专利名称：一种分析装置及制备方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分析装置、制备这种分析装置的方法、以及应用这种分析装置进行分析的方法。
背景技术：
以生物芯片试剂盒为例，可以说明目前分析装置面临的主要问题。
本发明中，术语“生物芯片试剂盒”，简称“芯片试剂盒”，包括但不限于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray。芯片包括微流路芯片(相当于英语中的Microchannel Biochip)、微阵列芯片(相当于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray)等。越来越多的生物传感器，也在成为生物芯片。生物芯片由于其具有高通量和微型化的特点，应用范围非常广泛，包括基因表达检测、基因筛选、药物筛选、疾病诊断治疗、环境监测和治理、司法鉴定等领域。
灵敏度、特异性、稳定性、可重现性，是生物芯片试剂盒研究与开发中最为重要的课题。由于分析标淮不断地提高，因此提高生物芯片试剂盒的灵敏度就成为不断追求的熟门课题。研制高灵敏度的芯片试剂盒，是大多数研究者致力于创新与开发的目标。其它分析装置，也有类似情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度的分析装置，特别是生物芯片试剂盒，制备这种试剂盒的方法，以及应用这种试剂盒进行分析的方法。
本发明的目的是通过实施下述技术方案来实现的一种分析装置，其组成包括分析反应器和分离系统，其特征在于所述分离系统包括a.纳米分离系统，b.或/和磁悬浮吸附系统；前者a是以纳米尺寸的物质为分离目标物的分离系统；后者b是指吸附物在磁场作用下，悬浮在柱子中的指定位置，来吸附分离目标物的吸附系统。
在本发明的实施例中，详细时论了基于分离目标物纳米粒子的特别几何性质(例如纳米滤器分离)，或特别的力学性质(例如纳米粒子离心分离)的纳米分离系统，以及基于亲和吸附的磁悬浮吸附系统。作为本发明优选方案之一的分析装置，是用以分析多种目标物的分析装置。作为本发明更优选方案之一的分析装置，是在同一个分析反应器中固定有多种探针、具有用于分离多种目标物分离系统的分析装置。
在本发明的分析装置中，其纳米分离系统，包括含稳定过滤介质的纳米过滤系统。在本发明的实施例中，含稳定过滤介质的纳米过滤系统包括纳米滤器(Nano-filter)，其平均孔径在纳米尺寸、优选15-100nm、更优选15-80nm，而其中的过滤介质，包括中空纤维纳米滤管、纳米滤膜和巨分子超滤膜。
在本发明的分析装置中，其纳米分离系统，包括含可撤消过滤介质的纳米过滤系统。在本发明的实施例中，可撤消过滤介质包括可通过改变磁场改变其聚集形态的具有磁性的粒子。
在发明的分析装置中，其纳米分离系统，包括纳米离心系统。在本发明的实施例中，纳米离心系统包括可分离出纳米粒子的离心系统(例如高速离心，例如离心力大于15000g的离心系统)，其不同于分析中常用的其它离心系统。
在本发明的分析装置中，其纳米分离系统，包括以分离包括全病毒微粒和病毒片段微粒为目标物的分离系统。很多病毒和病毒片段都具有颗粒的形态。例如乙肝病毒颗粒粒径在40nm-50nm之间，其片段微粒粒径约20nm。
在本发明的分析装置中，其磁悬浮吸附系统，为包括含磁粒子的吸附物的吸附系统。
在本发明的分析装置中，以含磁粒子为吸附物的磁悬浮吸附系统，包括以磁纳米粒子为吸附物的磁悬浮吸附系统。
在本发明的分析装置中，其组成还包括有一种或多种亲和纳米粒子，其中所述亲和纳米粒子含纳米粒子，以及固定在纳米粒子上的分离目标物的配基。在本发明的实施例中，配基包括多肽配基，多肽配基包括抗原和抗体。在本发明的实施例中，纳米粒子包括无机基质纳米粒子和有机基质纳米粒子，优选化学改性的纳米粒子包本发明的分析装置，在其组成包括的一种或多种亲和纳米粒子中，至少有一种亲和纳米粒子的自由配基含量小于50％，且非亲和纳米粒子的含量小于50％。在本发明实施例的部份实施方案中，所述亲和纳米粒子，至少含纳米粒子、共价键合在纳米粒子上的偶联基团、共价键合在偶联基团上的活化基团、和共价键合在活化基团上的配基。所述活化基团选自氨基、通式为-RNH2的基团、不含NH2的有机基团。当所述活化基团选自氨基或不含NH2的有机基团时所述偶联基团的平均分布密度大于1.85μmol/m2纳米粒子表面；或/和所述活化基团的平均分布密度大于1.85μmol/m2纳米粒子表面。当所述活化基团选自通式为-RNH2的基团时，所述活化基团的平均分布密度大于0.5μmol/m2纳米粒子表面。所述偶联基团包括有机硅偶联基团。至少一种所述亲和纳米粒子具有亲和层析级的纯度。
本发明的分析装置，在其至少一个分析反应器中，既固定有探针抗体，又固定有探针抗原。在本发明的实施例的部份实施方案中，分析装置是可在一个反应器中同时检测目标抗原和目标抗体的试剂盒。
本发明的分析装置，在其至少一个分析反应器中既有配基为抗原的亲和纳米粒子，又有配基为抗体的亲和纳米粒子。在本发明的实施例的部份实施方案中，分析装置是可在一个反应器中同时检测目标抗原和目标抗体的试剂盒。
