a)抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别双孔加入50μl阳性、阴性对照血清，或待测血清样品，使用记号笔标记成1、2系列。37℃水浴保温30分钟。洗板操作4次。
b)1系列加样孔中加入含有凝集素的溶液，2系列加样孔中加入不含有凝聚素的对照溶液。37℃水浴保温30分钟。取出扳，甩掉孔中液体。
c)将HRP-单克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。
d)显色反应每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
e)比色以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
f)制作标准曲线以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.95时本次测定有效；g)计算待测血清样品浓度根据待测样品的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的AFP和AFP-L3浓度。
阳性质控血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，本次测定有效。
阴性对照血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，本次测定有效。
待检测血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，说明其中甲胎蛋白异质体含量较高，为肝癌阳性。
本发明提供了一种甲胎蛋白异质体定量酶联免疫测定试剂盒，它含有甲胎蛋白标准品、酶标板、辣根过氧化物酶标记单克隆抗体、辅助试剂，其特征在于，所述的单克隆抗体是能结合于甲胎蛋白异质体糖链附近，使用凝集素液相竞争、筛选杂交瘤克隆而获得的，且标记在所述的酶标板上。所述的单克隆抗体是由下述方法制备出的采用肝癌病人腹水中提取的甲胎蛋白进行包被后，加入凝集素和对照缓冲液，再加入要筛选的单克隆株，最后采用标记HRP的抗鼠IgG进行反应，然后显色，筛选的标准是在加入凝集素结合后，对比对照缓冲液该孔显色OD值显著下降(OD值变化≥50％)的抗血清。筛选该杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
另一方面，本发明还提供了上述试剂盒的制作方法，其包括单克隆抗体包被板的制作、酶标单克隆抗体的制备、以及辅助试剂的配制。
本发明试剂盒中的甲胎蛋白标准品是商品化购买得到。
与已有的甲胎蛋白异质体亲和吸附法检测中的应用试剂相比较，本发明试剂盒具有以下优点本发明试剂盒以获得的针对甲胎蛋白异质体糖链蛋白附近位点、而且这个位点会由于凝集素的结合而被位阻掩蔽的单克隆抗体作为AFP-L3检测的手段，并应用酶免定量方法克服了以往检测方法操作步骤烦琐、耗时长、需要配套设备多的缺点。
试剂盒配套用的标准品，能够直接定量计算出血样标本中所含的甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体的含量，方法应用简便。
图1显示了用本发明的AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒对乙肝慢性大三阳肝炎标本和原发性肝癌标本中AFP-L3不同含量进行检测的结果。
具体实施例方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒的制作一种AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒(96人份)，其组成包括AFP-L3阴性、阳性对照各1瓶；AFP单克隆抗体包被板(96孔)1块；辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP-L3单克隆抗体1瓶，6ml/瓶；扁豆凝集素(LCA)溶液1瓶空白缓冲液1瓶AFP标准品1瓶底物溶液A、显色液B各1瓶，各5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；清洗缓冲液(20X浓缩)1瓶，30ml/瓶。
具体操作如下1.制备AFP-阴性、阳性对照1)收集血清从医院或血站获得健康正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存备用；
2)分装AFP-L3阳性对照物肝癌阳性病人腹水，在无菌条件下分装入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
阴性对照血清正常人血清，经检定为AFP阴性。取多份以上血清合并成批，经60℃1小时处理后，过滤除菌在无菌的条件下分装入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
2.制作AFP单克隆抗体包被板a)包被酶标板采用进口或国产生产的12×8可拆条板。将步骤1)所获单克隆抗体用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭。
b)制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗AFP-L3单克隆抗体免疫和细胞融合从肝癌病人腹水中提取的免疫原(甲胎蛋白)与弗氏完全佐剂混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2毫升的剂量皮下施给BALB/C小鼠(CLEAJapan的产品，6周龄雄性)的背部位点。第一次免疫7天或14天后增强免疫，然后在细胞融合前3天，腹膜内施用0.2毫升上述免疫原。最后一次增强3天后，从各小鼠上切下脾脏细胞，与骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14株，RikenGeneBank)以10∶1混合，用50％聚乙二醇4000融合。在HAT培养基(Gibco的产品)上选择性培养杂交瘤。
杂交瘤选择在融合后第12天，用ELISA法测定各培养上清液中的抗体活性。先在ELISA板的每孔固定有10微克/毫升的AFP抗原，在各孔中先加入100ug/ml扁豆凝集素(PBS配制)，并安排同样数量的对照孔中加入缓冲液PBS，反应在37℃进行30分钟后，取出板甩掉其中液体，各取200微升的融合细胞的培养上清液加到96孔ELISA板Coaster的产品)的孔中，每次取的培养上清液都加在对照孔中一份100ul。反应在37℃进行1小时，然后用含0.05％Tween20的PBS(洗液)洗涤，加入200微升过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Cappel产品，1∶20,000)。反应在37℃进行1小时后，用上述洗液洗涤板。然后在各孔中加入200微升底物溶液(0.1M联苯二胺和0.012％过氧化氢水溶液)，使反应在室温下进行15分钟。然后，在各孔中加入50微升3.5mol硫酸终止酶反应，测量492纳米的吸光度，选择能与加入凝集素后反应显著下降的抗体(OD值变化大于50％)。用限制稀释法对各克隆进行两次克隆。克隆后的杂交瘤移植到BALB/C小鼠中，结果发现2个杂交瘤克隆产生各种可作为腹水回收的单克隆抗体。
单克隆抗体的标记1)酶的氧化(全过程避光)a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解。
b)称取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度。
c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。
d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟。
e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌。
f)室温静置30分钟。
g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。
2)单克隆抗体的准备及标记(避光)a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/LNa2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次。
