专利名称：定量法乙型肝炎e抗原酶联免疫测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物技术领域，具体涉及一种定量法乙型肝炎e抗原(HbeAg)酶联免疫测定试剂盒。
背景技术：
我国为乙型肝炎病毒(HBV)性肝炎的高发区，HbsAg携带者有1.3亿以上(全世界3亿)。以往长期以来，临床医生是根据“二对半”五种试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情。但是这五种试剂仅能定性，不能定量。对治疗效果没有量化，只要病人体内有HBV不论多少均是阳性，较难做出确切的判断。
发明内容
本实用新型所要解决的技术问题在于克服以往检测不足之处，即不能对HBV的e抗原定量，无法知道治疗效果。
本实用新型提供了一种定量法乙型肝炎e抗原酶联免疫测定试剂盒(简称定量法HbeAg酶免试剂盒)，该试剂盒包括一个盒体，盒体内有一块48孔或96孔HbeAb多抗包被板和13瓶试剂，13瓶试剂分别为HbeAg标准品6瓶、酶标记抗HbeAb(乙型肝炎e抗体)单抗1瓶、阳性对照液1瓶、阴性对照液1瓶、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶和终止液1瓶。
其中的HbeAg标准品6瓶，分别为0ng/ml，7.5ng/ml，31.15ng/ml，125.0ng/ml，250.0ng/ml，500.0ng/ml各1瓶。
该试剂盒的配制方法如下一、HBeAg标准品的制备用HBV-DNA重组的HbeAg纯品1-178aa分装成0、7.5、31.15、125.0、250.0、500.0ng/ml共6瓶。
二、预包被抗体板的制备(1)包被液Na2CO30.6gNaHCO31.58g重蒸水 500ml加入适量HBeAg多抗，调整pH至9.5，加入微孔板各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜甩干。
(2)洗涤液Na2HPO4·12H2O2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4g20％Tween-20 2.5mlNaCL 8.2g重蒸水100ml调整pH至7.2，1∶10稀释后，加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，以除去剩余抗体。
(3)封闭液明胶1.1g微波炉加温，加入牛血清白蛋白(BSA)5.0g，至呈透明溶液，加入0.1N PBS 20ml，冷却至室温，加蒸馏水至100ml，注入酶标板各孔中，弃去液体，吸水纸上拍干，重复一次，待干燥后，37℃1hr，放入有干燥剂的塑料袋，封口，保存于4℃。
三、阳性对照的制备HBeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者血清，60℃放置1个小时，除菌过滤，用本药盒测定OD值＞0.3，分装，500μl/瓶。
四、阴性对照的制备用本试剂盒测定正常人血清OD值在0-0.03，加万分之二硫柳汞，分装，500μl/瓶。
五、酶标记抗HbeAb(乙型肝炎e抗体)单抗工作液BSA 0.5gNa2HPO4·12H2O2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4gNaCL 8.2g20％Tween-20 100ml调整pH至7.2，该液用方阵滴定法选择酶标记HbeAb单抗工作液为1∶2000分装，3ml/瓶。
六、底物缓冲液甲Na2HPO4·12H2O1.7g柠檬酸.H2O 0.5g3％H2O2200μl重蒸水100ml
调整pH至5.0分装3ml/瓶七、底物液缓冲液乙Na2HPO4·12H2O 1.7g柠檬酸.H2O0.5g重蒸水 100ml调整pH至5.0后，加入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25μl，分装，3ml/瓶。
八、终止液浓度为3M的H2SO4分装3ml/瓶九、20倍浓洗涤液Na2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O0.4g20％Tween-20 2.5ml重蒸水 100ml调整pH至7.2 分装13ml/瓶定量法HbeAg酶免试剂盒的操作步骤如下(1)取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。
(2)反应孔中分别加各浓度标准品每孔加0、7.5、31.15、125.0、250.0、500.0ng/ml、待检血清、阴性对照血清及阳性质控血清各50μl，每次实验设空白1孔，加蒸馏50μl，然后除空白孔外各孔加酶标记液50μl，置37℃中反应40分钟。
(3)甩去反应孔内液体在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次孔中加满洗涤液后停留30秒钟，甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸馏水即为工作洗涤液)(4)各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，37℃中反应10分钟后再各孔滴加终止液1滴，置酶标仪450nm波长读取各孔光密度(OD)值。