在本发明的分析装置中，构成其组成成分的亲和纳米粒子，包括用于标记的亲和纳米粒子。在本发明实施例的部份实施方案中，标记亲和纳米粒子具有磁性，容易用作生物传感器试剂盒。
本发明的分析装置，为具有上述分离系统和反应器的生物芯片试剂盒。在本发明实施例的部份实施方案中，生物芯片反应器为流动式反应器，容易实现分离系统与反应器之间的连续化操作。
一种本发明分析方法，其步骤是提供样品和提供本发明分析装置。
本发明分析方法，还包括下述步骤用所述纳米分离系统，分离获得样品中可能存在的分析目标物粒子；再将分离出的分析目标物粒子固定在反应器中。
本发明的分析方法，还包括下述步骤用所述亲和纳米粒子，与样品中可能存在的分析目标物反应，形成目标物/亲和纳米粒子复合物；然后用所述纳米分离系统，分离目标物/亲和纳米粒子复合物；再将分离出的目标物/亲和纳米粒子复合物固定在反应器中。
本发明的分析方法，还包括下述步骤用所述亲和纳米粒子，与样品中可能存在的分析目标物反应，形成目标物/亲和纳米粒子复合物；然后用所述纳米分离系统，分离分析目标物粒子和所述目标物/亲和纳米粒子复合物；再将分离出的分析目标物粒子和目标物/亲和纳米粒子复合物固定在反应器中。
在本发明实施例的部份实施方案中，上述目标物/亲和纳米粒子复合物的形成反应中，亲和纳米粒子的浓度(w/v)为1万分之一至1％。
在本发明实施例的部份实施方案中，上述目标物/亲和纳米粒子复合物分离时的最高浓度(w/v)小于10％。
在本发明实施例的部份实施方案中，上述目标物/亲和纳米粒子复合物在反应器中固定时的浓度为1万分之一至1％。
本发明的分析方法，还包括下述步骤将磁性亲和纳米粒子固定在反应器中的分析目标物上。
本发明的分析方法，还包括下述步骤用所述磁悬浮吸附系统，吸附分离分析目标物；再将分离出的分析目标物固定在反应器中。
一种制备本发明分析装置的方法，包括所述亲和纳米颗粒的制备，使得所其含亲和纳米颗粒的组成中非固定配基的含量小于配基总量的5％，以及非亲和纳米颗粒的含量小于纳米颗粒总量的30％。所述非固定配基的含量是通过离心法减小的。所述非亲和纳米颗粒的含量是通过亲和层析法减小的。
一种制备本发明分析装置的方法，包括制备具有上述分离系统和反应器的试剂盒。
本发明的优点在于由于本发明的分析装置有新的组成，尤其是其中创新的分离系统，所以使本发明分析装置可对样品中的目标物进行分离，至少可进行目标物的相对浓缩(目标物浓度与其它生物分子浓度之比大大增大)，从而大大提高了检测灵敏度。
具体实施例方式
术语定义在本发明中，术语“探针”是指用以固定在反应器内、通过相互作用(包括亲和作用)捕获目标物的物质。探针包括多肽或/和与多肽相互作用的药物。公知的可与目标多肽作用的探针很多，例如离子交换剂、药物、多肽、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、抗原、以及病毒、细胞或它们的组成。探针也包括核酸或/和与核酸相互作用的药物。
本发明术语“标记配基”是指包含于标记物中、通过其与目标物相互作用(包括亲和作用)实现对目标物标记的物质，包括配基(相当于英语中的Ligand)，例如抗原、抗体、配体、配体指数增强系统进化技术筛选的适配分子、配基、多肽、多糖、共酶、辅因子、抗生素、类固醇、病毒、细胞等。
本发明术语“多肽”相当于英语中的“polypeptide”，包括天然或合成蛋白质、蛋白质片断、合成肽等等，免疫检测中通常的目标物和检测中通用的配基，例如抗原、抗体、等等都属于多肽。
本发明术语“亲和纳米粒子”或“配基/纳米粒子复合物”，是指固定有配基的纳米粒子。配基在纳米粒子上的固定有很多方式，本发明方法中制备出的配基/纳米粒子复合物中一种固定方式的例子为共价健合。需要注意的是，含配基/纳米粒子复合物的制备物，一般为含配基/纳米粒子复合物的混合物(简称配基/纳米粒子混合物)，因其还含或多或少未固定至纳米粒子的配基、和或多或少基本上未固定有配基的纳米粒子。
本发明术语“纳米粒子”是指在三维空间中，至少有一维小于1000nm的固相载体粒子；术语“活化纳米粒子”，是指活化基团与纳米粒子通过共价结合形成的复合物。
本发明术语“生物芯片片基”，简称片基，是指用以在其上形成探针点的固相载体。本发明的固相载体包括常规载体和纳米结构载体，其中所述常规载体为表面基本上无纳米结构的固相载体，所述纳米结构载体为表面上有纳米结构的固相载体。片基上通常有可与配基反应的活性基团。
本发明术语“标记物质”是指用以形成或参与形成检出信号的物质，例如罗丹明、CY3、CY5等。
本发明术语“分析反应器”，简称“反应器”，是指探针与目标物的反应的场所及与之连通的全部结构组成的整体。反应器包括边界或隔离结构、片基、固定在片基上的探针、及相连通的其它相关结构(例如流路、进液结构、出液结构、固定化标记物、等等)。此外，本发明中按照芯片上反应器的数目n，芯片被定义为单反应器芯片(n＝1)和多反应器芯片(n等于或大于2)；按照检测过程中所加入的液相介质能否在反应器中定向流动，反应器被定义为流动反应器和非流动反应器，且将以流动反应器和非流动反应器为特征的芯片分别定义为流动芯片和非流动芯片以下将通过实施例更为详细地说明本发明。
