专利名称：表征、调节、诊断和治疗癌症的组合物和方法
技术领域：
本发明部分地根据国立卫生研究所(National Institutes ofHealth)的授权号CA075136-06做出。政府拥有本发明的部分权利。
发明领域 本发明涉及表征、调节、诊断和治疗癌症的组合物和方法。例如，本发明提供了抑制某些类型的癌细胞(包括乳腺癌细胞)的肿瘤发生和预防转移的组合物和方法。本发明还提供了鉴定调节肿瘤发生的化合物的系统和方法。
背景 癌症是主要死因之一并且转移癌通常是不可治愈的6。尽管当前的治疗可以产生肿瘤消退，但是它们很少治愈常见肿瘤，如转移的乳腺癌6。实体瘤由癌细胞的异质群体组成。像急性髓性白血病(AML)7一样，最近已经阐明在多数恶性人类乳腺肿瘤中，癌细胞的小的、特殊的群体富有在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤的能力1。以前表明在研究的9种肿瘤的8种中，CD44+CD24-/low谱系-群体当注射到免疫缺陷小鼠中时能够形成肿瘤。少至200个的这些称作“致瘤”细胞的细胞始终在小鼠中形成肿瘤。相反，肿瘤中多数癌细胞由具有可变表型的“非致瘤”细胞组成。甚至当注射多达104个细胞时，这些细胞也不能在NOD/SCID小鼠中形成肿瘤1。在一些肿瘤中，通过分离癌细胞的ESA+CD44+CD24-/low谱系-群体可以进一步富集致瘤细胞。能够有希望分离致瘤癌细胞使得可以研究代表这些细胞中的治疗靶标的关键生物学途径。本领域需要表征、调节、诊断和治疗癌症的额外系统和方法。
附图描述
图1显示了乳腺癌细胞中的Notch信号传导。图1A显示了可溶性Delta促进集落形成。分选ESA+CD44+CD24-/low谱系-T1致瘤乳腺癌细胞，并在胶原包被的平板上在仅组织培养基(对照)、补加Fc对照片段11(Fc)的培养基或者补加Delta-Fc(Delta)的培养基中培养。用可溶性Delta-Fc培养细胞导致比对照细胞或者仅用对照Fc片段11处理的细胞多5倍的集落。图1B显示了显性失活腺病毒载体对Notch信号传导的抑制。用在Notch-反应性HES-1启动子38的调节下的萤光素酶小基因稳定转染MCF-7细胞。然后测量在含有Delta-Fc但没有病毒(对照)的培养基中培养的对照MCF-7细胞中或者用GFP仅腺病毒(Ad-GFP)或显性失活腺病毒载体dnMAML1(Ad-GFP-dnMAML1)感染后48小时的萤光素酶活性。Ad-GFP-dnMAML1腺病毒，而不是Ad-GFP腺病毒，显著降低了萤光素酶活性。图1C显示了Notch受体转录下调对原代肿瘤细胞的影响。ESA+CD44+CD24-/low谱系-癌细胞1(T1)或者来自不同患者的谱系-癌细胞1(T2-T5)在12孔的胶原包被的组织培养板中分选。细胞用所示的显性失活的腺病毒构建体或者对照GFP病毒感染。在感染后48小时用锥虫蓝排除法来计数活细胞。dnMAML1显著减小T1、T2、T4和T5中的活细胞数，而对T3细胞具有较小的影响。
图2显示了致瘤乳腺癌细胞中的Notch4信号传导。图2A显示了Notch途径报道基因测定法的结果。在从用HES-1/萤光素酶报道基因稳定转染的MCF-7细胞得到的提取物中测量萤光素酶活性，所述细胞已经用对照Fc片段(Fc)、可溶性Delta-Fc(+Delta)、可溶性Delta-Fc和抗Notch4多克隆抗体(+N4Ab)或者用可溶性Delta-Fc、抗Notch4多克隆抗体以及制备多克隆抗体时所针对的阻断肽(blockingpeptide)(+Block)温育。抗Notch4抗体抑制萤光素酶活性，并且该抑制通过预温育阻断抗体和阻断肽而部分地逆转。图2B显示了乳腺癌细胞的Notch4表达。对在NOD/SCID小鼠中传代一次的未分选的癌细胞和致瘤(CD44+CD24-/low谱系-)T1细胞通过RT-PCR分析Notch4的表达。还进行RT-PCR来证实所用的MCF-7细胞表达Notch4 mRNA。图2C显示了集落形成。20,000个T1或者T4癌细胞在含有Delta-Fc(+Delta)或者仅Fc片段(+Fc)的所示组织培养基中生长14天。用不补加抗体(+Delta)、补加多克隆抗Notch4抗体(+N4Ab)或者补加抗Notch4抗体加上阻断肽(+N4Ab+Block)的所示培养基中进行一式三份的培养。图2D显示了在每种条件下14天后形成的集落的代表性图像(10倍物镜)，表格指出了在每个孔中计数的集落数。可溶性Delta-Fc刺激集落形成(p＜0.001)，而多克隆抗Notch4抗体在Delta-Fc存在下抑制集落形成(p＜0.001)。当抗体与用于产生抗Notch4抗体的肽预温育时，抗体的抑制效果几乎被完全逆转(p＜0.001)。结果是3次独立实验的代表。图2E显示了从第一或者第二代T1肿瘤分离的ESA+CD44+CD24-/low谱系-致瘤细胞。200个细胞在对照缓冲液中或者与多克隆抗Notch4抗体温育后注射到小鼠的乳房脂肪垫区域中。在5个月内监视肿瘤形成。结果来自2个独立的实验。
图3显示了凋亡的机理。图3A显示了用抗Notch4抗体处理的癌细胞的生活力。ESA+CD44+CD24-/low谱系-致瘤性肿瘤1(T1)细胞或者MCF-7细胞用抗Notch4抗体培养48小时。收获细胞并用PI染色，并通过流式细胞术测量生活力。图3B显示了抗Notch4抗体对胱天蛋白酶的激活。ESA+CD44+CD24-/low谱系-致瘤性肿瘤1(T1)细胞、H2K-肿瘤4(T4)或者肿瘤5(T5)细胞、或者MCF-7细胞在对照培养基(-)或者含有抗Notch4抗体的培养基(+)中培养，36小时后，通过流式细胞术使用荧光底物CaspoTagTM测量活性胱天蛋白酶3/7。暴露于抗Notch4抗体后，与对照细胞相比，在T1肿瘤起始性细胞、T5细胞和MCF-7细胞中表达活化的胱天蛋白酶3/7的细胞的百分数显著增加。T4细胞不显示出高水平的胱天蛋白酶活化。图3C和3D显示出Notch转录反式激活对MCF-7细胞的抑制作用。野生型MCF-7细胞、用Bcl.-XL或者显性失活FADD(dnFADD)稳定转染的MCF-7细胞用dnMAML1或者对照GFP腺病毒感染。48小时后，在图3C中显示了用dnMAML1 AD感染的活细胞相对于用对照腺病毒感染的细胞的百分数。图3D显示了用所示的对照GFP或者GFP-dnMAML1腺病毒感染的每种细胞类型的显微照片(20倍物镜)。图3E显示了MCF-7细胞系中dnFADD和BCL-XL的表达水平。进行蛋白质印迹以确定亲代MCF-7细胞(MCF-7wt)、用表达显性失活FADD的小基因转染的MCF-7细胞(MCF-7dnFADD)或者用BCL-XL转染的两种不同克隆(MCF-7-BCL-XL-c1和MCF-7-BCL-XL-c2)对所示蛋白质的表达。用FLAG-标记的BCL-XL转染的293T细胞用作BCL-XL表达的阳性对照。dnMAML1显著减小亲代MCF-7细胞系以及MCF-7/dnFADD细胞系中的活细胞数，而对两种MCF-7/BCL-XL细胞系仅有最小的影响。
图4显示了致瘤和非致瘤癌细胞的分离。用流式细胞术分离以前在NOD/SCID小鼠中测试致瘤性的肿瘤1(a，b，c)或者肿瘤4(d，e，f)的亚群1。用抗ESA、CD44、CD24、谱系标记、小鼠-H2K(对于从小鼠得到的传代肿瘤)和7AAD的抗体染色细胞。从所有分析中除去死细胞(7AAD+)、小鼠细胞(H2K+)和正常细胞。每张图描绘了活的人谱系-癌细胞的ESA CD24染色图1。显示了分选的致瘤(c，f)和非致瘤(b，e)细胞群体的再次分析。基于可检测的CD44表达分离致瘤细胞(未显示门(gate))。T4细胞的ESA-CD24-/lowCD44+谱系-群体具有减小的但是仍存在的致瘤潜力1。
图5显示了Notch信号传导的腺病毒抑制，显示了Ad-GFP-dnMAML1病毒构建体的描绘。将人MAML1的氨基酸1-302的编码区在IRES-GFP基因的上游克隆到MSCVneoEB载体中。然后将dnMAML1-IRES-GFP片段克隆到腺病毒穿梭载体pACCMV2的EcoRI和BamHI位点中。
图6显示了证明γ-分泌酶抑制剂对MCF-7细胞生活力和Notch受体活化的影响的图。通过将显示出表达Notch的20,000个MCF-7细胞一式三份地在6孔板中培育来测定细胞生活力。48小时后，向细胞中加入不同量的γ-分泌酶抑制剂。24小时后计数总的细胞和锥虫蓝阴性(活)的细胞并确定％细胞生活力。用处于HES-1启动子控制下的萤光素酶报道基因稳定转染的MCF-7细胞与如上所述的不同浓度的γ-分泌酶抑制剂在6孔板中共培养。用标准萤光素酶测定法监视HES1启动子的反式激活或者抑制。γ-分泌酶抑制剂明显抑制Notch受体的表达并且显著减小细胞的生活力。这些结果证明γ-分泌酶抑制剂可以用于抑制致瘤癌细胞中的Notch。
图7显示了用或者不用γ-分泌酶抑制剂处理的培养的癌细胞的活细胞百分数的图。
定义 为了方便理解本发明，下面定义许多术语和短语 本文所用术语“抗癌剂”、“常规抗癌剂”、或者“癌症治疗药物”是指用于癌症治疗(例如，哺乳动物中)的任何治疗剂(例如，化学治疗化合物和/和分子治疗化合物)、放射疗法或者外科手术。
本文所用术语“药物”和“化学治疗剂”是指用于诊断、治疗或者预防生理系统(例如，受试者，或者体内、体外或离体细胞、组织和器官)中疾病或者生理状况的药理学活性分子。药物通过改变已经施用该药物的活生物体、组织、细胞或者体外系统的生理发挥作用。希望术语“药物”和“化学治疗剂”包括抗超增殖和抗肿瘤化合物以及其他生物学治疗化合物。
本文所用术语“前体药物”是指亲本“药物”分子的药学无活性衍生物，其需要在目标生理系统中生物转化(例如，自发或者酶促的)以释放，或者将“前体药物”转化(例如，酶促地、机械地、电磁地等等)成活性“药物”。设计“前体药物”用来克服与稳定性、毒性、缺少特异性或者受限的生物利用率有关的问题。示例性“前体药物”包括活性“药物”分子自身和化学掩蔽基团(例如，可逆抑制“药物”的活性的基团)。一些优选的“前体药物”是化合物的变体或者衍生物，其具有在代谢条件下可切割的基团。示例性“前体药物”当在生理条件下经历溶剂解离或者经历酶促降解或者其他生物化学转化(例如，磷酸化、氢化、脱氢、糖基化等等)时，在体内或者体外变成药学活性的。前体药物通常提供了在哺乳动物生物体中溶解性、组织相容性或者延迟释放的优点(见，例如，Bundgard，Design of Prodrugs，pp.7-9，21-24，Elsevier，Amsterdam(1985)；和Silverman，TheOrganic Chemistry of Drug Design and Drug Action，pp.352-401，Academic Press，San Diego，CA(1992))。常见的“前体药物”包括酸衍生物，如通过亲本酸与合适的醇(例如，低级链烷醇)反应制备的酸酯，通过亲本酸化合物与胺(例如，如上述)制备的酰胺，或者与碱性基团反应形成酰化碱衍生物(例如，低级烷基酰胺)。
“有效量”是足够实现有益的或者所希望的结果的量。可以在一次或者多次施用中施用有效量。
本文所用的术语“施用”是指对生理系统(例如，受试者，或者体内、体外或离体细胞、组织和器官)给予药物、前体药物或者其他药剂或者治疗性处理的动作。对人体施用的示例性途径可以通过眼(眼的)、嘴(口的)、皮肤(经皮的)、鼻(鼻的)、肺(吸入的)、口粘膜(颊的)、耳，通过注射(例如，静脉内、皮下、肿瘤内、腹膜内等等)等等。
“共同施用”是指对生理系统(例如，受试者，或者体内、体外或离体细胞、组织和器官)施用一种以上的化学剂或者治疗性处理(例如，放射疗法)。各个化学剂和治疗性处理(例如，放射疗法)的“共同施用”可以是同时的、或者以任何时间顺序或者物理组合。
本文所用的术语“生物利用率”是指对生理系统(例如，受试者，或者体内、体外或离体细胞、组织和器官)施用后治疗剂被吸收到生物靶标流体(例如，血液、细胞质、CNS液等等)、组织、细胞器或者细胞间隙中的能力的任何量度。
本文所用的术语“生物分布”是指药剂在施用于生理系统后在细胞器、细胞(体内或体外)、组织、器官或者生物体中的定位。
本文所用的术语“超增殖性疾病”是指任何这样的状况，即其中动物中增殖细胞的局限性群体(localized population)不受通常正常生长限制的控制。超增殖性病症的实例包括肿瘤、赘生物、淋巴瘤等等。赘生物如果不经历侵入或者转移就是良性的，如果经历侵入或者转移就是恶性的。“转移的”细胞或者组织表示细胞可以侵入和破坏周围的身体结构。超常增生是一种形式的细胞增殖，其包括组织或者器官中细胞数增加而不显著改变结构或者功能。组织转化是一种形式的受控的细胞生长，其中一种类型的完全分化的细胞取代另一类型的分化的细胞。组织转化可以在上皮或者结缔组织细胞中发生。典型的组织转化涉及有点无序地组织转化的上皮。
本文所用的术语“肿瘤性疾病”是指良性(非癌性)或者恶性(癌性)的细胞或者组织的任何异常生长。