b)将单克隆抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5CB中透析6小时以上，头两个小时换液一次。
c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。
d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。
3)纯化HRP酶标抗AFP-L3单克隆抗体a)完成标记的单克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3。
b)4℃静置1小时。
c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮。
d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀。
e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀。
f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀。
g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度。
h)提纯的HRP-单克隆抗体对PBS透析过夜。
i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-多克隆抗体，获得克分子比接近1∶8的酶标抗单克隆抗体。
4)组装用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的酶标抗AFP-L3单克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.配制底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装。
5.配制显色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装。
6.配制反应终止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分装。
7.配制清洗缓冲液(20倍浓缩液)PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。
应用本发明技术制备AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒的质量检测1)准确性10份正常阴性质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，无假阳性出现。5份肝癌AFP阳性质控血清的参考品检测结果无假阴性出现。
2)精密度随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份肝癌阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于10％。
3)检测灵敏度根据AFP标准品稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为20ng/ml。
4)特异性取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于1.5％。
实施例2AFP-L3定量酶联免疫检测试剂盒的使用1.清洗缓冲液配制将试剂盒提供的浓缩清洗缓冲液加蒸馏水20倍稀释。
2.抗原-抗体反应在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别双孔加入50μl阳性或阴性质控血清，或待测血清样品，37℃水浴保温30分钟，洗板5次，加入凝集素溶液和对照液在每个双孔中，37℃水浴保温30分钟，甩去液体，将HRP-单克隆抗体溶液加入各孔，每孔50ul，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作5次，每次3分钟。
3.显色反应每孔依次加入底物溶液A、TMB显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50ul反应终止液结束反应。
4.比色以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD平均值；记录各孔吸光值；计算双孔阳性、阴性质控血清OD值的平均值。
5.结果判断1)制作标准曲线以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.95时本次测定有效；2)计算待测血清样品浓度根据待测样品的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的AFP和AFP-L3浓度。
阳性质控血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，本次测定有效。
阴性对照血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，本次测定有效。
待检测血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％时，说明其中甲胎蛋白异质体含量较高。
实施例3本发明AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒对肝癌病人阳性样品的检测为判断本发明AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒与临床肝癌检测结果的符合率，取本发明进行检测。地坛医院临床研究数据100份已知原发性肝癌阳性标本，50份体检健康血清，100份肝硬化血清，分别用AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒进行检测，结果见表1。
表1.在不同标本中检出率比较
本实验结果表明，本发明对于原发性肝癌的符合率高达82％，在肝硬化中的特异性高达95％。
实施例4本发明AFP-L3酶联免疫定量检测试剂盒对乙肝慢性大三阳肝炎标本和原发性肝癌标本的检测两类标本进行AFP-L3定量检测，原发性肝癌3份，大三阳慢性肝炎3份，检测结果如图1所示。图1结果显示，本发明AFP-L3酶联免疫定量检测试剂当使用凝集素竞争含量为5ug/ml时，可以清楚分辨出大三阳慢性肝炎和原发性肝癌之间AFP-L3含量的不同。
权利要求
1.甲胎蛋白异质体AFP-L3酶联免疫定量测定试剂盒，其特征在于，它含有结合位点在甲胎异质体的糖链附近的单克隆抗体，当与该糖链特异结合的凝集素结合上去之后，会形成位阻，特异性地影响该单克隆抗体的结合。
2.甲胎蛋白异质体AFP-L3酶联免疫定量测定试剂盒，其特征在于，它含有通过下述方法制备出的单克隆抗体采用肝癌病人腹水中提取的甲胎蛋白进行包被后，加入凝集素和对照缓冲液，再加入要筛选的单克隆株，最后采用标记HRP的抗鼠IgG进行反应，然后显色，筛选的标准是在加入凝集素结合后，对比对照缓冲液该孔显色OD值显著下降(OD值变化≥50％)的抗血清；筛选该杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，它还含有甲胎异质体阳性、阴性对照、甲胎蛋白标准品、酶标板、凝集素溶液、对照缓冲液、辣根过氧化物酶标记AFP-L3单克隆抗体、辅助试剂，其特征在于，所述的单克隆抗体是标记在辣根过氧化物酶上。
4.制作权利要求3所述的试剂盒的方法，包括甲胎异质体阳性、阴性对照的制备，甲胎蛋白标准品、酶标板、凝集素溶液、对照缓冲液、辣根过氧化物酶标记AFP-L3单克隆抗体、辅助试剂的配制。
5.定量检测甲胎蛋白异质体的方法，其中包括使权利要求1-3中的任一项所述的试剂盒与血清或血浆样品相接触的步骤。
6.检测早期原发性肝癌的方法，其中包括使权利要求1-3中的任一项所述的试剂盒与血清或血浆样品相接触的步骤。
全文摘要
本发明提供了一种单克隆抗体，它是通过使用具有与AFP异质体糖链结合扁豆凝集素位点相竞争的单抗，筛选杂交瘤克隆而获得的。本发明还提供了含有该单克隆抗体的试剂盒、其制备方法及其应用。该试剂盒可作为肝癌早期诊断的指标，判断肝癌的发生，为肝癌的预防、诊断、治疗提供直接的支持。
文档编号G01N33/531GK1773286SQ20051010815
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月9日 优先权日2005年10月9日
发明者林长青 申请人:北京微龙阵列生物技术有限公司