实施例1.用于分析装置的纳米分离系统的制备本实施例中制备的纳米分离系统，包括含预滤的纳米分离系统(预滤器+纳米分离器)，和不含预滤的纳米分离系统(纳米分离器)。预滤的目的，是除去比纳米分离系统的分离目标物大的组分。本实施例中，所用预滤器，皆为膜滤器，标称孔径为0.2μm或0.4μm。例如，一个孔径0.2μm(或0.4μm)、面积1cm2的预滤膜的微型滤器。
本实施例中制备的纳米分离系统，除上述系统外，还可以包括连接管等零部件。本实施例制备的纳米分离系统，其中分离介质的流动，可以用微量泵(例如流速1μl-100μl/分钟)来完成。
关于纳米分离器的更详细的说明，见下述实施例。
实施例1.1.含稳定过滤介质的过滤系统的制备本实施例中，所用过滤介质分别为中空纤维滤管、滤膜和超滤膜，它们的平均孔径在10-35nm之间，用以截流尺寸大于平均孔径的分离目标物。本实施例中的纳米分离系统，其中的过滤介质在过滤过程没有形态的变化，例如滤膜总是滤膜。更详细的说明，见下述实施例。
实施例1.1.1含中空纤维纳米滤管的纳米滤器本实施例中，纳米分离系统含中空纤维纳米滤管，例如取自Asahi公司的Planova系列产品(中空纤维滤管平均孔径分别为15nm、19nm、35nm等等)的中空纤维纳米滤管。Planova是一种重要的除病毒滤器。其中，Panova20N的中空纤维纳米滤管，其平均孔径为19nm。本实施例中，“中空纤维纳米滤管”是指平均孔径在纳米尺寸、优选15-100nm、更优选15-45nm的中空纤维滤管。中空纤维纳米滤管可以以不同的方式与其它部件连接，从而制成不同的纳米分离系统。
本实施例中的一个方案为纳米滤器，含1).中空纤维纳米滤管；2)进液管和出液管，它们分别与中空纤维纳米滤管进液端、出液端相连；3).滤筒，它被用以容纳中空纤维滤管和滤过液；4).滤筒顶盖和底盖，它们含中空纤维滤管固定结构。本实施例中，滤筒为自制的内径5mm的不锈钢筒，其长度为10cm，其上开有废液出口。本实施例中的纳米滤器，以滤器截留物为分离目标物。而Planova滤器，则以滤过液为分离目标物。
本实施例制备的纳米滤器，其工作原理为使样品(例如30倍稀释血清、或含目标物/亲和纳米粒子复合物的30倍稀释血清)经进液管进入中空纤维纳米滤管，从而将被其截留的粒子(例如尺寸在15nm以上的病毒和病毒衍生物粒子，或/和目标物/亲和纳米粒子复合物)保留在透析管内，而将较小尺寸的分子通过透析管壁上的孔流出。
本实施例制备的纳米滤器，可对样品中的纳米粒子(例如病毒粒子、或/和目标物/亲和纳米粒子复合物)进行分离、或/和浓缩。
本实施例制备的纳米分离系统，在以下实施例中简记为Z111。
实施例1.1.2.含纳米滤膜的纳米滤器本实施例中，纳米滤器含纳米滤膜，例如选自PULL公司的DV系列中的滤膜，和Millipore公司的Viresolve NFP系列中的滤膜。DV、Viresolve NFP是重要的除病毒滤器。例如，取自DV20中的滤膜，其平均孔径为20nm；取自Viresolve NFP中的滤膜，其平均孔径为28nm。本实施例中，“纳米滤膜”是指平均孔径在纳米尺寸、平均孔径在纳米尺寸、优选15-100nm、更优选15-45nm的滤膜。滤膜可以以不同的方式与其它部件连接，从而制成不同的纳米分离系统。
本实施例中2的一个方案为纳米滤器含1).纳米滤膜，2).滤筒，含有进液管的顶盖，和有滤膜支撑部和出液管的底盖，它被用以容纳滤膜。本实施例中，滤筒为自制的内径5mm的不锈钢筒，其顶盖和底盖之间螺纹联结，可以拆卸，以便装、撤滤膜。
本实施例制备的纳米分离系统，其工作原理为使样品(例如30倍稀释血清、或含目标物/亲和纳米粒子复合物的30倍稀释血清)经进液管进入滤筒，将被其截留的粒子(例如尺寸在15nm以上的病毒和病毒衍生物粒子，或/和目标物/亲和纳米粒子复合物)保留在纳米滤膜上方，而将较小尺寸的分子通过滤膜流出。
本实施例中的一个方案，为预滤/纳米滤器，即在上述纳米滤器的上方安置有预滤膜(例如标称孔径为0.2μm的除菌滤膜)。取预滤膜下方、纳米滤膜上方的悬浮液为分离目标物，供进一步分析之用。
本实施例制备的纳米分离系统，可对样品中的纳米粒子(例如病毒粒子、或/和目标物/亲和纳米粒子复合物)进行分离、或/和浓缩。
本实施例制备的纳米分离系统，在以下实施例中简记为Z112。
实施例1.1.3.含纳米超滤膜的纳米滤器本实施例中，所用纳米分离器含超滤膜，例如选自Biomax公司的分子截流值为50万的超滤膜(例如产品编号为PBVK1500的高流速聚醚砜超滤膜)。超滤膜可以以不同的方式与其它部件连接，从而制成不同的纳米分离系统。
本实施例中的一个方案为纳米分离系统，含1).超滤膜，2).吸水浓缩器。例如，在一个上方留有加样口的透明塑料夹具中，超滤膜位于夹具中心。其前有塑料壁，壁上有与加样口连通的流过结构(例如总容量1ml)。其后有3mm厚的吸水纤维层。吸水纤维层后有塑料壁。
本实施例制备的纳米分离器，其工作原理为使样品(例如含目标抗体/以目标抗体的抗原为配基的亲和纳米粒子复合物的人球蛋白稀释液)经加样口进入流过结构，将被其截留的大分子(例如上述复合物)保留在超滤膜上方，而在吸水纤维层作用下，将较小尺寸的分子通过超滤膜流出。
本实施例制备的纳米分离器，可对样品中的大分子(例如病毒粒子、或/和目标物/亲和纳米粒子复合物)进行分离、或/和浓缩。