本文所用的术语“抗肿瘤剂”指阻碍靶定的(例如，恶性)赘生物的增生、生长或者扩散的任何化合物。
本文所用的术语“消退”指与基础的不致病的代表性受试者、细胞、组织或者器官相比，患病的受试者、细胞、组织或者器官返回到非病理的或者较小病理的状态。例如，肿瘤的消退包括肿瘤质量的减小以及一个或多个肿瘤的完全消失。
本文所用的术语“防止”指减小受试者中超增殖性或者肿瘤性细胞的发生。防止可以是完全的，例如，受试者中完全不存在超增殖性或者肿瘤性细胞。防止还可以是部分的，从而受试者中超增殖性或者肿瘤性细胞的发生率小于不用本发明时出现的发生率。
本文所用的术语“体外”指人工环境和在人工环境内发生的过程或者反应。体外环境可以由但是不限于试管和细胞培养物组成。术语“体内”指天然环境(例如，动物或者细胞)和在天然环境内发生的过程或者反应。
本文所用的术语“细胞培养物”指细胞的任何体外培养物。该术语包括连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化的细胞)，和体外保持的任何其他细胞群体，包括卵母细胞和胚胎。
本文所用的术语“受试者”指将通过本发明的方法治疗的生物。这样的生物包括但不限于，人和兽医学动物(狗、猫、马、猪、牛、绵羊、山羊等等)。在本发明的上下文中，术语“受试者”一般指将接受或者已经接受治疗的个体。
本文所用的术语“诊断的”指通过疾病的病征和症状或者基因分析、病理学分析、组织学分析等等对疾病的识别。
本文所用的术语“竞争结合”用于关于第一种分子，其具有结合与第二种分子所结合的相同的靶标的活性。第一种分子的结合效率(例如，动力学或者热力学)可以与第二种分子的靶标结合效率相同或者更大或者更小。例如，两种分子的结合靶标的平衡结合常数(Kd)可以不同。
本文所用的术语“反义”用于涉及与特定RNA序列(例如，mRNA)互补的核酸序列(例如，RNA、硫代磷酸DNA)。该定义包括天然或者合成的反义RNA分子，包括调节基因表达的分子，如小干扰RNA或者微型RNA。
术语“受试化合物”指任意化学实体、药物、药品等等，其可以用于治疗或者预防疾病、病、病状或者身体功能的紊乱，或者改变样品的生理或者细胞状态。受试化合物包含已知的和潜在的治疗化合物。通过使用本发明的筛选方法可以确定受试化合物是治疗剂。“已知的治疗化合物”指已经证明(例如，通过动物试验或者先前施用于人的实验)在此类治疗或者预防中有效的治疗化合物。在优选实施方案中，“受试化合物”是抗癌剂。在尤其优选的实施方案中，“受试化合物”是在细胞中诱导凋亡的抗癌剂。
本文所用的术语“纯化的”或者“纯化”是指从样品中除去不希望的组分。本文所用的术语“基本纯化的”指从它们的天然环境中取出、分离或分开的，并且至少60％无，优选至少75％无，最优选至少90％无与它们天然结合的其他组分的分子(例如，多核苷酸、多肽、化合物)。例如，“分离的多核苷酸”因此是基本上纯化的多核苷酸。
本文所用的“核酸序列”和“核苷酸序列”指寡核苷酸或者多核苷酸，和其片段或者部分，以及基因组或者合成来源的DNA或者RNA，它们可以是单链或者双链的，并且代表有义或者反义链。本文所用的术语“编码…的核酸分子”、“编码…的DNA序列”、“编码…的DNA”、“编码…的RNA序列”和“编码…的RNA”指沿着脱氧核糖核酸或者核糖核酸的链的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的顺序或者序列。这些脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的顺序决定了沿着从mRNA翻译的多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。从而DNA或者RNA序列编码氨基酸序列。
术语“基因”指包含产生多肽或者前体(例如，胰岛素原)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA或者RNA)序列。多肽可以由全长编码序列或者由编码序列的任意部分编码，只要保留全长或者片段的所希望的活性或者功能性质(例如，酶促活性、配体结合、信号转导，等等)。该术语还包括结构基因的编码区，和包括在5’和3’末端与编码区以在任一端距离约1kb或以上相邻近的序列，从而该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5’并且存在于mRNA上的序列称作5’非翻译序列。位于编码区的3’或者下游并且存在于mRNA上的序列称作3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或者克隆含有用称作“内含子”或者“间插区”或者“间插序列”的非编码区中断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可以含有调节元件，如增强子。内含子从核或者原始转录物中除去或“剪接去除”；因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译中所起的作用是规定新生多肽中的氨基酸序列或者顺序。
本文所用的术语“外源基因”指不天然存在于宿主生物或者细胞中，或者人工导入宿主生物或者细胞中的基因。
本文所用的术语“载体”指任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等等，其当结合适当的控制元件时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列。从而，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。
本文所用的术语“基因表达”指通过基因的“转录”(即，通过RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化成RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或者snRNA)的过程，或者对于编码蛋白质的基因，通过mRNA的“翻译”将基因中编码的遗传信息转化成蛋白质的过程。基因表达可以在该过程中许多阶段上受到调节。“上调”或者“激活”指增加基因表达产物(即，RNA或者蛋白质)的产生的调节，而“下调”或者“阻抑”指减少产生的调节。参与上调和下调的分子(例如，转录因子)通常分别称作“激活剂”和“阻抑物”。
本文所用术语“抗原结合蛋白”指结合特定抗原的蛋白质。“抗原结合蛋白”包括但不限于，免疫球蛋白，包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、和人源化抗体、Fab片段、F(ab’)2片段和Fab表达文库。本领域已知的多种方法可以用于产生多克隆抗体。为了产生抗体，通过注射对应于所希望的表位的肽可以免疫多种宿主动物，包括，但不限于，兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等等。在优选实施方案中，肽缀合到免疫原性载体(例如，白喉类毒素、牛血清白蛋白(BSA)、或者匙孔血蓝蛋白(KLH))。多种佐剂用于增强免疫应答，取决于宿主种类，包括，但不限于，弗氏佐剂(完全和不完全弗氏佐剂)，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳液，匙孔血蓝蛋白，二硝基苯酚，和可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium paryum)。
为了制备单克隆抗体，可以使用在培养物中由连续细胞系产生抗体分子的技术(见，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。这些技术包括，但不限于，最初由Khler和Milstein研发的杂交瘤技术(Khler和Milstein，Nature，256495-497(1975))，以及三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(见，例如，Kozbor等人，Immunol.Today，472(1983))，和用以产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。
根据本发明，为产生单链抗体描述的技术(U.S.4,946,778；这里引入作为参考)可以适用于产生所希望的特异单链抗体。本发明的一个额外实施方案使用本领域已知的用于构建Fab表达文库的技术(Huse等人，Science，2461275-1281(1989))以快速和容易地鉴定具有所希望的特异性的单克隆Fab片段。
可以通过已知技术产生含有抗体分子的独特型(抗原结合区)的抗体片段。例如，此类片段包括，但不限于通过胃蛋白酶消化抗体分子可以产生的F(ab’)2片段；通过还原F(ab’)2片段的二硫键可以产生的Fab’片段；和通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子可以产生的Fab片段。
可以通过本领域已知的方法分离编码抗原结合蛋白的基因。在抗体的产生中，可以通过本领域已知的技术完成所希望抗体的筛选，所述技术为例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹层”免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(使用例如，胶体金、酶或者放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、血细胞凝集测定等等)、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白A测定和免疫电泳测定，等等。
本文所用术语“调节”指化合物影响(例如，促进或者阻碍)细胞功能的一方面的活性，所述细胞功能包括，但不限于，细胞生长、增殖、侵入、血管发生、凋亡，等等。
发明概述 本发明涉及表征、调节、诊断和治疗癌症的组合物和方法。例如，本发明提供了抑制某些类型的癌细胞(包括乳腺癌细胞)的肿瘤发生和防止转移的组合物和方法。本发明还提供了用于鉴定调节肿瘤发生的化合物的系统和方法。
例如，本发明提供了用于鉴定肿瘤样品中致瘤细胞的存在的研究和临床诊断方法。在一些实施方案中，所述方法包括检测致瘤细胞特征性的一种或多种(例如，2，3，4…)标记或者性质(例如，不是非致瘤细胞特征性的一种或多种标记或者性质)。在一些优选的实施方案中，一种或多种标记包括，但不限于，Notch4的表达、暴露于抗Notch4抗体时细胞死亡、Manic Fringe的表达、Notch配体Delta相对于所述非致瘤细胞改变的表达、Jagged的表达、和暴露于显性失活腺病毒载体dnMAML1时细胞死亡。尽管本发明不被细胞的特性限定，但是在一些优选实施方案中，细胞来自乳腺癌肿瘤。
在一些实施方案中，致瘤细胞的鉴定用于为受试者选择治疗行动过程。例如，在一些实施方案中，治疗行动过程包括对受试者施用Notch4途径抑制剂。在其他实施方案中，治疗行动过程包括施用启动线粒体凋亡的药物(例如，Bak和Bax的调节剂、Bcl-2和BclXL的调节剂、电子转移的调节剂——见，例如，美国专利申请号20030119029，这里完整引入作为参考，等等)。在一些实施方案中，治疗行动过程包括对所述受试者施用γ-分泌酶抑制剂。γ-分泌酶抑制剂包括，但不限于，美国专利申请序号20030216380、20030135044、20030114387、20030100512、20030055005、20020013315和美国专利号6,448,229(将这些专利都完整引入本文作为参考)中描述的那些，以及通过商业途径可获得的抑制剂(例如，从Calbiochem)。在一些实施方案中，治疗行动过程包括对所述受试者施用Manic Fringe抑制剂。Manic Fringe抑制剂包括，但不限于，抗Manic Fringe抗体、靶定Manic Fringe表达的siRNA分子、抑制Manic Fringe的小分子等等。
本发明还提供了选择或者表征化合物(例如，用于基础研究、药物筛选、药物试验、监测治疗等等)的方法，其包括步骤a)提供包含致瘤细胞(例如，乳腺细胞)的样品；b)将样品暴露于受试化合物；和c)检测细胞中响应受试化合物而发生的改变。在一些实施方案中，受试化合物包含抗体(例如，调节Notch信号传导途径的抗体)。在一些实施方案中，该化合物包含抗肿瘤化合物。在一些实施方案中，共同施用另一种或者额外的化合物(例如，已知的抗肿瘤性治疗化合物)。在一些实施方案中，检测步骤包括检测所述致瘤细胞的细胞死亡(例如，检测凋亡标记，如胱天蛋白酶，等等)。