(5)以标准品浓度为横座标，OD值为纵座标绘出标准曲线，以各待测血清OD值在标准曲线上查出该血清的HbeAg浓度。标准曲线详见图2。
定量法测HbeAg酶免试剂盒方法学鉴定用国家药品生物制品检定所提供的参考品进行检定，见下表
说明“定量法HbeAg酶免试剂盒”的特异性、精密性、灵敏度和稳定性是良好的合格的。
正常人HbeAg含量及灰区的确定随机取288名献血员血清用“定量法乙肝病毒HbeAg酶联免疫测定试剂盒测定结果如下288名献血员血清HbeAg测定的OD值均值(X)＝0.113，标准差(SD)＝0.0474。所以其OD值的cut off值(临界值)为均值(X)+3SD＝0.113+0.142＝0.255。再查标准曲线光密度0.255＝6.8ng/ml血清。即450nM测定血清OD值大于0.255＝6.8ng/ml血清者为阳性。
灰区范围的确定HbeAg阴性或正常(献血员)人的OD值为(X)＝0.113，HbeAg阳性的OD值为X(0.113)+3SD(0.142)＝0.255，其HbeAg含量为6.8ng/ml血清。则灰区OD值范围就是0.113至0.255之间，遇灰区患者视为可凝要复查。(表1288名献血员HBeAg的OD值)表1 288名献血员HBeAg的OD值0.049 0.075 0.076 0.080 0.071 0.082 0.088 0.052 0.071 0.070 0.071 0.0630.063 0.075 0.079 0.079 0.075 0.150 0.076 0.067 0.075 0.067 0.074 0.0800.075 0.258 0.077 0.081 0.073 0.083 0.075 0.082 0.094 0.070 0.074 0.0720.063 0.072 0.076 0.083 0.077 0.083 0.075 0.086 0.077 0.089 0.064 0.0700.066 0.070 0.077 0.077 0.074 0.074 0.084 0.078 0.079 0.069 0.066 0.0530.069 0.084 0.075 0.076 0.083 0.086 0.071 0.075 0.084 0.080 0.067 0.0760.125 0.067 0.072 0.088 0.079 0.082 0.086 0.087 0.074 0.076 0.089 0.0750.069 0.077 0.070 0.079 0.073 0.091 0.068 0.073 0.080 0.078 0.070 0.0740.074 0.071 0.077 0.079 0.070 0.067 0.089 0.070 0.191 0.069 0.129 0.0680.076 0.089 0.077 0.075 0.088 0.141 0.082 0.079 0.088 0.072 0.067 0.1250.075 0.232 0.081 0.156 0.074 0.069 0.082 0.082 0.074 0.074 0.083 0.0670.056 0.070 0.074 0.081 0.079 0.086 0.075 0.074 0.077 0.077 0.071 0.0650.072 0.067 0.097 0.080 0.086 0.074 0.083 0.079 0.082 0.078 0.074 0.0650.075 0.075 0.073 0.096 0.085 0.076 0.083 0.075 0.078 0.079 0.261 0.0740.082 0.073 0.069 0.075 0.067 0.077 0.150 0.076 0.077 0.079 0.076 0.0620.068 0.074 0.074 0.074 0.057 0.092 0.085 0.073 0.083 0.079 0.083 0.0530.049 0.076 0.077 0.086 0.072 0.084 0.089 0.051 0.073 0.071 0.071 0.0640.080 0.101 0.080 0.113 0.077 0.152 0.077 0.068 0.075 0.069 0.134 0.1510.087 0.174 0.078 0.078 0.077 0.082 0.074 0.083 0.094 0.092 0.073 0.2190.062 0.073 0.077 0.082 0.079 0.108 0.109 0.152 0.078 0.091 0.065 0.1880.065 0.071 0.115 0.128 0.138 0.138 0.085 0.148 0.079 0.072 0.068 0.0540.069 0.138 0.076 0.077 0.089 0.086 0.072 0.075 0.126 0.082 0.225 0.0760.126 0.068 0.073 0.089 0.081 0.840 0.157 0.089 0.075 0.078 0.089 0.0760.069 0.147 0.071 0.144 0.073 0.093 0.135 0.144 0.080 0.078 0.071 0.074本实用新型定量HbeAg酶免试剂盒的临床应用和与定量PCR荧光试剂盒比较2000年8月至2002年2月第二军医大学附属于长海医院、南京市第二医院和上海市传染病医院使用我们研制建成的“定量法HbeAg酶免试剂盒”和“HBV的PCR荧光定量法检测试剂盒”同时检测乙肝患者阳性血清168份，以比较两种定量之间的相关性。