本实施例制备的纳米分离系统，在以下实施例中简记为Z113。
实施例1.2.含可撤消过滤介质的过滤系统的制备本实施例中，所用过滤介质分别为大孔滤膜和纳米过滤用磁纳米粒子。其中大孔滤膜的平均孔径比分离目标粒子粒径大至少50nm(例如，PULL公司孔径为0.2μm除菌滤膜)；纳米过滤用磁纳米粒子，为粒径大于大孔滤膜的平均孔径、但可形成平均截流直径小于分离目标粒子粒径的过滤介质层的磁纳米粒子(例如，尺寸250nm的Fe3O4粒子)。本实施例中的纳米分离系统，其中的纳米过滤介质(磁纳米粒子过滤介质层)，在过滤过程可以撤消。
更详细的说明，见下述实施例。
实施例1.2.1含可撤消过滤介质的过滤系统本实施例的一个方案中纳米过滤系统，含1).大孔滤膜，2).纳米过滤用磁纳米粒子，3).滤筒。其中，滤筒含有进液管的顶盖，和有滤膜支撑部和出液管的底盖，它被用以在纳米过滤时容纳大孔滤膜和纳米过滤用磁纳米粒子。本实施例中，滤筒为自制的内径5mm的不锈钢筒，其顶盖和底盖之间螺纹联结，可以拆卸，以便装、撤滤膜。
本实施例制备的纳米分离器，其作为简单滤器时的工作原理为使滤筒中的纳米过滤用磁纳米粒子，在大孔滤膜上形成厚度足够(例如的过滤介质层(如有必要，可外加磁场保持此一过滤介质层的稳定)，再将样品(例如含目标物/亲和纳米粒子复合物的30倍稀释血清)经加样口进入滤筒，将被其截留的分离目标粒子(例如上述复合物)保留在此一过滤介质层上方，而将较小尺寸的分子通过此一过滤介质层和大孔滤膜经出液管流出。在分离目标粒子被浓缩或/和纯化后，利用外加磁场使上述过滤介质层离散从而撤消，使得分离目标粒子能够接触并经过大孔滤膜、再经出液管流出。此一纳米分离器，可进行分离目标粒子的单方向连续分离，有利于整个分离系统的自动化。
本实施例制备的纳米分离系统，在以下实施例中简记为Z121。
实施例1.2.2含可撤消过滤介质的亲和层析系统本实施例中的可加、减过滤介质的亲和层析系统的一个方案，其含1).大孔滤膜；2).纳米过滤用磁纳米粒子；3).亲和纳米粒子；4).滤筒。其中，滤筒含有进液管的顶盖，和有滤膜支撑部和出液管的底盖，它被用以在亲和吸附时容纳大孔滤膜、纳米过滤用磁纳米粒子和亲和纳米粒子。本实施例中，滤筒为自制的内径5mm的不锈钢筒，其顶盖和底盖之间螺纹联结，可以拆卸，以便装、撤滤膜。本实施例中，亲和纳米粒子选自实施例2制备的亲和纳米粒子。
本实施例制备的纳米分离器，其工作原理为使滤筒中的纳米过滤用磁纳米粒子在大孔滤膜上形成厚度足够(例如1mm)的过滤介质层(如有必要，可外加磁场保持此一过滤介质层的稳定)，使非磁性亲和纳米粒子在此一过滤介质层上形成亲和层析层(例如0.5mm)，再将样品(例如20倍稀释血清)经加样口进入滤筒，使亲和层析层吸附分析目标物，而将未吸附的较小尺寸的分子通过亲和层析层、过滤介质层和大孔滤膜经出液管流出。在亲和吸附完成后，如有必要可加入洗涤液，洗去未吸附的较小尺寸分子。利用外加磁场使上述过滤介质层散离，从而使目标物/亲和纳米粒子复合物能够接触并经过大孔滤膜、再经出液管流出。此一纳米分离器，不需进行目标物的洗脱，又可实现单方向连续分离，有利于整个分离系统的自动化。
本实施例制备的纳米分离系统，在以下实施例中简记为Z122。
实施例1.3.含离心分离系统的纳米分离系统的制备本实施例制备的纳米分离系统，含离心分离系统。更详细的说明，见下述实施例。
实施例1.3.1.含简单离心分离系统的纳米分离系统的制备本实施例中，离心分离系统为离心管，优选可用于离心力20000g的、最大体积小于或等于1.5ml的离心管。
本实施例制备的纳米分离系统，其工作原理为将样品(例如含目标物/亲和纳米粒子复合物的30倍稀释血清)加到离心管中，在高离心力(例如大于15000g)条件下离心。倾去上清液，所需的目标纳米颗粒保留在沉积物中。如有必要，沉积物中加入缓冲液后，超声可形成分离目标纳米颗粒的悬浮液。
本实施例制备的纳米分离系统，在以下实施例中简记为Z131。
实施例1.3.2.含分子排阻凝胶的纳米分离系统的制备本实施例中，纳米分离系统含分子排阻凝胶分离系统，例如装有Syphancryl S-200HR分离管，凝胶底面为0.2μm的滤膜。
该系统工作原理为将样品(含目标物/亲和纳米粒子复合物的30倍稀释血清)加到排空的分离管中，经过离心后，大于0.2μm的颗粒和大部分未结合蛋白质物质被截留，收集离心管中的纯化的分析目标物/亲和纳米粒子复合物的悬浮液，作为进行下一步分析的样品。
本实施例制备的纳米分离系统，在以下实施例中简记为Z132。
实施例2.用于分析装置的磁悬浮吸附系统的制备本实施例中制备的磁悬浮吸附系统，包括含预滤的磁悬浮吸附系统(例如预滤器+磁悬浮吸附柱)，和不含预滤的磁悬浮吸附系统(磁悬浮吸附柱)。预滤(例如通过孔径为0.2μm-0.4μm的预滤器)的目的，是除去比分离目标物大的组分。本实施例中制备的系统，除上述系统外，还可以包括连接管等零部件。
本实施例中的一个磁悬浮吸附柱的方案，含有1).磁性亲和颗粒，2).柱子。其中，柱子含有进液管(也可还有预滤膜)的顶盖，它被用以在亲和吸附时限制磁性亲和颗粒向柱子壁垂直方向的运动。本实施例中，滤筒为自制的内径2mm的玻璃管。本实施例中，磁性亲和颗粒含50nm金磁微粒，和分别固定在金磁微粒上的HBs Ab1和HCV Ag1(见表2)。其中，金磁微粒为GoldMagTM-@金磁微粒(陕西西大北美基因股份有限公司)，其核为纳米Fe3O4，核表面是金的壳层，产品兼有磁性Fe3O4纳米粒子的超顺磁性以及胶体金表面生物分子固定化的性能。抗体在其上的固定参照产品说明书进行。