本发明还提供了鉴定具有致瘤细胞的受试者和基于所鉴定的致瘤细胞的特性用合适的治疗行动过程治疗受试者的方法。例如，本发明提供了治疗具有致瘤细胞(例如，乳腺细胞)的受试者的方法，其包括步骤a)鉴定受试者中致瘤乳腺细胞的存在；b)鉴定致瘤细胞特征性的一种或多种标记或者性质以鉴定致瘤细胞的特性；和c)基于致瘤细胞的特性选择治疗行动过程。在一些实施方案中，行动的过程包括当致瘤细胞的特征是表达Notch4，或者例如当致瘤细胞不表达Notch4而是邻近的非致瘤细胞表达Notch4时，对受试者施用Notch4途径抑制剂或者其他合适的治疗剂。在一些实施方案中，行动的过程包括从受试者手术除去肿瘤和对受试者施用Notch4途径抑制剂或者其他合适的治疗化合物(例如，以预防肿瘤发生或者由剩余的致瘤细胞导致的转移)。在一些实施方案中，行动的过程包括对受试者共同施用Notch4途径抑制剂或者其他合适的治疗化合物和另一种抗肿瘤剂。
本发明还提供了例如，预防或者减少转移的方法，其包括步骤对怀疑具有转移(例如，怀疑经历转移或者有转移风险)的受试者施用Notch途径抑制剂或者其他合适的治疗化合物。在一些实施方案中，Notch途径抑制剂包括抗Notch4抗体。在一些实施方案中，所述化合物包含启动线粒体凋亡的药物。在一些实施方案中，所述化合物是γ-分泌酶抑制剂。在一些实施方案中，所述施用结合从受试者除去实体瘤(例如，乳腺肿瘤)进行。
本发明还提供了减小或者清除癌症(例如，乳腺癌)受试者中致瘤细胞的方法，其包括对受试者施用γ-分泌酶抑制剂(例如，处于使得致瘤细胞被杀死或者抑制而不能增殖或者导致转移这样的条件下)。
本发明还提供了减少或者清除癌症(例如，乳腺癌)受试者中致瘤细胞的方法，其包括对受试者施用Manic Fringe抑制剂(例如，处于使得致瘤细胞被杀死或者抑制而不能增殖或者导致转移这样的条件下)。
发明详述 实体瘤由癌细胞的异质群体组成，所述癌细胞形成新肿瘤的能力不同。能够形成肿瘤的癌细胞(即，致瘤癌细胞)和缺乏该能力的癌细胞(即，非致瘤癌细胞)可以基于表型区别1。因为致瘤癌细胞和正常干细胞都有通过自我更新过程而自身复制的基本能力，所以在本发明的研发期间进行的实验研究了致瘤癌细胞中潜在的自我更新途径以便允许表征和鉴定致瘤癌细胞，提供筛选癌症治疗剂的系统，和提供治疗靶标和针对那些靶标的化合物。
从而，本发明涉及表征、调节、诊断和治疗癌症的组合物和方法。例如，本发明提供了抑制某些类型的癌细胞(包括乳腺癌细胞)的肿瘤发生和预防转移的组合物和方法。本发明还提供了鉴定调节肿瘤发生的化合物的系统和方法。
例如，本发明提供了鉴定致瘤细胞和诊断与致瘤细胞的存在有关的疾病(例如，超增殖性疾病)或者生物学事件(例如，肿瘤转移)的方法。具体地，本发明鉴定了癌症内具有致瘤性的细胞的类别，并提供了这样的细胞的可检测的特征，从而例如在选择是否将受试者进行医学介入、选择合适的治疗行动过程、监视治疗行动过程的成功或者进展(例如，在药物试验中或者在选择个体化的正在进行的治疗中)、或者筛选新的治疗化合物或治疗靶标之中确定它们的存在。
本发明还提供了治疗组合物和方法。具体地，本发明鉴定了生物学靶标和调节肿瘤发生和转移的那些生物学靶标的调节剂。此类治疗方法可以例如，单独地或者与其他治疗行动过程组合(例如，共同施用其他抗肿瘤剂)或者与诊断过程组合(例如，通过本发明的诊断方法鉴定对本发明的治疗方法顺从的患者)使用。
本发明还提供了鉴定致瘤细胞表达的基因和蛋白质的系统和方法，以鉴定功能对肿瘤发生必需的蛋白质、提供新的药物靶标。
在一些实施方案中，Notch蛋白质和/或Notch信号传导途径的调节剂的表达用于鉴定致瘤细胞。Notch蛋白质和/或Notch信号传导途径的调节剂还用于研究、药物筛选和治疗方法。例如，Notch表达或者功能(例如，Notch4)的抑制剂用于预防或者减少细胞增殖，超增殖性疾病发生或者进展，和癌症转移。在一些实施方案中，除去实体瘤肿块后利用抑制剂来帮助减少剩余的超增殖性细胞的增殖和转移。例如，在本文中表明非致瘤细胞(例如，可以在实体瘤肿块的切除中除去的细胞)表达防止邻近细胞经历增殖的因子。从而，肿瘤去除后适宜的治疗介入提供了该功能的替代，抑制剩余致瘤细胞的增殖和转移。
本发明不限于特定类型的致瘤细胞类型，本发明也不受到用于调节肿瘤发生的化合物或者因子的特性的限制。从而，尽管下面用乳腺癌细胞以及肿瘤发生的抗体和腺病毒抑制剂来阐明本发明，但是技术人员将明白本发明不限于这些阐明性实施例。例如，预期多种肿瘤性状况从本发明的教导受益，所述状况包括但不限于，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、硬脑膜肉瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤，和成视网膜细胞瘤。
同样，本发明设想多种药剂调节肿瘤发生的用途，所述药剂包括抗体、蛋白质、肽、反义寡核苷酸(见，例如，美国专利号6,379,925，描述了Notch4反义寡核苷酸，本文完整引用作为参考)，包括小干扰RNA分子、小分子药物，等等。
Notch途径对于生殖细胞的和多种正常的干细胞的维持是重要的2，3，Notch突变导致小鼠中的乳腺癌4，5。本发明证明在一亚类癌症(例如，人乳腺癌)中，Notch激动剂Delta提供了致瘤性乳腺癌细胞的存活信号，允许它们在体外形成集落。
Notch信号传导抑制剂(如Numb和Numb-样；或者阻断Notch活化的抗体或者小分子)可以用于本发明的方法中以抑制致瘤细胞。以这种方式，Notch途径受到修饰而杀死致瘤细胞或者抑制致瘤细胞的增殖。例如，识别Notch4的抗体阻断体外和体内乳腺癌肿瘤细胞的生长(见，例如，美国专利公布号20020119565，这里将其完整引入本文作为参考)，并且在这里发现用于例如，预防肿瘤转移(例如，在实体瘤去除后)。此外，如图6和下面的实施例章节所示，γ-分泌酶抑制剂的施用可以用于处理致瘤细胞，表明以不直接靶定Notch4的方式对Notch途径的抑制同样也可用于本发明的方法中。同样地，如图5中所示，显性失活的Mastermindlike-1腺病毒(dnMAML1Ad)(一种Notch转录激活的抑制剂)的施用可以用于处理致瘤细胞。
相反，以前已经发现用可溶性Delta(Han等人，Blood 95(5)161625(2000))(一种Notch配体)刺激Notch会促进体外肿瘤细胞的生长和存活。从而，以前已经发现Notch途径的刺激促进癌细胞的生长和存活。
在本发明的研发期间进行的实验表明，分别在来自测试的5个肿瘤的5个和3个肿瘤的2个之中的癌细胞中，显性失活的Notch抑制剂或者抗Notch4的阻断抗体对Notch信号传导的抑制通过线粒体死亡途径诱导凋亡。在一些情况中，致瘤和非致瘤癌细胞在它们的Notch、Notch配体和Notch修饰因子的Fringe家族成员的表达方面不同。在致瘤癌细胞不受到抗Notch4抗体的影响的肿瘤中，在非致瘤癌细胞中而不是在致瘤癌细胞中检测到Notch4表达。从而，实验表明在乳腺癌的一些病例中，Notch信号传导可以调节致瘤性亚类的癌细胞的生长，并且致瘤和非致瘤癌细胞差别表达该信号传导途径的组分。这些结果表明致瘤癌细胞的预期鉴定使得可以鉴定能影响这些细胞的关键功能的因子。因为该亚群驱动肿瘤发生，所以这些细胞中靶标的鉴定提供了更有效的癌症疗法。
观察到肿瘤含有小群的具有通常的细胞表面表型的致瘤细胞，该观察对于理解实体瘤生物学和开发有效的癌症疗法有重要的提示36。当前的癌症治疗不能治愈转移疾病可能是由于不能有效杀死致瘤细胞。如果致瘤细胞不能被药剂全部杀死，那么肿瘤可能消退但是剩余的致瘤细胞将推动肿瘤复发。通过集中于致瘤群体，可以鉴定与癌细胞的致瘤群体中基本的生物功能，如自我更新和存活有关的关键蛋白质。通过从两名不同受试者得到的肿瘤样品T1和T4阐明了致瘤细胞的预期鉴定对于鉴定可以更有效地治疗乳腺癌的潜在治疗靶标的重要性。尽管当Notch信号传导受到dnMAML1腺病毒抑制时两个肿瘤都死亡并且两个肿瘤都表达Notch4，但是当暴露于抗Notch4抗体时，仅T1克隆发生细胞死亡。这可以通过如下观察来解释T2致瘤细胞表达Notch4，但是在表达Notch1和Notch2的致瘤T4细胞中不能检测到Notch4的表达。观察到Notch配体在致瘤癌细胞中以低水平表达对肿瘤生物学有提示。长久以来假设基质细胞-癌细胞相互作用可能在肿瘤的生长和转移中起重要作用(37中的综述)。因为Notch活化促进克隆发生细胞的生长，所以特定组织中细胞对Notch配体的表达可以促进肿瘤向该特定部位的扩散。
以前报导Notch受体的活化与乳腺癌有关，并且Notch信号传导在用活化的Ras癌基因转染的细胞的转化中起作用，但是它在新生人乳腺癌中的作用是未知的17-20。在本发明的研发期间进行的实验通过将培养的细胞暴露于可溶形式的Notch配体Delta，Delta-Fc，测试了从患者分离的人乳腺癌细胞(称作T1(肿瘤1))中Notch活化的影响。可溶的Delta将培养的未分级的T1癌细胞形成的集落数目增加了5倍(图1a)。接着，通过用显性失活的Mastermindlike-121-24腺病毒(dnMAML1Ad，图5)(一种Notch转录活化抑制剂)感染细胞，测试了Notch信号传导的抑制对从T1分离的致瘤细胞的能力的影响(图1b)。感染后2天，dnMAML1Ad而不是对照腺病毒载体导致活的T1致瘤癌细胞或来自测试的其他患者的所有4个肿瘤(称作T2-T5)的克隆生成乳腺癌细胞减少18％-45％(图1c)。这些数据表明Notch活化促进了测试的所有5个新生肿瘤中的克隆生成癌细胞的存活或者增殖。
检查了Notch4在人乳腺癌中的潜在作用。在所检查的5个肿瘤的4个中检测到Notch4表达，包括T1和T4(表1)。
表1.定量RT-PCR基因表达分析 在抑制Notch信号传导的针对Notch4的多克隆抗体的存在下培养T1癌细胞(图2a)。当表达Notch4的T1癌细胞(表1，图2b)在体外暴露于该抗体时，集落形成受到显著抑制(图2c，d)。通过该抗体与Notch4肽的预温育几乎完全消除该抑制，其中针对所述Notch4产生所述抗体，证明了抗Notch4抗体的特异性(图2c，d)。另一方面，T4癌细胞的集落形成不受到抗Notch4抗体的影响(图2c)。使用定量RT-PCR，可以检测T1和T4非致瘤癌细胞1中Notch4的表达(表1)。然而，当测试T1和T4致瘤细胞时，在T1致瘤癌细胞中检测到Notch4表达，而T4致瘤细胞表达Notch1和Notch2，而不表达Notch4(表1)。这些数据解释了如下观察来自两种肿瘤的克隆生成细胞当用dnMAML1腺病毒感染时死亡(图1c)，但是仅仅T1克隆生成细胞受到抗Notch4抗体的影响(图2c)。进一步的实验测试了抗Notch4抗体是否抑制体内致瘤性T1癌细胞的肿瘤形成。少至200个T1致瘤癌细胞能够始终在NOD/SCID小鼠中形成肿瘤1。因此，将200个T1致瘤癌细胞与对照缓冲液或者抗Notch4抗体温育，然后注射到小鼠中。未处理的细胞的9次注射中的7次和处理的细胞的9次注射中的0次形成肿瘤(图2e)。较大数目的经抗体处理的细胞的肿瘤形成相对于对照细胞被延迟。
进一步的实验研究了抗Notch4抗体抑制该肿瘤中以及从另外患者分离的肿瘤细胞中的癌细胞的增殖。已经证明Notch刺激在某些情况下促进细胞增殖，在其他情况下抑制增殖，并且在其他情况下促进细胞存活13，25，26。为了区分这些可能性，测量在用抗Notch4抗体培养的细胞中的生活力。暴露于抗体2天后，T1克隆生成癌细胞的细胞死亡显著增加，但是T4克隆生成癌细胞的细胞死亡不显著增加(图3a，3b)。有足够的T1、T4和T5肿瘤细胞用于进一步分析来确定Notch4信号传导诱导细胞死亡的机理。从T1分离到的克隆生成癌细胞暴露于抗Notch4阻断抗体导致T1致瘤癌细胞的积累，所述细胞具有凋亡的降解的DNA特征(图3a)。与对照培养物比较，抗体暴露后36小时，在T1和T5克隆生成癌细胞中，但非T4克隆生成癌细胞中具有激活的胱天蛋白酶3/7的细胞数目显著增加(图3b)。这些数据表明在一亚类的人乳腺肿瘤中，Notch途径活化为致瘤细胞群提供了必要的存活信号。
可以通过受体介导的(外在的)途径或者线粒体(内在的)途径抑制程序性细胞死亡。不幸的是，对稀少的致瘤癌细胞进行详细的分子和生物化学分析在当前技术上是不可能的。因此，得到了依赖Notch信号传导存活的乳腺细胞系。MCF-7细胞表达Notch4(图2b)，dnMAML1腺病毒和抗Notch4抗体都杀死这些细胞(图3a、3c和3d)。如对于直接从肿瘤分离的细胞的情况，Notch信号传导的抑制导致MCF-7细胞中胱天蛋白酶的活化(图3b)。为了确定细胞死亡是否通过内在或者外在的细胞死亡途径，使用表达显性失活(dn)FADD或者Bcl-XL的MCF-7细胞，分别导致内在和外在死亡途径的抑制(图3e)27，28。当用dnMAML1腺病毒感染时，Bcl-XL而不是dnFADD保护MCF-7细胞免于凋亡(图3c和3d)。这些结果表明Notch信号传导保护癌细胞免于通过线粒体死亡途径的凋亡。