一、临床血清标本的来源各医院临床收集乙肝患者血清标本总数为168份，其中长海医院79份、南京二院55份、传染病医院34份，共168份。
另外，从长海医院收集到献血员血288份(做正常值用)二、使用定量法HbeAg酶免法与HBV-PCR荧光定量法比较(1)方法三个医院分别使用“定量法HbeAg酶免试剂盒”(本实用新型操作步骤)和PCR荧光定量法试剂盒(按HBV-PCR荧光检测试剂盒说明书操作—深圳匹基生物技术开发有限公司)检测同一血样168份，并经统计学处理结果表明，该两种方法检测的结果非常显著的相关。
(2)结果详见表2和图3-5表2 三个医院两种方法比较
三个医院使用“定量法HbeAg酶免试剂盒”与“HBV-PCR荧光定量试剂盒”测定同一血样的比较结果，两种方法均非常显著相关，均P值＜0.01。说明两种方法具有同等的使用价值，“定量法HbeAg酶免试剂盒”与“HBV-PCR荧光定量试剂盒”相媲美。
本实用新型通过HBeAg定量可以知道HBV含量的多寡，不仅能查出HBV的感染(或载毒)，而且还能查到感染者HBV的含量。这对乙肝患者的防治，特别疗效的判定指标明确，治疗能使HBV减多少可判定之。本实用新型的试剂盒能非常专一地定量测出检测患者血清HbeAg的含量。它具有简便、灵敏、稳定、重复性好等特点。且本试剂盒操作简便快速，采用一步法可在1小时获得实验结果，比PCR检测法省时(PCR法最快需1天完成实验)，经临床试用HbeAg定量法与PCR定量的HBV-DNA有很好的符合率，因而本试剂盒对判断病人是否有病毒复制和定量，对确定乙肝感染病程预后及用药后的疗效具有十分重要的参考意义。本试剂盒与PCR法相比，PCR法需贵重的仪器设备，消耗性试剂昂贵，收费价又高，一般为120元/人次；而本试剂盒整个实验中无需贵重仪器设备，消耗性试剂便宜且收费价低廉，收费在10元左右，可为乙肝患者节省大量费用，不仅能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查。
本实用新型具有较好的社会效益和经济效益。
图1本实用新型的结构示意图图2定量法HbeAg酶免试剂盒标准曲线其中的多实验参数(MULTISKAN EX)酶联免疫吸附测定法第V.2.1-0(PRIMARY EIA V.2.1-0)吸光度模式(ABSORBANCE MODE)连续移动(CONTINUOUS MOVEMENT)
光谱波长(FILTER)450标准曲线计算(LINEAR STANDARD CALC.)
吸光度(ABS)＝直线回归系数(SLOPE)*浓度(CONC)+截距(INTERCEPT)直线回归系数(SLOPE)0.003截距(INTERCEPT)0.149图3长海医院定量HbeAg酶免法与HBV-PCR荧光法比较相关图两法 相关系数(r)＝0.607P值＜0.01直线方程Y＝4.376+0.501X图4南京市二院定量HbeAg酶免法与HBV-PCR荧光法比较相关图两法 相关系数(r)＝0.698P值＜0.01直线方程Y＝0.236+1.306X图5上海传染病院定量HbeAg酶免法与HBV-PCR荧光法比较相关图两法 相关系数(r)＝0.591P值＜0.01直线方程Y＝1.163+0.258X具体实施方式
实施例1如图1所示，一种定量法乙型肝炎e抗原酶联免疫测定试剂盒，该试剂盒包括一个盒体1，盒体1内有一块48孔或96孔HbeAb多抗包被板2和13瓶试剂，13瓶试剂分别为HbeAg标准品6瓶3、酶标记抗HbeAb(乙型肝炎e抗体)单抗1瓶4、阳性对照液1瓶5、阴性对照液1瓶9、20倍浓洗涤液1瓶6、底物缓冲液甲1瓶7、底物缓冲液乙1瓶8和终止液1瓶10。
实施例2实施例1中的HbeAg标准品6瓶3，分别为0ng/ml，7.5ng/ml，31.15ng/ml，125.0ng/ml，250.0ng/ml，500.0ng/ml各1瓶。
权利要求1.一种定量法乙型肝炎e抗原酶联免疫测定试剂盒，该试剂盒包括一个盒体(1)，其特征在于盒体(1)内有一块48孔或96孔HbeAb多抗包被板(2)和13瓶试剂，13瓶试剂分别为HbeAg标准品6瓶(3)、酶标记抗HbeAb单抗1瓶(4)、阳性对照液1瓶(5)、阴性对照液1瓶(9)、20倍浓洗涤液1瓶(6)、底物缓冲液甲1瓶(7)、底物缓冲液乙1瓶(8)和终止液1瓶(10)。
专利摘要本实用新型属于生物技术领域，长期以来临床医生是根据“二对半”五种试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情。但是这五种试剂仅能定性，不能定量。本实用新型克服以往检测不足之处，提供一种定量法乙型肝炎e抗原(HbeAg)酶联免疫测定试剂盒，它包括一个盒体(1)，盒体(1)内有一块48孔或96孔HbeAb多抗包被板(2)和13瓶试剂，13瓶试剂分别为HbeAg标准品6瓶(3)、酶标记抗HbeAb(乙型肝炎e抗体)单抗1瓶(4)、阳性对照液1瓶(5)、阴性对照液1瓶(9)、20倍浓洗涤液1瓶(6)、底物缓冲液甲1瓶(7)、底物缓冲液乙1瓶(8)和终止液1瓶(10)。本实用新型的试剂盒能非常专一地定量测出检测患者血清HbeAg的含量。它具有简便、灵敏、稳定、重复性好等特点。
文档编号G01N33/544GK2881635SQ20052004219
公开日2007年3月21日 申请日期2005年6月6日 优先权日2005年6月6日
发明者杜凤鸣 申请人:杜凤鸣