本实施例制备的磁悬浮吸附柱，其工作原理为在外磁场作用下，将磁性亲和颗粒固定在离柱子出口端有一定距离(例如1mm)的柱内，形成富集磁性亲和颗粒的亲和吸附层。再将样品(例如20倍稀释血清)经加样口进入柱子，流过亲和吸附层，并在那里进行亲和吸附，而将未吸附的分子直接流出。在亲和吸附完成后，如有必要可加入洗涤液洗去未吸附物。然后撤走外加磁场，使分离目标物/亲和磁纳米粒子复合物从柱子流出。此一磁悬浮吸附柱，可实现单方向连续分离，有利于整个分离系统的自动化。
显然，本实施例制备的磁悬浮吸附柱，不同于磁稳定流化床。磁稳定流化床的柱子出口端有过滤结构，分离目标物经从磁性亲和颗粒洗脱后，经过滤结构流出。而本实施例制备的磁悬浮吸附柱，分离目标物/亲和磁纳米粒子复合物从柱子下端流出。
本实施例制备的分离系统，在以下实施例中简记为Z200。
实施例3亲和纳米粒子的制备本实施例中，亲和纳米粒子制备包括提供活化纳米粒子，和制备含亲和纳米粒子的配基/活化纳米粒子混合物。
1.制备活化纳米粒子本实施例中，活化纳米粒子分别为无机纳米粒子基的活化纳米粒子，和有机纳米粒子基的活化纳米粒子。后者为商业活化纳米粒子(K2-005，Merck公司)。前者中，所有磁性亲和颗粒(GoldMagTM-@金磁微粒，50nm，陕西西大北美基因股份有限公司)为商业活化纳米粒子。其它为自制，制备方法和所获活化纳米粒子的种类参考我们的另一项专利(申请号CN200610020637.2)。
本实施例中，通过调节反应参数获得不同的活性纳米粒子。本发明中的活性纳米粒子，1g纳米粒子上固定的活性基团大于70μmol、优选大于140μmol，或1m2纳米粒子表面上固定的活化基团大于0.5μmol、优选大于1μmol。表1列出了本实施例中制备的部份活化纳米粒子的组成。
表1
*偶联后元素分析中的N百分比**与活化基团有关的元素分析氮含量(N％)＝活化纳米粒子元素分析中的N百分比-未活化前含偶联基团的纳米粒子的元素分析中的N百分比2.制备含亲和纳米粒子的配基/活化纳米粒子混合物本实施例中，配基/活化纳米粒子混合物的制备方法一般包括1).提供配基和活化纳米粒子本实施例中，所用活化纳米粒子选自上述提供的活化纳米粒子；所用配基如表2所示。
表2
表2中，亲和纳米粒子配基与反应器探针具有不完全一样的位点，可配对以夹心法分析目标抗体或目标抗原。
2).制备含亲和纳米粒子的配基/活化纳米粒子混合物本发明中，术语“亲和纳米粒子”是指配基结合在纳米粒子上形成的复合物。优选的结合方式之一为，在高盐(例如0.5M NaCl)溶液中不解离的结合方式，例如共价键合。
制备方法为通过离心分离获得活化纳米粒子沉积物，再将其均匀分布在缓冲液中制成活化纳米粒子均匀分布的悬浮液，并与配基溶液混合、反应。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本实施例中反应时纳米粒子的浓度(w/v)在5％至5‰之间调节，配基浓度在0.1mg/ml至1mg/ml之间调节；反应介质为缓冲液(PBS或pH9.3的0.1M碳酸盐缓冲液)；反应温度在室温至40℃之间调节；反应时间在0.5至24小时之间调节。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。
3).从配基/活化纳米粒子混合物分离亲和纳米粒子反应完成后，对少量悬浮液进行离心(2-8℃，20000g)，取上清液测定配基浓变，以测定未固定配基的数量。本发明中，术语“未固定配基”是指配基/活化纳米粒子混合物中未固定在纳米粒子上的配基。其中，上清液蛋白质浓度的测定使用常规测定方法。
如有必要，也可将全部悬浮液进行离心(2-8℃，20000g)，取沉淀，以减少配基/活化纳米粒子混合物中未固定配基。
配基/活化纳米粒子混合物中，也可能含非亲和纳米粒子。本发明中，术语“非亲和纳米粒子”是指未固定有配基的纳米粒子，或虽固定有配基但其含量太少、以至并无无亲和纳米粒子的明显反应性的纳米粒子。本实施例中，非亲和纳米粒子的比例通过公知的亲和层析法来测定。例如，在HBs Ab作为配基的情况下，将HBs Ag固定至活化层析胶上，再将少量悬浮液进行亲和层析，并测定层析上清液中纳米粒子的量(通过离心分离比较沉淀量)，可得此一比例。如有必要，也可将全部悬浮液进行上述亲和层析，以获得具有亲和层析纯度(100％)的高亲和纳米粒子。亲和层析胶的制备方法及亲和层析的进行方法为常规方法。
如有必要，还可用生物芯片片基常规钝化处理方法对混合物中活化纳米粒子表面进行钝化处理。
本实施例中，通过调节反应参数获得不同的配基/活化纳米粒子混合物。利用自制活化纳米粒子，在优化条件下制备的配基/活化纳米粒子混合物中自由配基的含量小于50％，某些甚至小于20％；非亲和纳米粒子的含量小于50％，某些甚至小于20％。然而，利用弱活化纳米粒子或非活化纳米粒子在相同条件下的制备中，自由配基的含量可以大于50％，非亲和纳米粒子的含量可以大于50％。下面我们将看到，这是有实际意义的。