Notch信号传导是复杂的。有多种Notch和Notch配体以及修饰这些Notch来调节信号传导的几种Fringe。正常组织中干细胞和它们的祖细胞后代对Notch信号传导途径的多种成员的差别表达在干细胞命运决定中起关键作用11，15，29。因为T4致瘤和非致瘤癌细胞对Notch4的差别表达提示在肿瘤中可能发生相似的情况，所以进行实验来确定其他Notch途径基因是否在不同的癌细胞群体中差别表达。为了鉴定从不同患者分离的乳腺癌细胞中的Notch信号传导途径组分，用定量RT-PCR检查来自5个肿瘤中每一个的癌细胞对Notch、Notch配体和Fringe的表达。在所有肿瘤中都检测到一种或多种Notch的表达(表1)。在一些正常组织中，基质细胞或者分化的后代表达Notch配体，其提供在干细胞中活化Notch的旁分泌信号3，11，30。在正常组织中通过表达三种Fringe蛋白质即Manic、Lunatic和Radical进一步调节Notch信号传导。每种Fringe都差别地糖基化特定Notch受体并且调节受体信号传导29，31，32。因此进行实验来确定致瘤和非致瘤癌细胞在它们的Notch配体和/或Fringe蛋白的表达中是否不同。为了完成该实验，用从分离自T1和T4的2000个致瘤癌细胞和2000个非致瘤癌细胞1中分离的RNA进行定量RT-PCR(图4)。与T1致瘤细胞相比，在T1非致瘤细胞中Notch配体Delta1和Delta4的表达高三倍，而在两个群体中Jagged1表达相同(表1)。类似地，T4非致瘤细胞比致瘤癌细胞表达高3倍的水平的Notch配体Delta1和Jagged1，而在任一群体中都没有检测到Delta3和Delta4的表达(表1)。
因为多数肿瘤由非致瘤癌细胞组成1并且这些细胞比致瘤癌细胞表达更高水平的Notch配体，所以这些数据提示非致瘤癌细胞为致瘤癌细胞提供存活信号。当通过定量RT-PCR检查时，在检查的两种肿瘤中检测到致瘤细胞而不是非致瘤细胞的Manic Fringe表达(表1)。相反地，在两个肿瘤中检测到非致瘤细胞而不是致瘤细胞的LunaticFringe和Radical Fringe的表达(表1)。这些数据是重要的，因为Manic Fringe的强迫表达与致癌转化有关33，并且在微阵列分析中，正常干细胞中Manic Fringe表达最高34。
最近观察到Bmi-1癌基因调节正常的造血干细胞和白血病细胞的自我更新，该观察将自我更新途径与癌症紧密相连8，35。因为正常干细胞和肿瘤中的一亚类癌细胞都具有自我更新的基本能力，所以可能正常干细胞和致瘤癌细胞共有自我更新途径。因此，调节癌细胞中自我更新的途径的鉴定对于我们对这些疾病的理解是关键的。
上面的实验提供了致瘤细胞相对于非致瘤细胞特异的多种有区别的生物学标记，允许人们表征样品的特性，通过治疗介入靶定，和有助于选择和监视疗法、药物筛选应用和研究应用。
治疗剂 可以通过任何有效方法施用含有根据本发明的肿瘤发生调节剂的药物组合物。例如，可以通过任何有效方法施用Notch配体、抗Notch抗体或者作为Notch信号转导/应答途径中蛋白质的激动剂或者拮抗剂的其他治疗剂。例如，含有有效浓度的抗Notch治疗剂的生理上适宜的溶液可以局部地、眼内、肠胃外、经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下或者通过任何其他有效方式施用。具体地，抗Notch治疗剂可以通过针头以有效治疗靶组织的肿瘤细胞的量直接注射到靶癌或者肿瘤组织中。备选地，体腔如眼睛、胃肠道、尿生殖道(例如，膀胱)、肺和支气管系统等等中存在的癌或者肿瘤可以接受生理上适宜的含有有效浓度的抗Notch治疗剂的组合物(例如，无菌的溶液，如盐水或者磷酸盐缓冲液、悬浮液或者乳液)，这可以通过用针头直接注射或者通过置于受到癌或者肿瘤折磨的中空器官中的导管或者其他递送管来进行。任何有效成像装置，如X射线、声波图或者纤维光学显像系统可以用于定位靶组织和引导针头或者导管。在另一备选方法中，含有有效浓度的抗Notch治疗剂的生理上适宜的溶液可以全身性地施用到血流中以治疗不能直接到达或者不能解剖上分离的癌或者肿瘤。
所有这些操作的共同目的是将抗Notch治疗剂与靶肿瘤足够接触以允许抗Notch治疗剂接触、转导或者转染肿瘤细胞(取决于治疗剂的性质)。在一个实施方案中，中空器官的上皮衬层中存在的实体瘤可以通过向中空的充满流体的器官中输注入载体悬浮液或者通过向中空的充满气体的器官中喷雾或雾化来治疗。从而，肿瘤细胞(如实体瘤干细胞)可以存在于肺支气管树的衬层的上皮组织、胃肠道的衬层、女性生殖道的衬层、尿生殖道、膀胱、胆囊或者易受到与抗Notch治疗剂接触的影响的任何其他器官组织中或者中间。在另一实施方案中，实体瘤可以位于中枢神经系统的衬层中或者上面，例如，脊髓、脊髓根或者脑，从而输注入脑脊液中的抗Notch治疗剂与该空间中的实体瘤细胞接触并转导。(因此，用本领域的方法可以修饰抗Notch治疗剂以穿过血脑屏障)。肿瘤学领域的技术人员可以明白，可以通过将载体悬浮液直接注射到肿瘤中对实体瘤施用抗Notch治疗剂，从而，抗Notch治疗剂接触并影响肿瘤内的肿瘤细胞。
通过本发明鉴定的致瘤细胞还可以用于产生抗癌细胞抗体。在一个实施方案中，该方法包括得到致瘤细胞的富集群体或者分离的致瘤细胞；处理该群体以防止细胞复制(例如，通过放射)；并以有效诱导对实体瘤干细胞的免疫应答的量对人或者动物受试者施用所述经处理的细胞。关于要注射或者经口施用的细胞的有效剂量，见美国专利号6,218,166、6,207,147和6,156,305，将其引入本文作为参考。在另一实施方案中，该方法包括得到实体瘤干细胞的富集群体或者分离的实体瘤干细胞；将体外培养物中的肿瘤干细胞与来自人受试者或者宿主动物的免疫效应细胞混合(根据本领域已知的免疫学方法)，将要在所述人受试者或者宿主动物中产生抗体；从培养物取出免疫效应细胞；并以有效刺激动物中免疫应答的剂量对宿主动物移植所述免疫效应细胞。
在一些实施方案中，治疗剂是抗体(例如，抗Notch4抗体)。可以用通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术制备单克隆抗体。这些技术包括，但不限于，杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(见，例如，Kozbor，D.等人，J.Immunol.Methods8131-42(1985)；Cote R J等人，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030(1983)；和Cole S P等人，Mol.Cell Biol.62109-120(1984))。
此外，可以使用为产生“嵌合抗体”而开发的技术，如将小鼠抗体基因剪接到人抗体基因而得到具有合适的抗原特异性和生物活性的分子(见，例如，Morrison S L等人，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855(1984)；Neuberger M S等人，Nature 312604-608(1984)；和Takeda S等人，Nature 314452-454(1985))。
多种免疫测定法可以用于筛选以鉴定具有所希望的特异性的抗体。使用具有确定的特异性的多克隆或者单克隆抗体的竞争性结合或者免疫放射分析的许多方案是本领域公知的。
抗体还可以是人源化抗体。本文所用术语“人源化抗体”指这样的抗体分子，即其中非抗原结合区中的氨基酸序列已经改变从而抗体更像人抗体，并且仍然保持它的最初结合能力。抗体经人源化从而它们的免疫原性更低并且因此当治疗性地施用于患者时能坚持更长时间。
可以用来自Abgenix(Fremont，Calif，USA)的XENOMOUSE技术产生人抗体，该技术使得可以产生和选择适于抗体治疗的基本上任何疾病靶标的高亲和力的完全人抗体产物候选物。见，美国专利号6,235,883、6,207,418、6,162,963、6,150,584、6,130,364、6,114,598、6,091,001、6,075,181、5,998,209、5,985,615、5,939,598和5,916,771，将每个专利都引入作为参考；Yang X等人，Crit Rev OncolHemato 38(1)17-23(2001)；Chadd H E & Chamow S M.Curr OpinBiotechnol 12(2)188-94(2001)；Green L L，Journal ofImmunological Methods 231 11-23(1999)；Yang X-D等人，CancerResearch 59(6)1236-1243(1999)；和Jakobovits A，AdvancedDrug Delivery Reviews 3133-42(1998)。用遗传工程化的小鼠品系产生具有完全人蛋白质序列的抗体，在所述小鼠品系中，小鼠抗体基因表达受到抑制并且被人抗体基因表达功能性地置换，而同时保持小鼠免疫系统的剩余部分完整。此外，针对本发明的存在于致瘤细胞中或者上面的标记的抗体的产生可以用作鉴定药物开发靶标的方法。
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗肿瘤发生的治疗剂与其他抗肿瘤疗法共同施用。多种治疗剂可以用于本发明。可以与本发明的药剂共同施用或者与本发明的药剂联合的任何治疗剂都适宜用于本发明的方法中。
本发明的一些实施方案提供了施用本发明的治疗化合物和至少一种另外的治疗剂(例如，包括，但不限于，化学治疗抗肿瘤剂、抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂和消炎剂)的方法(治疗方法、研究方法、药物筛选方法)和/或治疗技术(例如，外科手术、放射疗法)。
计划将多种类别的抗肿瘤(例如抗癌)剂用于本发明的某些实施方案中。适于用于本发明的抗癌剂包括，但不限于，诱导凋亡的抗癌剂，抑制腺苷脱氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤环生物合成、抑制核苷酸互变、抑制核糖核苷酸还尿酶、抑制胸苷一磷酸(TMP)合成、抑制二氢叶酸还原、抑制DNA合成、与DNA形成加合物、破坏DNA、抑制DNA修复、嵌入DNA、使天冬酰胺脱氨、抑制RNA合成、抑制蛋白质合成或者稳定性、抑制微管合成或者功能的抗癌剂，等等。
在一些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的示例性抗癌剂包括，但不限于1)生物碱类，包括微管抑制剂(例如，长春新碱、长春碱和长春地辛等等)，微管稳定剂(例如，紫杉醇(TAXOL)、和多西他赛，等等)，和染色质功能抑制剂，包括拓扑异构酶抑制剂，如表鬼臼毒素类(例如，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等等)，和靶定拓扑异构酶I的抗癌剂(例如，喜树碱和isirinotecan(CPT-11)，等等)；2)共价DNA结合剂(烷基化剂)，包括氮芥类(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺和白消安(MYLERAN)，等等)，亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀)，和其他烷基化剂(例如，达卡巴嗪、羟甲基蜜胺、塞替派和丝裂霉素，等等)；3)非共价DNA结合剂(抗肿瘤抗生素)，包括核酸抑制剂(例如，更生霉素(放线菌素D)，等等)，蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(道诺霉素和正定霉素)、多柔比星(阿霉素)和伊达比星(去甲氧柔红霉素)，等等)、蒽二酮类(例如，蒽环类抗生素类似物，如米托蒽醌，等等)，博来霉素(BLENOXANE)，等等，和普卡霉素(光辉霉素)等等；4)抗代谢物，包括抗叶酸剂(例如，氨甲喋呤、FOLEX、和MEXATE，等等)，嘌呤抗代谢物(例如，6-巯基嘌呤(6-MP，PURINETHOL)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、无环鸟苷、更昔洛韦、氯代脱氧腺苷、2-氯代脱氧腺苷(CdA)和2’-脱氧助间型霉素(喷司他丁)等等)，嘧啶拮抗剂(例如，氟嘧啶类(例如，5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脱氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))等等)，和阿糖胞苷类(例如，CYTOSAR(ara-C)和氟达拉滨，等等)；5)酶，包括L-天冬酰胺酶，和羟基脲，等等；6)激素，包括糖皮质激素类，抗雌激素药(例如，他莫昔芬，等等)，非类固醇抗雄激素药(例如，氟他胺，等等)，和芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑(ARIMIDEX)，等等)；7)铂化合物(例如，顺铂和卡铂等等)；8)缀合抗癌药物、毒素和/或放射性核素的单克隆抗体，等等；9)生物反应修饰剂(例如，干扰素(例如，IFN-α等等)和白介素(例如，IL-2，等等)，等等)；10)过继免疫治疗；11)造血生长因子；12)诱导肿瘤细胞分化的治疗剂(例如，全反式视黄酸，等等)；13)基因治疗技术；14)反义治疗技术；15)肿瘤疫苗；16)针对肿瘤转移的疗法(例如，巴马司他，等等)；17)血管发生抑制剂；18)蛋白体抑制剂(例如，VELCADE)；19)乙酰化和/或甲基化抑制剂(例如，HDAC抑制剂)；20)NFκB的调节剂；21)细胞周期调节的抑制剂(例如，CDK抑制剂)；22)p53蛋白功能的调节剂；和23)放射。