本实施例制备的部分配基/活化纳米粒子混合物列于表3中。
表3
*参考表1；**参考表2；***(离心上清液中探针分子含量/探针分子总加入量)×100％；***(亲和层析透过液的离心沉淀量/探针分子/活化纳米粒子混合物的等体积液的离心沉淀量)×100％实施例4.分析装置的制备方法本实施例中，分析装置的制备包括1.生物芯片反应器的制备本实施例中，所用片基为氨基肼玻片，其制作方法参考Melnyk O等，Peptide arrays for highly sensitive and special antibody-binding fluorescencearrays，Bioconjug Chem.13713-20.2002。本实施例的制备方法同样适于由以下材料或其衍生物制成的芯片片基硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、其它聚合物材料及它们的复合物。同理，本实施例所用芯片片基还可以是含纳米结构的片基。
制备方法包括1).点样将表2中列出的反应器探针制成溶液，浓度在0.5-2.0mg/ml之间选择。再按常规的点样方法，分别将反应器探针溶液加至芯片片基，形成探针点。制备了2种非流动反应器仅固定有一种反应器探针的非流动反应器，和固定有多种反应器探针的非流动反应器。反应器中，每种反应器探针点2个点。所有探针点在芯片片基上形成M×N探针阵列。其中M大于1，N大于1。所用点样仪为DY-2003生物芯片点样仪(中国科学院电工研究所制备)。通过调节公知的反应控制条件(例如反应物浓度，反应介质，反应温度，反应时间，等等)可以控制反应。本专业的技术人员通过调节这些参数可获得所需的优化条件。
2).孵化点样后，在一定温度(4-37℃内选择)下和一定时间(1-24小时)内进行片基上的固定化反应。
3).钝化孵化后，使芯片在一定温度(4-37℃内选择)下和一定时间(1-15小时)内与一定浓度(1-30mg/ml)的钝化剂(小牛血清或牛奶或其它已知钝化剂)反应，以减小芯片上的非特异吸附活性。
本实施例的方法当然适于各种芯片，例如单反应池芯片、多反应池芯片、流动芯片、非流动芯片、等等。
本实施例制备的非流动生物芯片，为多反应池非流动芯片，制备方法参考我们的另一专利申请《反应器高度最小化的高集成度分析芯片及其应用》(PCT申请号CN20040169)中的实施例1。简言之用高疏水有机硅涂料(成都晨光化工研究院)涂在芯片片基上反应器边界位置上，按供货方的使用说明在室温干燥后固化，形成高度25-115μm、宽度2.0-2.5mm的高疏水凸体。高疏水凸体包围的表面可以取3mm×3mm矩形。在基片此一表面上，横向共有12个片基池，纵向有4个片基池，共有48个片基池。然后，对片基池进行上述“点样”操作和其它操作，制得非流动芯片。
本实施例制备的流动生物芯片，制备方法参考我们的另一专利申请《反应器高度最小化的高集成度分析芯片及其应用》(PCT申请号CN20040169)中的实施例9或10。言之对片基上预留固定探针的区域(宽4mm，长15mm)进行上述“点样”、“孵化”和“钝化”操作。本实施例中的顶面元件为可重复使用的、有进出液口、进出液管的、和上述区域相适应的不锈钢板。其与片基接触的面上有密封结构。其密封结构为与片基上述区域之外的区域对应的弹性材料层(白干硅橡胶溶液，成都晨光化工研究院)(层厚小于0.5mm)。其进、出液口与底面元件上的反应池进、出液区相对应。使用机械卡具压力将顶面元件与片基之间形成密封连结，从而制得非流动芯片。
本实施例制备的部分反应器列于下表4。
表4
2.制备生物芯片标记系统本实施例中，标记系统为标记物，其包含标记物配基和与之结合的标记物质。本实施例中，所用标记物配基为表2中的亲和纳米粒子配基，所用标记物质为罗丹明(Molecular probes公司)或胶体金。
本实施例中，罗丹明标记物制备方法为公知的罗丹明标记物的制备方法。如有必要纯化，将混合产物滴入装有凝胶的旋转管，在4000r/min条件下离心，取收集管液体。
本实施例中，金标记物制备方法为公知的金标记物制备方法。其中，所用金粒子为50nm GoldMagTM-@金磁微粒(陕西西大北美基因股份有限公司)。
3.提供分析目标物的分离系统本实施例中，分析目标物的分离系统分别包括1).纳米分离系统，其选自实施例1制备的纳米分离系统(Z111、Z112、Z113、Z121、Z122、Z131、Z132)；2).磁悬浮吸附系统，其选自实施例2制备的磁悬浮吸附系统(Z200)；和3).亲和纳米粒子和纳米分离系统，其中亲和纳米粒子选自实施例3；纳米分离系统选自上述纳米分离系统。
分析装置中，除了固定装置(例如输液装置、信号提取装置、反应器固定结构、等等)外，全部或部分耗材构成试剂盒。本实施例制备的部分试剂盒列于表5中。
表5
实施例5本发明的分析装置的应用及比较研究(1)本实施例中，用来研究的本发明的生物芯片试剂盒，选自实施例4制备的生物芯片试剂盒。比较研究的一般方法为1).提供样品在本实施例中，样品分别为HCV抗体阳性血清，HIV1+2抗体阳性人血清，HBs Ag阳性血清，HCV抗体阳性丙种球蛋白，和阴性血清(HCV抗体、HIV1+2抗体、和HBs Ag都为阴性的血清)。所有的样品均经使用经典的ELISA方法预先检测。
2).提供对照芯片试剂盒用作对照的生物芯片试剂盒，其中的生物芯片反应器和标记物，与本发明的生物芯片试剂盒的生物芯片反应器和标记物一样。
3).目标物分离对本发明的生物芯片试剂盒，实验时，将己稀释样品先进行分离。分离目标物为分析目标物，或/和分析目标物/亲和纳米粒子复合物(此时分离还包括所述复合物的形成反应)。分离包括1).不进行洗涤的分离，例如，样品(含或未含亲和纳米粒子)稀释100倍，再将体积经纳米滤器浓缩100倍，目标物浓度与其它小尺寸生物分子浓度之比大大增大；2).进行洗涤的分离，例如，样品(含或未含亲和纳米粒子)稀释20倍，经纳米滤器过滤，并加入洗涤液洗去小尺寸生物分子，再浓缩或不浓缩，使目标物浓度与其它小尺寸生物分子浓度之比大大增大。
本实施例中，分离方法按照试剂盒中的不同分离系统而不同，参考实施例1、2中各分离系统的工作原理。本实施例中，在上述目标物/亲和纳米粒子复合物的形成反应中，亲和纳米粒子的浓度(w/v)为1万分之一至1％之间。本实施例中，上述目标物/亲和纳米粒子复合物分离时，复合物最高浓度(w/v)小于10％、优选小于5％。
本实施例中，分离产物为含分离目标物的悬浮液。
3).目标物固定和检测本实施例中，通过将上述产物加入反应器，可将目标物固定在反应器探针上.本实施例中，上述目标物/亲和纳米粒子复合物在反应器中的固定时的浓度为1万分之一至1％。将上述产物加入反应器，既可以是连续加入，也可以是不连续加入。更详细的说明如下(1).非流动芯片将3-5μl分离目标物的悬浮液加入所述芯片的反应池中。用作对照的生物芯片试剂盒，不含分离系统，不进行分离，直接将3-5μl样品稀释液加入所述芯片的反应池中。在37℃反应30分钟后用洗涤液冲洗。标记物(常规浓度)加入量为5μl，37℃反应30分钟后用洗涤液冲洗。罗丹明标记的反应，反应器干燥后进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS 418芯片扫描仪)，扫描激发光波长532nm，发射光波长570nm，激光强度35/50-55/70，读取的信号经处理软件(JAGUARII)处理，然后取平均值后得到结果。银放大的金标记，以金为催化剂形成银沉淀斑点，肉眼可测。
(2)流动芯片将10-15μl分离目标物的悬浮液，加入所述芯片的流动反应池中。用作对照的生物芯片试剂盒，不含分离系统，不进行分离，直接将10-15μl样品稀释液加入所述芯片的反应池中。加样时流速在10-15μl/小时之间。加样后，以同一流速或较高流速加入洗液。然后取下基片再洗涤。再在每个反应器加入标记物(常规浓度)溶液，加入量约为10μl，反应温度37℃，反应时间5分钟。罗丹明标记的反应，反应器干燥后进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪(Afymetrix公司GMS 418芯片扫描仪)，扫描激发光波长532nm，发射光波长570nm，激光强度35/50-55/70，读取的信号经处理软件(JAGUARII)处理，然后取平均值后得到结果。银放大的金标记，以金为催化剂形成银沉淀斑点，肉眼可测。
与对照芯片试剂盒比较，本发明的芯片试剂盒均获得较高的灵敏度。例如，当阳性样品稀释至N倍时，利用对照芯片试剂盒测不出阳性。而利用本发明的芯片试剂盒，即使稀释至mN倍时(m＞1)，仍可测出阳性，即灵敏度(或测定下限)可提高m倍。m和N的数字，决定于所用阳性样品和芯片试剂盒。总的来讲，利用本发明的芯片试剂盒，m大于4，个别甚至大于10或更多。
更详细的说明，见下述实施例。
实施例5.1.包含目标物纳米粒子分离的分析本实施例中，分析包括下述步骤用所述纳米分离系统，分离获得样品中可能存在的分析目标物粒子；将分离出的所述分析目标物粒子固定在反应器中。
本实施例中，所用生物芯片试剂盒选自实施例4的制备物，例如表5中的K3，K9，K11和K12。
实施例5.2.包含目标物/亲和纳米粒子复合物分离的分析本实施例中，分析包括下述步骤用所述亲和纳米粒子，与样品中可能存在的分析目标物反应，形成目标物/亲和纳米粒子复合物；用所述纳米分离系统，分离所述目标物/亲和纳米粒子复合物；将分离出的所述目标物/亲和纳米粒子复合物固定在反应器中。
本实施例中，所用生物芯片试剂盒选自实施例4的制备物，例如表5中的K1，K2，K7和K8。
实施例5.3.包含目标物纳米粒子和目标物/亲和纳米粒子复合物分离的分析本实施例中，分析包括下述步骤用所述亲和纳米粒子，与样品中可能存在的分析目标物反应，形成目标物/亲和纳米粒子复合物；用所述纳米分离系统，分离分析目标物粒子和所述目标物/亲和纳米粒子复合物；将分离出的所述分析目标物粒子和目标物/亲和纳米粒子复合物固定在反应器中。
本实施例中，所用生物芯片试剂盒选自实施例4的制备物，例如表5中的K5，K6，K13和K14。
实施例5.4.包含磁悬浮吸附系统分离的分析本实施例中，分析包括下述步骤用所述磁悬浮吸附系统分离分析目标物；将分离出的所述分析目标物固定在反应器中。
本实施例中，所用生物芯片试剂盒选自实施例4的制备物，例如表5中的K15和K4。