常规用于癌症治疗背景中的肿瘤消解剂可以用于本发明的组合物和方法。例如，美国食品和药品管理局(U.S.Food and DrugAdministration)维持了批准在美国使用的肿瘤消解剂的药品集。美国FDA的国际上的对应机构维持了相似的药品集。表X提供了批准在美国使用的一组示例性抗肿瘤剂。本领域技术人员将明白在所有美国批准的化学治疗剂上的“产品标签”描述了对于示例性治疗剂的批准的适应症、给药信息、毒性数据等等。
抗微生物治疗剂也可以用作本发明中的治疗剂。可以使用可以杀死、抑制或者减弱微生物生物体的功能的任何治疗剂，以及预期具有此类活性的任何治疗剂。抗微生物剂包括，但不限于，单独或者组合使用的天然和合成的抗生素、抗体、抑制性蛋白质(例如，防卫素)、反义核酸、膜破坏剂等等。实际上，可以使用的任何类型的抗生素包括，但不限于，抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂，等等。
在另一实施方案中，本发明提供了与能够特异靶向特定细胞类型(例如，肿瘤细胞)的靶向剂结合的本发明化合物(和任何其他化学治疗剂)。通常，与靶向剂结合的治疗化合物通过靶向剂与经受体介导的内吞作用被摄入细胞的细胞表面部分相互作用而靶向赘生性细胞。
已知位于靶细胞(例如，肿瘤细胞)表面上的任何部分可以用于本发明。例如，针对此类部分的抗体将本发明的组合物靶向含有所述部分的细胞表面。备选地，靶向部分可以是导向细胞表面上存在的受体的配体，或者反之亦然。类似地，也可以用维生素将本发明的治疗剂靶向特定细胞。
本文所用的术语“靶向分子”指用于将治疗化合物靶向目标细胞、组织或者器官的化学部分，和其部分。预期多种类型的靶向分子用于本发明，包括，但不限于，信号肽、抗体、核酸、毒素等等。靶向部分可以额外促进化合物(例如，小分子)的结合或者化合物进入靶定的细胞、组织和器官。优选地，根据靶向部分在将连接的化合物选择性地递送到受试者、组织或者细胞，包括特定亚细胞位置和细胞器内的靶定位点中的特异性、亲和性和功效来选择靶向部分。
多种效率问题影响所有药物，尤其高度细胞毒性药物(例如，抗癌药物)的施用。一个尤其重要的问题是确保施用的治疗剂仅影响靶定的细胞(例如，癌细胞)、组织或者器官。高度细胞毒性的药剂向非靶定的细胞的非特异或者非希望的递送可以导致严重的毒性问题。
已经进行了许多尝试来设计药物靶向方案以处理与非特异性药物递送有关的问题(见，例如，K.N.Syrigos和A.A.EpenetosAnticancer Res.，19606-614(1999)；Y.J.Park等人，J.Controlled Release，7867-79(2002)；R.V.J.Chari，Adv.DrugDeliv.Rev.，3189-104(1998)；和D.Putnam和J.Kopecek，Adv.Polymer Sci.，12255-123(1995))。靶向部分如抗体和配体肽(例如，内皮细胞的RDG)与药物分子的缀合已经用于减轻与特定药物有关的一些并行毒性问题。然而，仅将药物与靶向部分缀合不能完全消除对非靶定细胞的潜在副作用，因为药物通常在它们到达靶细胞的途中是生物活性的。靶定部分-前体药物缀合物的发展已经减少了这些方面的一些问题，所述靶定部分-前体药物缀合物在到达特定的靶定组织的途中是无活性的。生物转化，如酶切割通常将前体药物在靶位点转化成生物活性分子。
因此，在一些优选实施方案中，本发明提供了前体药物缀合物，其在到达它们的靶位点前是无活性的，在靶位点它们随后被转化成活性的治疗药物分子。ADEPT和ATTEMPTS是与本发明的某些实施方案相容的两种示例性前体药物递送系统。(见K.N.Syrigos和A.A.Epenetos，Anticancer Res.，19606-614(1999)；K.D.Bagshawe，Brit.J.Cancer，56531-532(1987)；Y.J.Park等人，J.Controlled Release，72145-156(2001)；和Y.J.Park等人，J.Controlled Release，7867-79(2002))。
某些类型的治疗剂，特别是水溶性低分子量药剂从受试者的血流中的快速清除造成了有效的小分子施用的另一个障碍。其他障碍来自施用的药剂的快速清除(例如，蛋白水解降解)或者潜在的免疫原性。
在天然系统中，受试者中小分子(例如，药物)的清除和其他药物动力学行为受到一系列转运蛋白的调节。(见，例如，H.T.Nguyen，Clin.Chem.Lab.Anim.，(2nd Ed.)pp.309-335(1999)；和G.J.Russel1-Jones和D.H.Alpers，Pharm.Biotechnol.，12493-520(1999))。从而，在优选实施方案中，当测试和开发潜在治疗剂时，考虑了治疗剂的药物动力学。
受试者中药剂清除的速率通常是可控制的。例如，将药剂附着(例如，结合)到大分子载体上通常可延长循环和滞留时间。因此，本发明的一些实施方案提供了缀合至聚乙二醇(PEG)或者相似生物聚合物的小分子，以减小(防止)分子的降解和改善它在受试者的血流中的滞留。(见，例如，R.B.Greenwald等人，Critical Rev.TherapeuticDrug Carrier Syst.，17101-161(2000))。PEG阻碍蛋白质-蛋白质相互作用的能力可以减小许多药物的免疫原性。
影响某些治疗剂，特别是亲水和大分子药物，如肽和核酸的施用的另一问题是这些药剂难以穿过靶向的细胞膜。小的(通常小于1,000道尔顿)疏水分子进入靶细胞膜的困难较小。此外，低分子量细胞毒性药物通常更有效地定位在正常组织而不是靶组织如肿瘤中(K.Bosslet等人，Cancer Res.，581195-1201(1998))，这是由于在快速生长的肿瘤中高间隙压和不利的血流性质(R.K.Jain，Int.J.Radiat.Biol.，6085-100(1991)；和R.K.Jain和L.T.Baxter，Cancer Res.，487022-7032(1998))。
某些实施方案，特别是涉及递送细胞毒性剂的实施方案利用一种或多种下面的方法或者组合物来帮助递送本发明的治疗组合物微注射(见，例如，M.Foldvari和M.Mezei，J.Pharm.Sci.，801020-1028，(1991))；刮擦加载(scrape loading)(见例如，P.L.McNeil等人，J.Cell Biol.，981556-1564(1984))；电穿孔(见例如，R.Chakrabarti等人，J.Biol.Chem.，2615494-15500(1989))；脂质体(见例如，M.Foldvari等人，J.Pharm.Sci.，801020-1028(1991))；和J.N.Moreira等人，Biochim Biophys Acta.，515167-176(2001))；纳米载体，如水溶性聚合物(例如，增强的渗透和滞留″EPR″，见例如，H.Maeda等人，J.Controlled Release，65271-284(2000)；H.Maeda等人，同上；和L.W.Seymour，Crit.Rev.Therapeu.Drug Carrier Systems，9135-187(1992))；细菌毒素(见例如，T.I.Prior等人，Biochemistry，313555-3559(1992)；和H.Stenmark等人，J.Cell Biol.，1131025-1032(1991))；受体介导的内吞作用和吞噬作用，包括肿瘤激活的前体药物(TAP)系统(见例如，R.V.J.Chari，Adv.Drug Deliv.Rev.，3189-104(1998)；I.Mellman，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，12575-625(1996)；C.P.Leamon和P.S.Low，J.Biol.Chem.，267(35)24966-24971(1992)；H.Ishihara等人，Pharm.Res.，7542-546(1990)；S.K.Basu，Biochem.Pharmacol.，401941-1946(1990)；和G.Y.Wu和C.H.Wu，Biochemistry，27887-892(1988))；其他适宜的组合物和方法是本领域已知的。
所述化合物和抗癌剂可以在任何无菌、生物相容的药物载体中施用，所述药物载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以含有一种药剂(例如，抗体)。在其他实施方案中，药物组合物含有至少两种药剂的混合物(例如，抗体和一种或多种常规抗癌剂)。在其他实施方案中，本发明的药物组合物含有至少两种药剂，它们在一种或多种下面的条件下施用于患者以不同的周期，以不同的持续时间，以不同浓度，通过不同施用途径，等等。在一些实施方案中，在施用抗癌剂之前，例如，在施用抗癌剂0.5、1、2、3、4、5、10、12、或18小时、1、2、3、4、5、或6天、1、2、3或4周之前施用治疗化合物。在一些实施方案中，在施用抗癌剂之后，例如，在施用抗癌剂0.5、1、2、3、4、5、10、12、或18小时、1、2、3、4、5、或6天、1、2、3或4周之后施用治疗化合物。在一些实施方案中，治疗化合物和抗癌剂在同时施用但是以不同的时间安排施用，例如，治疗化合物每天施用，而抗癌剂每周一次，每两周一次，每三周一次，或者每四周一次施用。在其他实施方案中，每周一次施用治疗化合物，而每天，每周一次，每两周一次，每三周一次，或者每四周一次施用抗癌剂。
取决于所治疗的状况，配制并全身或者局部施用本发明药物组合物的优选实施方案。配制和施用技术可以见″Remington′sPharmaceutical Sciences″(Mack Publishing Co，Easton Pa.)的最新版本。合适的途径可以例如，包括经口和经粘膜施用，以及肠胃外递送(例如，肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或者鼻内施用)。
根据可接受的药物递送方法和制备技术，本发明计划施用治疗化合物，在一些实施方案中，施用一种或多种常规抗癌剂。例如，治疗化合物和适宜的抗癌剂可以在可药用载体如生理盐水中静脉内施用于受试者。考虑了用于药物试剂的细胞内递送的标准方法(例如，通过脂质体递送)。此类方法是本领域技术人员公知的。
在一些实施方案中，本发明的制剂用于肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、肌内、髓内和腹膜内)。施用基因治疗试剂和技术也可以完成某些所考虑的抗癌剂(例如，治疗性多肽)的治疗性共同施用。
在本发明的一些实施方案中，将治疗化合物单独或者与一种或者多种常规抗癌剂(例如，核苷酸序列、药物、激素等等)组合或者以药物组合物施用于受试者，在所述药物组合物中，组分任选与赋形剂或者其他可药用载体混合。在本发明的优选实施方案中，可药用载体是生物学上惰性的。在优选实施方案中，用本领域公知的可药用载体以适于经口施用的剂量配制本发明的药物组合物。这样的载体使得可以将药物组合物配制成片剂、丸剂、胶囊剂、糖锭剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、溶液剂、混悬剂等等，用于受试者分别口服或者经鼻摄入。
通过将活性化合物与固体赋形剂组合，任选碾磨所得混合物，并且如果希望，在加入合适的辅料后将混合物加工成颗粒以得到片剂或者糖锭剂核心，可以得到用于经口施用的药物制剂。适宜的赋形剂是糖类或者蛋白质填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或者山梨醇；玉米、小麦、大米、马铃薯等等的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或者羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯树胶和西黄蓍胶；和蛋白质，如明胶和胶原。如果希望，可以加入崩解剂或者增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或者其盐如藻酸钠。