实施例6本发明的分析装置的比较研究及应用(2)本实施例中，用来研究的本发明的生物芯片试剂盒，选自实施例4制备的生物芯片试剂盒。比较研究的一般方法与实施例5相同，仅提供的对照芯片试剂盒不同。
在本实施例中，其中均含分离系统和亲和纳米粒子，只是配基/纳米粒子混合物的组成不同。本发明优选的生物芯片试剂盒，配基/纳米粒子混合物中，自由配基的含量小于50％，某些甚至小于20％；非亲和纳米粒子的含量小于50％，某些甚至小于20％。然而，利用弱活化纳米粒子或非活化纳米粒子在相同条件下的制备中，自由配基的含量可以大于50％，非亲和纳米粒子的含量可以大于50％。后者被用于对照芯片试剂盒中。
本实施例中，在同等条件下，利用本发明优选的生物芯片试剂盒所获得的灵敏度(或测定下限)，是利用上述对照芯片试剂盒所获得的灵敏度(或测定下限)的200％以上。
权利要求
1.一种分析装置，其组成包括分析反应器和分离系统，特征在于所述分离系统包括纳米分离系统，或/和磁悬浮吸附系统；前者是以纳米尺寸的物质为分离目标物的分离系统；后者是指吸附物在磁场作用下，悬浮在柱子中的指定位置，来吸附分离目标物的吸附系统。
2.按照利要求1所述的分析装置，其特征在于在本分析装置中，其纳米分离系统，包括含稳定过滤介质的纳米过滤系统。
3.按照权利要求1所述的分析装置，其特征在于在本分析装置中，其纳米分离系统，包括含可撤消过滤介质的纳米过滤系统。
4.按照权利要求1所述的分析装置，其特征在于在本分析装置中，其纳米分离系统，包括纳米离心系统。
5.按照权利要求1-4之一所述的分析装置，其特征在于在本分析装置中，其纳米分离系统，包括以分离包括全病毒微粒和病毒片段微粒为目标物的分离系统。
6.按照权利要求1所述的分析装置，其特征在于在本分析装置中，其磁悬浮吸附系统，为包括含磁粒子的吸附物的吸附系统。
7.按照权利要求6所述的分析装置，其特征在于所述含磁粒子包括磁纳米粒子。
8.按照权利要求6所述的分析装置，其特征在于在本分析装置中，以含磁粒子为吸附物的磁悬浮吸附系统，包括以磁纳米粒子为吸附物的磁悬浮吸附系统。
9.按照权利要求1-7之一所述的分析装置，其特征在于在本分析装置中，其组成还包括有一种或多种亲和纳米粒子，其中所述亲和纳米粒子含纳米粒子，以及固定在纳米粒子上的分离目标物的配基。
10.按照权利要求9所述的分析装置，其特征在于在其组成包括的一种或多种亲和纳米粒子中，至少有一种亲和纳米粒子的自由配基含量小于50％，且非亲和纳米粒子的含量小于50％。
11.按照权利要求1-9之一所述的分析装置，其特征在于在其至少一个分析反应器中，既固定有探针抗体，又固定有探针抗原。
12.按照权利要求8-10之一所述的分析装置，其特征在于在其至少一个分析反应器中既有配基为抗原的亲和纳米粒子，又有配基为抗体的亲和纳米粒子。
13.按照权利要求8-11之一所述的分析装置，其特征在于构成其组成成分的亲和纳米粒子，包括用于标记的亲和纳米粒子。
14.按照权利要求1-13之一所述的分析装置，其特征在于为具有上述分离系统和反应器的生物芯片试剂盒。
15.一种分析方法，包括下述步骤提供样品和权利要求1-13之一所述的分析装置。
16.按照权利要求15所述的分析方法还包括下述步骤用所述纳米分离系统，分离获得样品中可能存在的分析目标物粒子；再将分离出的分析目标物粒子固定在反应器中。
17.按照权利要求15所述的分析方法还包括下述步骤用所述亲和纳米粒子，与样品中可能存在的分析目标物反应，形成目标物/亲和纳米粒子复合物；然后用所述纳米分离系统，分离目标物/亲和纳米粒子复合物；再将分离出的目标物/亲和纳米粒子复合物固定在反应器中。
18.按照权利要求15-17之一所述的分析方法，还包括用磁性亲和纳米粒子进行标记的步骤。
19.按照权利要求15所述的分析方法，还包括下述步骤用所述磁悬浮吸附系统分离分析目标物，再将分离出的所述目标物固定在反应器中。
20.按照权利要求19所述的分析方法，还包括将磁性亲和纳米粒子固定在反应器中的分析目标物上。
21.制备本发明分析装置的方法，包括所述亲和纳米颗粒的制备，使得所其含亲和纳米颗粒的组成中非固定配基的含量小于配基总量的5％，以及非亲和纳米颗粒的含量小于纳米颗粒总量的30％。
22.按照权利要求21所述制备本发明分析装置的方法，其特征在于包括制备权利要求1-8之一所述的分离系统。
23.按照权利要求21所述制备本发明分析装置的方法，其特征在于包括制备具有权利要求1-13之一所述分离系统和反应器的试剂盒。
全文摘要
本发明公开一种分析装置，其组成包括分析反应器和分离系统，其特征在于所述分离系统包括a.纳米分离系统，其中所述纳米分离系统，是指以纳米尺寸的物质为分离目标物的尺寸分离系统；或/和b.磁悬浮吸附系统，其中所述磁悬浮吸附系统，是指吸附物在磁场作用下，悬浮在柱子中的指定位置，来吸附分离目标物的吸附系统。本发明分析装置，可对样品中的目标物进行分离，至少可进行目标物的相对浓缩(目标物浓度与其它生物分子浓度之比大大增大)，从而大大提高了检测灵敏度。
文档编号G01N1/28GK1834657SQ20061002075
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者邹方霖, 王建霞, 陈春生 申请人:成都夸常医学工业有限公司