对于注射，可以将本发明的药物组合物在水性溶液中配制，优选生理上相容的缓冲液，如Hanks溶液、林格溶液或者生理缓冲盐水。对于组织或者细胞施用，使用对于待透过的特定屏障合适的渗透剂。此类渗透剂是本领域技术人员已知的。
适宜用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以实现预期目的的组合物。药剂的有效量的确定完全在药理学领域技术人员的技术范围之内，特别是考虑到本文提供的公开内容时尤其如此。
除了活性成分外，优选的药物组合物还可以含有适宜的可药用载体，包括赋形剂和辅料，其有助于将活性化合物加工成药学上的有用形式。
可以用制备药物组合物的任何可接受的技术生产本发明的药物组合物，这些技术包括，但不限于，通过常规混合、溶解、粒化、制糖锭剂、磨细、乳化、包胶、陷入或者冻干方法，等等。
本组合物的可摄入的制剂可以还包括美国农业部(United StatesDepartment of Agriculture)批准的可以包括在食品中的任何材料和通常认为安全(GRAS)的物质，如食品添加剂、调味剂、着色剂、维生素、矿物质，和植物营养素(phytonutrients)。本文所用的术语植物营养素指从植物分离的具有生物学作用的有机化合物，其包括但不限于，下面类别的化合物异黄酮类、寡聚原花色素、吲哚-3-甲醇、sulforaphone、纤维配基、植物固醇、阿魏酸、anthocyanocides、三萜类、ω3/6脂肪酸、聚乙炔、醌类、萜类、cathechins、没食子酸和栎精。
将合适的包衣，如浓缩的糖溶液提供给糖锭剂核心，所述包衣还可以含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、紫胶漆溶液、和适宜的有机溶剂或者溶剂混合物。可以将染料或者色素加入片剂或者糖锭剂包衣中以用于产品识别或者表征活性化合物的量(即，剂量)。
计划用于经口施用的药物制剂包括明胶制造的轻压配合胶囊以及明胶和包衣如甘油或者山梨醇的密封软胶囊。在一些实施方案中，轻压配合胶囊可以含有与填充剂或者黏合剂如乳糖或者淀粉，润滑剂如滑石或者硬脂酸镁，和任选地稳定剂混合的活性成分。在一些软胶囊实施方案中，活性化合物溶解或者悬浮在适宜的液体或者溶剂，如脂肪油、液体石蜡或者液态聚乙二醇中，其中使用或者不用稳定剂。
用于肠胃外施用的药物制剂包括活性化合物的水溶液。水性注射混悬剂任选含有增加混悬剂的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或者葡聚糖。此外，活性化合物的混悬剂可以制备成合适的油性注射混悬剂。在该方面，适宜的亲脂溶剂或者载体包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。任选地，混悬剂含有适宜的稳定剂或者增加化合物的稳定性从而允许制备高度浓缩溶液的物质。
在优选实施方案中，临床医生或者药理学领域的其他技术人员基于公知的药学和治疗上的因素定制给药和施用方案，所述因素包括，但不限于，所希望的治疗效果的水平，和可以得到的治疗效果的实际水平。通常，合适的是按照施用化学治疗剂的公知的药理学原则(例如，通常合适的是偶而和只是每3-4个药剂半寿期不改变剂量50％以上)。对于具有相对较小或者没有剂量相关的毒性因素的组合物，并且其中希望得到最大功效(例如，癌细胞的破坏)的情况，超过平均需要的剂量的剂量并不是罕见的。该给药方法通常称作“最大剂量”策略。
另外的给药因素涉及对于正在施用的药剂计算正确的目标水平、药剂的积累和潜在毒性、抗性的刺激、功效的缺乏、和描述药剂的治疗指数范围。
在某些实施方案中，本发明考虑使用滴定药剂的施用的常规方法。一种常见的施用策略是对受试者中的药剂设置合理的目标水平。在一些优选实施方案中，测量受试者的血浆中的药剂水平。然后设计适当的剂量水平和频率以对该药剂实现希望的稳态目标水平。监视(例如，每小时、每天、每周等等)受试者中该药剂的实际或者平均水平，从而可以调节给药水平或者频率以保持目标水平。当然，正在施用的特定药剂的药物动力学和药效动力学(例如，生物利用率、清除和生物积累、生物分布、药物相互作用，等等)可以潜在影响所考虑的合理的目标水平，从而影响给药水平或者频率。
目标水平给药方法通常依赖于建立按照受试者中的药剂的希望范围(或者治疗范围)定义的合理的治疗目的。通常，治疗范围的下限大体等于提供约50％最大可能的治疗效果的药剂浓度。治疗范围的上限通常由药剂的毒性而不是其功效确定。本发明考虑，特定药剂的治疗范围的上限将是小于5％或10％的受试者表现出毒副作用时的浓度。在一些实施方案中，治疗范围的上限为下限的约2倍或以下。本领域技术人员将理解这些给药因素是高度可变的并且在一定程度上是个体特异的(例如，基于遗传素质、免疫学因素、耐受性、抗性，等等)。从而，在一些实施方案中，特定受试者中药剂的有效目标给药水平可以比另一受试者中的最佳水平大1，...5，...10，...15，...20，...50，...75，...100，...200，...X％。相反地，以比在一些或者多数受试者中通常产生最佳治疗水平的给药水平或者频率小得多(1，...5，...10，...15，...20，...50，...75，...100，...200，...X％)的给药水平或者频率，一些受试者可能遭受严重的副作用和毒性相关的健康问题。不存在更具体的信息时，目标施用水平通常设置在治疗范围的中间。
在另外的实施方案中，本发明提供了间歇给药方法，因为给药之间药剂浓度的显著波动通常是不希望的。在药剂的吸收和分布得到平衡并且是自发的条件下，由药剂的消除半寿期决定浓度波动。
在其中施用的组合物相对无毒的实施方案中，可以使用最大给药方法，因为甚至几倍于确保治疗功效所需剂量的药剂浓度也可以良好耐受。在这些实施方案中，给药间隔延长，从而在从受试者中清除并且需要额外施用以将药剂的水平恢复到治疗有效范围之前，受试者的系统中药剂的浓度在治疗有效性范围内保持相对较长的时间。从而，在这些实施方案的一些方案中，给药间隔长于药剂的清除半寿期。
在其他实施方案中，当组合物具有相对窄的治疗范围时，计算在特定给药间隔下将发生的最大和最小浓度是重要的。在优选实施方案中，施用的药剂的最小稳态浓度用方程确定，任选对药剂的生物利用率进行校正，其是药理学领域技术人员公知的。
在其他实施方案中，当药剂遵循多指数动力学并且经口施用药剂时，最大稳态浓度的估计涉及处理与药剂分布和吸收有关的几个指数常数。
本发明还提供了对受试者施用负荷剂量的一种或多种药剂的方法。本文所用的“负荷剂量”是一种或一系列剂量，其当在治疗开始时给予时快速提供治疗剂的目标浓度。在一些实施方案中，相对于得到使用恒定速度施用所提供的药剂的稳态目标水平所需的时间，对立即需要目标水平的药剂的受试者施用负荷剂量。应该在施用前对患者状况的紧迫性和她对负荷剂量的需要权衡多种负面因素。这些因素包括，但不限于1)负荷剂量通常以一个大的快速浓注施用，其可以使患者突然暴露于毒性浓度的药剂；2)具有长半寿期的药剂与以较低恒速方案施用的药剂相比将保持在高于目标水平的水平上。负荷剂量通常是大、快速和肠胃外给予的，从而，在药剂可以在受试者的血浆中得到平衡之前，可能在施用部位发生危险的副作用。
在优选实施方案中，临床医生基于已知的药理学原理和方程合理地设计个体化的给药方案。通常，临床医生基于药剂的多种药理学和药物动力学性质的知识设计个体化的给药方案，所述性质包括但不限于，F(剂量的相对生物利用率(fractional bioavailability of thedose))、Cp(血浆中的浓度)、CL(清除/清除速率)、Vss(稳态下药物分布的体积)、Css(稳态时的浓度)和t1/2(药物半寿期)，以及关于药剂的吸收速率和分布的信息。关于这些变量的进一步解释和阐明个体化给药方案的计算的完整方程，本领域技术人员可以参考许多公知的药理学教材(例如，Goodman和Gilman′s，Pharmaceutical Basis ofTherapeutics，第10版，Hardman等人，编著，2001)。本领域技术人员将能够预测个体受试者中这些变量可能的波动。例如，F、CL和Vss的观察值的标准差通常分别为约20％，50％和30％。各受试者中可能变化很大的参数的实际效果是，受试者中获得Css的时间的95％在获得目标水平的时间的35到270％之间。对于具有低治疗指数的药物，这不希望地是一个宽范围。然而，本领域技术人员将理解，一旦测量了药剂的Cp(血浆中的浓度)，那么可能直接估计F、CL和Vss的值。这允许临床医生有效而精确地调整具体受试者的给药方案。
在其他实施方案中，本发明计划用连续治疗药物监视技术进一步调节个体的给药方法和方案。例如，在一个实施方案中，用Css数据进一步完善CL/F的估计和随后使用已知的药理学原理和方程来调节个体的维持给药以实现所希望的药剂目标水平。在给药时间表期间可以实际上在任何时间进行治疗药物监视。在优选实施方案中，在给药期间，特别当施用间歇剂量时在多个时间点进行监视。例如，可以不管所用的给药方法(例如，间歇给药、负荷剂量、维持给药、随机给药或者任何其他给药方法)，在药剂施用的一秒、数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月等等内相伴地进行药物监视。然而，本领域技术人员将理解，当药剂施用后快速采样时，药剂效果和动力学的改变可能不易观察到，因为药剂的血浆浓度的改变可能延迟(例如，由于缓慢的分布速率或者其他药效动力学因素)。因此，药剂施用后短时间内得到的受试者样品可能具有有限或者降低的价值。
在预测的施用的稳态目标水平期间从受试者收集生物样品的主要目的是根据随后对药剂的CL/F比的经校正的估计值进行计算来修改该个体的给药方案。然而，本领域技术人员将理解早期吸收后药物浓度通常不反映药剂清除。早期吸收后药物浓度主要由药剂的吸收速率、药剂分布的中心体积而不是稳态体积、和分布的速率决定。当计算治疗性长期维持给药方案时，这些药物动力学特征每种都有有限的价值。
因此，在优选实施方案中，当目的是治疗性长期维持给药时，正好在施用以前的剂量后，甚至更优选在施用接下来的计划剂量之前不久从目标受试者、细胞或者组织得到生物样品。
在其他实施方案中，在给药之间的时间间隔中，治疗剂几乎完全被受试者清除，因而本发明计划在前面的施用后，最优选在剂量施用后不久的多个时间点从受试者收集生物样品。
在另外的实施方案中，当药剂的低清除率成为问题，并且毒性问题可能来自它的积累时，本发明计划在施用随后剂量之前即刻测量药剂浓度。在这些实施方案中，优选测定最大和最小药剂浓度。
本发明的方法还计划当施用恒定的维持剂量时，仅在四个药剂半寿期期满后达到稳态。给药后太快收集的样品不能准确反映药剂清除。然而，对于可能高毒性的药剂，在药剂的第四个半寿期期满前可能已经发生了严重毒性和损害。从而，在一些情况中，当重要的是保持对药剂浓度的控制时，假定没有施用负荷剂量，在两个半寿期后采集第一个样品。如果药剂浓度已经超过了最终预期的平均稳态浓度的90％，那么将给药率减半，在另外的两个半寿期后得到另一样品。如果该样品再次超过目标水平，那么该剂量再次减半。如果第一种浓度不超过耐受极限，那么随后的施用以最初给药率进行。如果浓度低于预期值，那么可能可以在约2个半寿期内实现稳态，这时可以如本文描述的来调节给药率。
在包含间歇剂量的实施方案中，与浓度信息收集的时间选择有关的额外考虑是，如果在下一个预定的剂量前即刻得到样品，那么浓度将为最小值，而不是平均值；然而，如本文讨论的，可以使用药理学领域中已知的方程计算估计的平均浓度。
当施用具有一级动力学的治疗剂时，稳态时的平均、最小和最大浓度与剂量和给药率线性相关。从而，在这些实施方案中，测量的和期望的药剂浓度之间的比用于调节给药。
在本发明的另一方面，计算机程序可帮助设计给药方案。通常，这些计算机程序考虑测量的药物浓度和与个体受试者有关的多种因素(例如，测量的或者预测的因素)。
本发明不限于对收集受试者、组织、细胞培养物或者动物药物施用数据或者样品的任何特定的时间限制。而且，本发明不限于从受试者、组织、细胞培养物或者试验动物实验室动物等收集任何特定类型的样品(例如，生物样品)。实际上，在一些实施方案中，本发明计划获得生物样品，其包括，但不限于，多核苷酸、多肽、脂类、糖类、糖脂、离子种类、代谢物、无机分子、大分子、和大分子前体，以及细胞级分、血液(例如，细胞和可溶性或不溶性血液组分，包括，但不限于，血浆、血清、代谢物、因子、酶、激素、和有机或者无机分子)、渗出液、分泌物、痰、排泄物、细胞和组织活组织检查物、CNS液体(脑脊液)、泪腺、唾液腺和其他腺体的分泌物、精液，等等，和这些或任何其他亚细胞的、细胞的、组织的、器官的(organismal)、系统的或者生物体的生物材料的组合。可以对从受试者得到的生物样品就施用治疗剂导致的化学或者生物化学改变(例如，基因表达的改变)或者其他效应进行分析。下面描述了其他生物样品和采样考虑。
在这些实施方案的一些中，对收集的样品用常规实验室方法来确定治疗组合物的生物学和药理学效应，所述方法包括但不限于，显微术(例如，光学的、荧光(共聚焦荧光、免疫荧光)、相差、微分干涉相差、暗场、或者电子(透射、扫描、低-)、NMR、放射自显影)、细胞分选技术(例如，荧光激活的)、层析技术(例如，凝胶过滤、离子交换、疏水层析、亲和层析、HPLC)、电泳技术(例如，SDS-PAGE、2D-、3D-、等电聚焦)、超速离心、免疫细胞化学和免疫组织化学技术(例如，ELISA、蛋白质印迹、免疫印迹)、核酸包括重组核酸技术(例如，PCR(反向、逆转录、嵌套式)、RNA印迹、DNA印迹、DNA-蛋白质印迹、原位杂交、FISH、切口转译、DNA酶足迹法、DNA酶超敏感位点作图、Maxam-Gilbert测序法、Sanger测序法、凝胶移位(泳动率变动)分析、S1核酸酶分析、RNA酶保护测定、CAT测定、转基因技术、基因敲除技术和报告基因系统)、氨基酸分析(例如，Edman降解)，形态的、病理的或者表型的观察，和用或者不用仪器进行的其他观察。
在一些实施方案中，对受试者直接或者间接询问他们的健康状况和由于施用本发明的治疗组合物(例如，药物、小分子、和其他治疗剂和技术)和方法造成的任何改变。
多种患者间和患者内药物动力学因素影响对个体患者的给药和施用方案的设计。对于任何给定的药物，在特定受试者中的药物动力学性质存在很大变异，并且最终应答中存在高达一半或者以上的总变异。这些可变因素的重要性部分地取决于药剂和它的通常清除途径。例如，主要通过肾脏除去并且不变地排泄到泌尿系统中的药剂倾向于比代谢失活的药剂在具有相似肾功能的受试者中表现出更小的患者间可变性。广泛代谢的药剂与具有高代谢清除和大的首过消除率的药剂在患者间生物利用率中表现出大的差异。具有较低生物转化率的药剂通常在个体受试者中的清除率方面存在最大的变异。受试者基因型的差异在决定不同的代谢率中也起重要作用。个体受试者的器官功能中的病理和生理变异(例如，肾脏或者肝脏疾病)是可以影响药剂的处置速率的主要因素。肾脏或者肝脏疾病通常损害药物处置，从而增加患者间药物可变性。其他因素(例如，年龄)也可以影响靶定细胞和组织(例如，脑)对本发明的特定组合物或方法的响应性，并且可以改变药剂的治疗目标水平的预期范围。
当必需侵入性患者样品(例如，血液、血清、血浆、组织等等)来测定受试者中治疗剂的浓度时，应该在考虑多种标准后进行收集步骤的设计，这些标准包括，但不限于1)药剂的浓度和任何希望的治疗效果或者可避免的毒性作用之间是否存在关系；2)这些是重要的患者间变异，还是药剂处置中小的患者间变异；3)监视药剂的效果是否困难或者不实际；和4)药剂的治疗浓度是否接近毒性浓度。在其他实施方案中，除了浓度测量，还进行药物动力学、药效动力学或者药理学作用的额外测量。
在一些情况下，药剂的浓度调节到目标水平后，存在显著的患者间应答变异。对于一些药剂，该药效动力学可变性占受试者应答中总变异的多数。在一些实施方案中，药剂的浓度和所观察到的应答程度的关系可能是复杂的，甚至当在体外简化系统中测量应答时也是如此，尽管通常见到S形浓度效应曲线。药剂浓度(例如，患者的血浆中)和测量的效果之间通常没有单一的特征性关系。在一些实施方案中，浓度效应曲线可以是向上凹的。在其他实施方案中，该曲线是向下凹的。在其他实施方案中，该数据曲线是线性的、S形或者倒置的U形。此外，如果测量的响应是几种效应的复合，那么得到的浓度效应关系曲线可以是扭曲的。在一些优选实施方案中，用本领域技术人员可以得到的计算和技术将复合的浓度-效应曲线分解成更简单的分曲线。
简化的浓度效应关系，不管它们的精确形状，可以视为具有四个特征变量效力、斜率、最大效能、和个体变异。本领域技术人员将理解，通过用浓度轴与浓度效应曲线相交来测量药剂的效力。尽管效力通常表示为产生所希望的效果所需的药剂的剂量，但是它更合适地表示为与受试者中(例如，血浆中)药剂的浓度相关，该浓度最接近体外系统中所希望的条件，以避免复杂的药物动力学变量。尽管效力影响药剂给药，但是仅仅药剂的效力的知识在临床使用中是相对不重要的，只要可以方便地对受试者施用足够得到目标水平的剂量。公认效力更大的药剂不一定在治疗上优于效力较小的药剂。然而，该原理的一个例外是经皮药剂的领域中。
药剂可以在受试者中诱导的最大效应称作它的最大或者临床效能。药剂的最大效能通常由该药剂的性质和它的受体-效应器系统决定并且在浓度-效应曲线的平顶中反映。然而，在临床使用中，药剂的剂量可以受到不希望的作用(例如，毒性)的限制，并且在不危害受试者的情况下，药剂的真实的最大效能实际上是不可能实现的。
浓度效应曲线的斜率和形状反映了该药剂的作用机理，包括该曲线的形状，其至少部分描述了对该药剂受体的结合。浓度效应曲线的上升表明该药剂的临床上有用的剂量范围。本领域技术人员将明白，本文应用的剂量范围是基于可靠的药理学原理的近似值，并且在给予相同浓度的药剂的情况下，实际应答将在不同个体之间变化，并且甚至将在特定个体中随着时间而变。公知浓度效应曲线是基于平均应答，或者经过适应性改变以反映特定个体中特定时间的实际应答。
在特定个体中产生指定效应的药剂浓度称作个体有效浓度。个体有效浓度通常表现为对数正态分布，导致从浓度的对数对实现所希望的效果的频率作图得到正规变分曲线。作为药剂浓度的函数的实现所希望效果的个体的累积频率分布称作浓度百分数曲线或者量子浓度效应曲线。该曲线的形状通常是S形的。浓度百分数曲线的斜率是群体中药效动力学可变性的表达而不是个体患者中从阈值到最大效应的浓度范围的表达。
本领域技术人员将理解半数有效量(ED50)是足够在50％群体中产生所希望的效果的药剂剂量。
在临床前药物研究中，在实验动物中测定剂量(MTD)。MTD与ED50的比表示该药剂的治疗指数并且是药剂在产生它的期望效应中的选择性的量度。在临床研究中，将足够产生毒性效应的药剂剂量，或者优选浓度与群体中治疗效果所需的浓度比较以提供临床治疗指数。然而，由于群体中的个体药效动力学变异，在大多数受试者中产生治疗效果所需的药剂浓度或者剂量有时与在一些受试者中产生毒性的浓度重叠，尽管该药剂具有大的治疗指数。本领域技术人员将理解很少的治疗剂产生单一效应，从而，取决于测量的效应，该药剂的治疗指数可以改变。
本发明优选的实施方案提供了个体化给药水平和方案的方法。在优选实施方案中，在考虑多种生物学和药理学因素后设计对于特定受试者的最佳治疗方案，这些因素包括，但不限于，受试者中应答所施用的药剂的可能变异来源、诊断细节(例如，疾病的严重性和阶段、并发症的存在，等等)、服用的其他处方和非处方药物、预定的效能目标、可接受的毒性界限、治疗对非治疗或者用其他多种可得药剂治疗的成本-益处分析、受试者依从性的可能性、可能的投药差错、药剂吸收速率和程度、受试者的身体大小和组成、药剂的分布、药剂的药物动力学特性(例如，生理学变量、病理学变量、遗传因素和素质、药物相互作用、潜在的药物抗性、预测的清除率)、可能的药物-受体相互作用、功能状态、和安慰剂效果。
在优选实施方案中，临床医生选择合适的标记来测量受试者中施用的药剂的最终有效性。本发明计划在一些实施方案中，药剂有效性的合适的标记包括某些可测量的生物学状态、状况或者化学水平(例如，毒素负荷、病毒滴度、抗原负荷、温度、炎症、血细胞数、抗体、肿瘤形态，等等)的降低(或者升高)。许多诊断方法和测试可以用于收集多种标记的信息，这些方法和测试包括但不限于，细胞培养测定法(例如，软凝胶中的侵入测定法，等等)、放射照相检查(例如，胸部X射线)、计算机断层摄影术扫描、计算机化断层X线摄影法扫描或者计算机控制轴向断层摄影术(CAT)扫描、正电子发射断层摄影术(PET)扫描、磁共振成像(MRI或者NMRI)、乳房造影法、超声检查法(经阴道、经结肠直肠)、闪烁乳房造影法(例如，锝99m sestamibi、锝99m替曲膦)、吸引术(例如，子宫内膜的)、触诊、PAP测试(例如，涂片)、乙状结肠镜检查(例如，柔韧的光导纤维的)、粪潜血试验(例如，基于愈创木脂的FOBT)、直肠指诊、结肠镜检查、虚拟结肠镜检查(也称作结肠成像术(colonography))、钡灌肠、粪便分析(见，例如，K.W.Kinzler和B.Vogelstein，Cell，87(2)159-70(1996)；S.M.Dong等人，J.Natl.Cancer Inst.，93(11)858-865(2001)；G.Traverso等人，N.Engl.J.Med.，346(5)311-20(2002)；G.Traverso等人，Lancet，359(9304)403(2002)；和D.A.Ahlquist等人，Gastroenterology，119(5)1219-1227，(2000))、血清前列腺特异性抗原(PSA)筛选、内窥镜检查、镓扫描、骨髓和组织活组织检查(例如，核心针，经皮针吸活检，胸廓切开术，子宫内膜的，等等)和组织学检查、直接和/或间接临床观察(例如，患者调查、询问或者问卷)、细胞学采样和生物学组织、流体和其中的标记的收集(例如，血液、尿(例如，血尿筛选、尿细胞学检查)、痰(例如，痰细胞学)、粪便、CNS液(例如，LP、腰椎穿刺)、血液产物，包括蛋白质和肽(例如，Bcl-2家族蛋白质)、癌症标记(例如，CA125(卵巢癌)、CA 15-3(乳腺癌)、CEA(卵巢、肺、乳腺、胰腺和胃肠道癌)、PSA(前列腺癌)、p53基因产物、MIC2基因产物)、代谢产物(例如，香草扁桃酸(VMA)，和高香草酸(HVA))、抗原(例如，血清甲胎蛋白(AFP))、盐、矿物质、维生素、可溶性因子、不溶性因子、核酸，等等)。
在优选实施方案中，使用在细胞培养物或者实验动物中为了例如测定MTD和ED50的标准药学方法来确定药剂的毒性和治疗效果。优选显示出大的治疗指数的药剂。从细胞培养测定或者动物模型得到的数据可以用于配制例如哺乳动物(例如，人、家马(Equus caballus)、家猫(Felis catus)和家犬(Canis familiaris)等)中的给药范围。优选的给药浓度接近对于药剂所计算或者观测到的ED50值。更优选的给药浓度接近药剂的ED50值并且导致很小的毒性或者不导致毒性。取决于制剂、患者的敏感性和施用途径，任何给定的剂量可以在任何特定药剂的治疗指数内变动，超过或者小于该治疗指数。
实施例 提供下面的实施例用于证明和进一步举例说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不应理解为限定本发明的范围。
方法 肿瘤建立和分析如以前报导的在8周龄的雌性NOD-SCID小鼠中建立人乳腺癌肿瘤1。
细胞培养将第一代或第二代原初乳腺癌细胞以一式三份在12-胶原包被孔的皿中接种于HAM-F12培养基中，该培养基补加胎牛血清(1％)、胰岛素(5μg/ml)、氢化可的松(1μg/ml)、EGF(10μg/ml)、霍乱毒素(0.1μg/ml)、转铁蛋白和硒(GIBCO BRL，推荐的稀释度)、pen/strep、和两性霉素B(Gibco/BRL)。培养基每两天更换一次。
流式细胞术为了制备用于流式细胞术分析的细胞，在小鼠中传代一次或两次的人乳腺癌肿瘤1的单一细胞悬浮液通过切碎肿瘤并用200u/ml胶原酶3(Worthington)在M199培养基(Gibco/BRL，Rockville，MD)中于37℃下恒定搅拌消化2-4小时来制备。抗体包括抗-CD44、抗-CD24、抗ESA-FITC(Biomeda，CA)、抗-H2K、和山羊抗-人Notch4(Santa Cruz Products，Santa Cruz，CA)。除非说明，抗体购自Pharmingen(San Diego，CA)。取决于实验，将抗体直接缀合到多种荧光染料。在所有实验中，在流式细胞术中通过抛弃H2K+(I类MHC)细胞来去除小鼠细胞。通过生活力染料7-AAD来除去死细胞。在FACSVantage(Becton Dickinson，San Jose，CA)上进行流式细胞术。
Notch报道子测定法用HES-1Notch应答元件制备HES-1-萤光素酶报道构建体38。HES-1鼠基因的-194和+160之间的片段通过PCR扩增并亚克隆到pGL2基本载体(Promega)的KpnI和BglII位点之间。MCF-7细胞用HES-1-luc构建体和pSV2Neo共转染并在含有遗传霉素的培养基中选择。转染的MCF-7细胞在12孔板中于存在或不存在Notch4多克隆抗体(Santa Cruz；20μg/ml终浓度)、可溶性Delta-Fc(13)或者Notch4抗体阻断肽(4mg/100ml终浓度，Santa CruzProducts)时共培养。如所述的进行萤光素酶测定38。Delta-Fc或者Fc对照蛋白质从经工程化而分泌它们的293细胞的上清液浓缩11。将Delta-Fc或者Fc对照蛋白质与交联性抗-Fc抗体(JacksonImmunoresearch)一起加入乳腺癌细胞培养物中11。
细胞凋亡测定10,000-20,000个致瘤T1细胞(ESA+CD44+CD24-/low谱系)或者来自T5、T7和T8的谱系-肿瘤细胞通过流式细胞术分选并在胶原涂布的组织培养板上生长。然后将抗-Notch4多克隆抗体(Santa Cruz，CA)加入培养基(20mg/ml终浓度)，而PBS加入对照板。为了封闭抗-Notch4抗体，将抗-Notch4抗体与封闭肽(SantaCruz，CA)在冰上预温育30分钟，之后加入培养基中。48小时后，将细胞用胰蛋白酶处理并收集。将105个细胞悬浮在HBSS 2％热失活的小牛血清中，然后用FAM-DEVD-FMK测定细胞凋亡以检测活细胞中的活性胱天蛋白酶，FAM-DEVD-FMK是对胱天蛋白酶3和7特异的羧基荧光素标记的肽底物(CaspaTagTM Caspase Activity Kit，Intergen Company，NY)。用FACSVantage流式细胞仪(Becton Dickinson，CA)区分胱天蛋白酶阳性细胞和阴性细胞。如所描述的进行细胞周期和细胞凋亡的PI染色39。
重组腺病毒 如下构建称作Ad-GFP-dnMAML1的E3缺失的腺病毒载体用具有EcoRI位点和ATG起始密码子的正向引物，和具有HpaI位点的反向引物，通过PCR从正常乳腺细胞产生人MAML1的氨基酸1-302的编码区。所得的DNA片段在IRES-GFP基因上游克隆入MSCVneoEB载体中。然后将dnMAML1-IRES-GFP克隆在腺病毒穿梭载体pACCMV2的EcoRI和BamHI位点处。然后在密歇根大学(University of Michigan)病毒核心产生重组腺病毒。细胞在12孔板中培养并以一式三份进行感染事件。在没有FBS的培养基中加入不同浓度的病毒颗粒进行病毒感染。最初，用AD-GFP对每种细胞系或者原代细胞确定最佳病毒浓度以实现高基因表达和低病毒滴度的最佳平衡，从而最小化细胞毒性。培养4小时后，将感染培养基补充对每种细胞类型合适的FBS量。通过将在40倍放大倍数下来自三个不同的显微镜视野中的GFP阳性细胞数除以细胞总数，或者当用FACS检查GFP时，通过Cellquest来计算转导效率(感染后24小时)。
PCR分析 通过定量RT-PCR进行Fringes、Notch和它们的配体的基因表达分析。用于所检查基因的PCR反应的引物从Applied Biosystems购买。对于每个群体和每种测定的基因，使用上述标记通过流式细胞术一式三份地分离2000个致瘤和非致瘤细胞。用Trizol按照GIBCO BRL方案进行RNA分离。用OligodT锚引物进行cDNA产生，用TaqmanAssay-on-demand系统(Applied Biosystems)准备PCR反应。PCR反应在ABI PRISM7900HT Sequence Detection System(AB)上进行，其是高通量实时PCR系统，该系统检测并定量核酸序列。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析表明为单一PCR产物(数据未显示)。用2ΔΔCT方法40进行差别基因表达的统计学分析。
蛋白质印迹分析 对来自用pcDNA3转染的MCF-7细胞(MCF-7-V)、用显性失活FADD转染的MCF-7细胞(MCF-7/dnFADD)27、和用Bcl-XL转染的MCF-7细胞的2个克隆(MCF-7/BCL-XL，克隆1和2)28的等量细胞裂解物测试期望的蛋白质的表达。将293T细胞用pcDNA3-FLAG-BCL-XL瞬时转染。用抗-FLAG抗体已经证实了FLAG-BCL-XL蛋白质的表达。为了检测AUI标记的dnFADD蛋白质，使用抗-AUI小鼠单克隆抗体(1/1,000)(Covance，Berkeley-CA)。用抗-BCL-Xs/l(S-18)兔多克隆抗体(稀释度1/500)(Santa Cruz Biotecnology Inc.，Santa Cruz-CA)检测BCL-XL水平。对于原代肿瘤1和肿瘤4(称作T1和T4)，如以前描述的1从每种肿瘤中分选ESA+CD44+CD24-/low谱系-群体(称作T)的2000个细胞的样品或者非致瘤群体(称作NT)的2000个细胞的样品。对于原代肿瘤2、3和5(称作T2、T3和T5)，如以前描述的从每种肿瘤分选2000个H2K-细胞。这代表致瘤和非致瘤癌细胞的混合群体。每种基因用3个独立分选的细胞样品进行分析。(+)表示检测到基因的表达。(-)表示没有检测到基因表达。(ND)表示没有进行该测定。指出了4种Notch受体的每一种的分析，以及Delta和Jagged家族的Notch配体。还分析了Fringes(Lunatic、Manic和Radical)。
通过调节Notch途径信号传导对癌症干细胞增殖的调节 该实施例描述了通过靶定Notch途径信号传导而不直接靶定Notch4来调节细胞增殖的化合物和方法。
γ-分泌酶抑制剂。对显示出表达Notch的20,000个MCF-7细胞在6孔板中一式三份接种以测定细胞生活力。48小时后，向细胞加入1.19μg/mlγ-分泌酶抑制剂。12、24和48小时后对总的细胞和锥虫蓝阴性(活)细胞计数并确定与对照孔相比的活细胞的％。
在本发明的开发期间进行的实验被设计用来测试Notch信号传导阻断对MCF-7细胞的存活和增殖的影响。将细胞与γ-分泌酶抑制剂共培养，γ-分泌酶抑制剂抑制Notch受体的最终切割，防止Notch胞内(IC)结构域的释放，基本上阻断Notch信号传导(Karlstrom等人，J.Biol.Chem.，2776763(2002))。暴露于抑制剂后测定细胞生活力。暴露后12、24和48小时确定活细胞百分数。24小时后生活力显著降低，大多数细胞在48小时后死亡。为了确定γ-分泌酶抑制剂对Notch信号传导途径的特异性，使用用处于HES-1启动子控制下的萤光素酶报道基因稳定转染的MCF-7细胞。可以用标准萤光素酶测定法监视HES-1启动子的反式活化或者抑制，HES-1启动子是Notch信号传导的下游元件。将细胞与γ-分泌酶抑制剂共同培养并监视萤光素酶活性的改变。暴露后12小时该抑制剂明显减小了萤光素酶的活性，而细胞生活力仍然很高，表明它特异性地抑制Notch受体的表达。
为了确定MCF-7细胞中Notch信号传导的抑制诱导细胞死亡的机理，测定暴露于γ-分泌酶抑制剂的细胞中的胱天蛋白酶活化。暴露后24小时，测定细胞中降解的DNA的积累，因为这是细胞凋亡特有的。与对照MCF-7细胞培养物比较。在暴露于γ-分泌酶抑制剂的细胞中具有激活的胱天蛋白酶3/7的细胞数目显著增加。这些数据表明在MCF-7细胞系中，阻断的Notch信号传导途径通过胱天蛋白酶3/7活化诱导细胞凋亡。
进行实验来测试Notch信号传导对来自5名不同乳腺肿瘤患者的乳腺癌细胞在体外增殖能力的影响。培养来自患者的细胞。通过将这5种不同细胞培养物暴露于γ-分泌酶抑制剂来检查Notch信号传导的作用。将细胞置于胶原包被的培养板上的以前建立的细胞培养基中并允许生长。然后向培养物中加入抑制剂并在48小时后进行生活力测定。γ-分泌酶抑制剂对这些细胞的生活力有显著影响，如图7中所示。这些数据证明，Notch活化促进了在所有这5种重新生长的肿瘤中乳腺癌细胞的存活或增殖。
体内Notch信号传导的抑制抑制了致瘤癌细胞的肿瘤形成 进一步来进行实验以确定Notch信号传导的阻断是否抑制体内乳腺癌细胞的肿瘤形成。以前发现在乳腺癌肿瘤中仅乏部分称作致瘤癌细胞的癌细胞在异种移植的小鼠模型中形成肿瘤，而多数癌细胞缺乏该能力(Al-Hajj等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1003983(2003))。少至1000个来自患者乳腺肿瘤1(TP1)的致瘤癌细胞和10,000个来自患者乳腺肿瘤4(TP4)的致瘤癌细胞能够在NOD/SCID小鼠中形成新肿瘤(Al-Hajj等人，同上)。因此，将TP1和TP4致瘤癌细胞与对照腺病毒或者dnMAML1腺病毒培养3小时。每组NOD/SCID小鼠注射10,000个或者1,000个TP1致瘤癌细胞。即使在注射到小鼠体内的时候，绝大多数感染了对照或者dnMAML1腺病毒的癌细胞仍然存活，用dnMAML1腺病毒感染的TP1细胞感染的细胞的10次注射中的0次形成肿瘤，而感染了对照腺病毒的细胞的所有注射都形成肿瘤。类似地，感染了对照腺病毒的10,000个TP4细胞的所有5次注射都形成肿瘤，而感染了dnMAML-1腺病毒的10,000个细胞的注射都不形成肿瘤。这些数据表明，Notch信号传导对癌细胞存活和体内新肿瘤的形成是重要的，并且通过本发明的方法对该途径的阻断导致这些细胞失去形成肿瘤的能力。
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权利要求
1.鉴定肿瘤样品中致瘤细胞的存在的方法，其包括检测所述致瘤细胞特征性的一种或多种标记或者性质，其中所述一种或多种标记或者性质不是非致瘤细胞特征性的，其中所述一种或多种标记或者性质选自Notch4的表达、暴露于抗Notch4抗体时细胞死亡、ManicFringe的表达、Notch配体Delta相对于所述非致瘤细胞改变的表达、Jagged的表达、和暴露于显性失活腺病毒载体dnMAML1或γ-分泌酶抑制剂时细胞死亡。
2.权利要求1的方法，其中所述肿瘤包括乳腺癌肿瘤。
3.权利要求1的方法，其中检测所述一种或多种标记或者性质的两种或更多种。
4.权利要求1的方法，其还包括基于所述致瘤细胞的存在或不存在为受试者选择治疗行动过程。
5.权利要求4的方法，其中所述治疗行动过程包括对所述受试者施用Notch4途径抑制剂。
6.权利要求4的方法，其中所述治疗行动过程包括对所述受试者施用启动线粒体凋亡的药物。
7.权利要求4的方法，其中所述治疗行动过程包括对所述受试者施用γ-分泌酶抑制剂。
8.权利要求4的方法，其中所述治疗行动过程包括对所述受试者施用Manic Fringe抑制剂。
9.选择或者表征化合物的方法，其包括a)提供包含致瘤乳腺细胞的样品；b)将所述样品暴露于受试化合物；和c)检测所述细胞中响应所述受试化合物而发生的改变。
10.权利要求9的方法，其中所述化合物包含抗体。
11.权利要求9的方法，其中所述化合物包含抗肿瘤化合物。
12.权利要求9的方法，其中所述细胞还用已知的抗肿瘤治疗化合物进一步处理。
13.权利要求9的方法，其中所述样品包含人乳腺组织。
14.权利要求9的方法，其中所述检测包括检测所述致瘤乳腺细胞的细胞死亡。
15.权利要求9的方法，其中所述检测包括检测所述致瘤细胞特征性的一种或多种标记或者性质的改变。
16.治疗带有致瘤乳腺细胞的受试者的方法，其包括a)鉴定所述受试者中致瘤乳腺细胞的存在；b)鉴定所述致瘤乳腺细胞特征性的一种或多种标记或者性质以鉴定所述致瘤乳腺细胞的特性；和c)基于所述致瘤乳腺细胞的所述特性选择治疗行动过程。
17.权利要求16的方法，其中所述一种或多种标记或者性质选自Notch4的表达、暴露于抗Notch4抗体时细胞死亡、Manic Fringe的表达、Notch配体Delta相对于所述非致瘤细胞改变的表达、Jagged的表达、和暴露于显性失活腺病毒载体dnMAML1或γ-分泌酶抑制剂时细胞死亡。
18.权利要求16的方法，其中所述行动过程包括当所述致瘤乳腺细胞的特征是表达Notch4时，对所述受试者施用Notch4途径抑制剂。
19.权利要求16的方法，其中所述行动过程包括从所述受试者手术除去肿瘤和对所述受试者施用Notch途径抑制剂。
20.权利要求16的方法，其中所述行动过程包括对所述受试者共同施用Notch途径抑制剂和另一种抗肿瘤剂。
21.预防或者减少转移的方法，其包括对怀疑有转移的受试者施用Notch途径抑制剂。
22.权利要求21的方法，其中所述Notch途径抑制剂包含抗-Notch4抗体。
23.权利要求21的方法，其中所述化合物包含γ-分泌酶抑制剂。
24.权利要求21的方法，其中所述化合物包含Manic Fringe抑制剂。
25.权利要求21的方法，其中所述化合物包含启动线粒体凋亡的药物。
26.权利要求21的方法，其中结合从所述受试者除去实体瘤进行所述施用。
27.权利要求26的方法，其中所述实体瘤包括乳腺肿瘤。
28.减少或者清除乳腺癌受试者中致瘤细胞的方法，其包括对所述受试者施用γ-分泌酶抑制剂。
29.减少或者清除乳腺癌受试者中致瘤细胞的方法，其包括对所述受试者施用Manic Fringe抑制剂。
全文摘要
本发明涉及表征、调节、诊断和治疗癌症的组合物和方法。例如，本发明提供了抑制某些类型的癌细胞(包括乳腺癌细胞)的肿瘤发生和预防转移的组合物和方法。本发明还提供了鉴定调节肿瘤发生的化合物的系统和方法。
文档编号G01N33/574GK1950518SQ200580009740
公开日2007年4月18日 申请日期2005年2月3日 优先权日2004年2月3日
发明者M·F·克拉克, M·阿尔－哈吉 申请人:密执安州立大学董事会