专利名称：戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及属于血清(浆)抗体的ELISA检测方法的血清(浆)中戊型肝炎病毒中和抗体检测方法，尤其涉及戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测方法。
背景技术：
戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是无包膜的单正链RNA病毒，经粪口途径传播，引起的急性戊型肝炎(hepatitis E，HE)，多表现为急性黄疸型肝炎，易发展为亚急性重症肝炎或淤胆肝炎。根据中华人民共和国卫生部27种法定报告传染病疫情报告统计，HE发病率高，死亡率高，近年来呈逐年上升趋势。2002年～2005年11月HE平均病死率约为0.37％，远较同样经粪口途径传播的甲型肝炎(0.06％)为高，在病毒性肝炎中高居首位，尤其是孕妇患病，病死率高达20％甚至35％，且易感人群多为15～59岁的青壮年，危害严重。目前HE尚无特异的治疗方法，也无主动和被动免疫制剂可供预防。国内外学者致力于戊型肝炎病毒疫苗的研究。疫苗的有效性在于诱导机体产生中和抗体，与病毒结构蛋白上的中和抗原表位结合，阻断该表位与敏感细胞的细胞膜上的相应受体结合，从而阻止该病毒入侵敏感细胞，发挥疫苗的保护作用。而衡量疫苗是否有效的标准，就是疫苗能否诱导产生中和抗体，以及诱导产生中和抗体的能力，传统采用体内和(或)体外中和试验鉴定疫苗的有效性。目前对戊型肝炎病毒敏感的动物只有非人灵长类动物，然而非人灵长类动物感染戊型肝炎病毒后多为亚临床型感染，难以获得满意的动物模型，而且使用非人灵长类动物建立动物模型，价格昂贵，方法繁琐，试验周期长，动物饲养要求高，耗费大量的人力物力，难以在基层广泛使用。另外，由于戊型肝炎病毒缺乏有效的组织培养体系，传统的体外中和试验鉴定难以进行，1998年孟继鸿等发明了基于PCR和细胞培养的体外中和试验用以评价戊型肝炎病毒疫苗的有效性，但该体外中和试验需要细胞培养及RT-PCR技术，方法繁琐，价格也较昂贵，也难以普遍推广应用。因而开发一种简便易行的检测戊型肝炎病毒中和抗体的方法，是为当务之急。
发明内容
本发明的目的是研制出戊型肝炎病毒中和抗体竞争酶联免疫检测方法，代替戊型肝炎病毒体内和(或)体外中和试验，克服体内和(或)中和试验方法繁琐、昂贵、费时、费力的缺点，评价疫苗的有效性。
本发明是这样实现的一种戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测方法血清(浆)或其他生物学样本中的抗戊型肝炎病毒中和抗体与酶标记戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体竞争结合包被抗原上的中和抗原表位，根据酶作用底物显色反应减弱的程度，实现对生物学样本中的戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测。
上述包被抗原为不同基因型和亚型的戊型肝炎病毒开放读码框架2或其片段编码的重组蛋白或多肽，可单独或组合形成包被抗原。
本发明的积极效果一、简便快速应用竞争法ELISA检测戊型肝炎病毒中和抗体，简便易行，可随时随地进行，克服了体内和(或)体外中和试验方法繁琐、费时费力的缺点，可用于科研院所开发疫苗的实验评价，也可在基层推广应用。二、特异性强由于应用戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体作为竞争结合物，能与其产生竞争的仅有戊型肝炎病毒中和抗体，因而具有高度的特异性。三、成本低、安全性好由于使用ELISA方法，实验中所应用试剂生产操作成本低，克服了体内中和试验使用非人灵长类动物，价格昂贵、耗时、耗力的缺点，且不须接触感染性的病毒颗粒或病毒核酸，不会对任何环境造成污染，安全性好。四、社会效益好戊型肝炎病毒感染呈逐年上升趋势，HE病死率高，青壮年易感，危害严重，疫苗的应用是预防传染病的重要措施，建立简便有效的疫苗评价方法，可以对疫苗的有效性进行较好的评价，降低社会防治成本，具有良好的社会效益。
图1是本发明实施例所采用竞争ELISA检测戊型肝炎病毒疫苗免疫恒河猴血清抗-戊型肝炎病毒中和抗体的结果图。
图2是本发明戊型肝炎病毒中和抗体竞争酶联免疫检测方法流程示意图。
具体实施例方式
以下实施例详述本发明1、包被抗原的获得包被抗原来自不同基因型和亚型的戊型肝炎病毒开放读码框架2或其片段编码的重组蛋白或多肽，可单独或组合形成包被抗原。下面以具有代表性的7株戊型肝炎病毒为例详述包被抗原的获得。
7株戊型肝炎病毒分别为来自第I基因型Ia亚型的戊型肝炎病毒缅甸株(M73218)、Ib亚型的戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)、Ic亚型的戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)，来自第II基因型的戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)，来自第III基因型的戊型肝炎病毒美国株(AF060668)和戊型肝炎病毒新西兰猪株(AF082843)，以及来自第IV基因型的戊型肝炎病毒中国株(AJ272108)。
7株戊型肝炎病毒ORF2编码核苷酸序列分别为戊型肝炎病毒缅甸株(M 73218)ORF2Atgcgccctcggcctattttgttgctgctcctcatgtttttgcctatgctgcccgcgccaccgcccggtcagccgtctggccgccgtcgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgaccgggttgattctcagcccttcgcaatcccctatattcatccaaccaaccccttcgcccccgatgtcaccgctgcggccggggctggacctcgtgttcgccaacccgcccgaccactcggctccgcttggcgtgaccaggcccagcgccccgccgttgcctcacgtcgtagacctaccacagctggggccgcgccgctaaccgcggtcgctccggcccatgacaccccgccagtgcctgatgtcgactcccgcggcgccatcttgcgccggcagtataacctatcaacatctccccttacctcttccgtggccaccggcactaacctggttctttatgccgcccctcttagtccgcttttaccccttcaggacggcaccaatacccatataatggccacggaagcttctaattatgcccagtaccgggttgcccgtgccacaatccgttaccgcccgctggtccccaatgctgtcggcggttacgccatctccatctcattctggccacagaccaccaccaccccgacgtccgttgatatgaattcaataacctcgacggatgttcgtattttagtccagcccggcatagcctctgagcttgtgatcccaagtgagcgcctacactatcgtaaccaaggctggcgctccgtcgagacctctggggtggctgaggaggaggctacctctggtcttgttatgctttgcatacatggctcactcgtaaattcctatactaatacaccctataccggtgccctcgggctgttggactttgcccttgagcttgagtttcgcaaccttacccccggtaacaccaatacgcgggtctcccgttattccagcactgctcgccaccgccttcgtcgcggtgcggacgggactgccgagctcaccaccacggctgctacccgctttatgaaggacctctattttactagtactaatggtgtcggtgagatcggccgcgggatagccctcaccctgttcaaccttgctgacactctgcttggcggcctgccgacagaattgatttcgtcggctggtggccagctgttctactcccgtcccgttgtctcagccaatggcgagccgactgttaagttgtatacatctgtagagaatgctcagcaggataagggtattgcaatcccgcatgacattgacctcggagaatctcgtgtggttattcaggattatgataaccaacatgaacaagatcggccgacgccttctccagccccatcgcgccctttctctgtccttcgagctaatgatgtgctttggctctctctcaccgctgccgagtatgaccagtccacttatggctcttcgactggcccagtttatgtttctgactctgtgaccttggttaatgttgcgaccggcgcgcaggccgttgcccggtcgctcgattggaccaaggtcacacttgacggtcgccccctctccaccatccagcagtactcgaagaccttctttgtcctgccgctccgcggtaagctctctttctgggaggcaggcacaactaaagccgggtacccttataattataacaccactgctagcgaccaactgcttgtcgagaatgccgccgggcaccgggtcgctatttccacttacaccactagcctgggtgctggtcccgtctccatttctgcggttgccgttttagccccccactctgcgctagcattgcttgaggataccttggactaccctgcccgcgcccatacttttgatgatttctgcccagagtgccgcccccttggccttcagggctgcgctttccagtctactgtcgctgagcttcagcgccttaagatgaaggtgggaaatcgggagttgtag戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)ORF2Atgcgccctcggcctattttgctgttgctcctcatgtttctgcctatgctgcccgcgccaccgcccggtcagccgtctggccgccgtcgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgaccgggttgattctcagcccttcgcaatcccctatattcatccaaccaaccccttcgcccccgatgtcaccgctgcggccggggctggacctcgtgttcgccaacccgcccgaccactcggctccgcttggcgtgaccaggcccagcgccccgccgctgcctcacgtcgtagacctaccacagctggggccgcgccgctaaccgcggtcgctccggcccatgacaccccgccagtgcctgatgttgactcccgcggcgccatcctgcgccggcagtataacctatcaacatctcccctcacctcttccgtggccaccggcaaatttggttctttacgccgctcctcttagcccgcttctacccctccaggacggcaccaatactcatataatggctacagaagcttctaattatgcccagtaccgggttgctcgtgccacaattcgctaccgcccgctggtccccaacgctgttggtggctacgctatctccatttcgttctggccacagaccaccaccaccccgacgtccgttgacatgaattcaataacctcgacggatgtccgtattttagtccagcccggcatagcctccgagcttgttattccaagtgagcgcctacactatcgcaaccaaggttggcgctctgttgagacctccggggtggcggaggaggaggccacctctggtcttgtcatgctctgcatacatggctcacctgtaaattcttatactaatacaccctataccggtgccctcgggctgttggactttgccctcgaacttgagttccgcaacctcacccccggtaataccaatacgcgggtctcgcgttactccagcactgcccgtcaccgccttcgtcgcggtgcagatgggactgccgagctcaccaccacggctgctactcgcttcatgaaggacctctattttactagtactaatggtgttggtgagatcggccgcgggatagcgcttaccctgtttaaccttgctgacaccctgcttggcggtctaccgacagaattgatttcgtcggctggtggccagctgttctactctcgccccgtcgtctcagccaatggcgagccgactgttaagctgtatacatctgtggagaatgctcagcaggataagggtattgcaatcccgcatgacatcgacctcggggaatcccgtgtagttattcaggattatgacaaccaacatgagcaggaccgaccgacaccttccccagccccatcgcgtcctttttctgtcctccgagctaacgatgtgctttggctttctctcaccgctgccgagtatgaccagtccacttacggctcttcgaccggcccagtctatgtctctgactctgtgaccttggttaatgttgcgaccggcgcgcaggccgttgcccggtcactcgactggaccaaggtcacacttgatggtcgccccctttccaccatccagcagtattcaaagaccttctttgtcctgccgctccgcggtaagctctccttttgggaggcaggaactactaaagccgggtacccttataattataacaccactgctagtgaccaactgctcgttgagaatgccgctgggcatcgggttgctatttccacctacactactagcctgggtgctggccccgtctctatttccgcggttgctgttttagccccccactctgtgctagcattgcttgaggataccatggactaccctgcccgcgcccatactttcgatgacttctgcccggagtgccgcccccttggcctccagggttgtgcttttcagtctactgtcgctgagcttcagcgccttaagatgaaggtgggtaaaactcgggagttatag戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)ORF2Atgcgccctcggcctattttgttgctgttcctcatgtttctgcctatgttgcccgcgccaccgtccggtcagccgtctggccgccgtcgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgaccgggttgattctcagcccttcgcaatcccctatattcatccaaccaaccccttcgcccccgatgtcaccgctgcggccggggctggacctcgtgttcgccaacccgcccgaccactcggctccgcttggcgtgaccaggcccagcgccccgccgctgcctcacgtcgtagacctaccacagctggggccgcgccgctgactgcggttgctccggcccatgataccccgcctgtgcccgatgttgattctcgcggcgctatcttgcgccggcagtataatctttcaacatcccctcttacctcctccgtggccactggcaccaatttggtcctttatgctgcccctcttagcccgcttttgccccttcaggacggcaccaatactcatataatggccacggaggcttccaattatgcccagtaccgagttgcccgcgccacaatccgctaccgccctctggttcccaatgctgttggtggctatgctatctctatatcgttctggccgcagaccactaccaccccgacgtccgtcgacatgaattctataacctcgacggatgttcgtattctcgtccagcccggtattgcctcagagcttgtgattccaagtgaacgcctgcattatcgcaaccagggttggcgctctgttgaaacctccggggtggcggaggaggaggccacctctggccttgtcatgctttgtatacatggctcacctgtgaactcttatactaacacaccttacactggtgccctcgggttgttggattttgctctcgagcttgagttccgcaacctcacccctggtaacaccaatacacgggtttcccgctactctagcaccgccc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73218)pORF2MRPRPILLLLLMFLPMLPAPPPGQPSGRRRGRRSGGSGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVTAAAGAGPRVRQPARPLGSAWRDQAQRPAVASRRRPTTAGAAPLTAVAPAHDTPPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVATGTNLVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSLVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLYFTSTNGVGEIGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYPARAHTFDDFCPECRPLGLQGCAFQSTVAELQRLKMKVGKTREL.
戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)pORF2MRPRPILLLLLMFLPMLPAPPPGQPSGRRRGRRSGGSGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVTAAAGAGPRVRQPARPLGSAWRDQAQRPAAASRRRPTTAGAAPLTAVAPAHDTPPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVATGTNLVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLYFTSTNGVGEIGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSVLALLEDTMDYPARAHTFDDFCPECRPLGLQGCAFQSTVAELQRLKMKVGKTREL.
戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)pORF2MRPRPILLLFLMFLPMLPAPPSGQPSGRRRGRRSGGSGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVTAAAGAGPRVRQPARPLGSAWRDQAQRPAAASRRRPTTAGAAPLTAVAPAHDTPPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVATGTNLVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLYFSSTNGVGEIGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYPARAHTFDDFCPECRPLGLQGCAFQSTVAELQRLKMKVGKTREL.
戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)pORF2MRPRPLLLLFLLFLPMLPAPPTGQPSGRRRGRRSGGTGGGFWGDRVDSQPFAIPYIHPTNPFAPDVAAASGSGPRLRQPARPLGSTWRDQAQRPSAASRRRPATAGAAALTAVAPAHDTSPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPPLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVARATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTTCNTNTRVSRYSSTARHSARGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGLNGVGEVGRGIALTLLNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGVAIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYISDSVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLPTVEQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTRLGAGPVAISAAAVLAPRSALALLEDTFDYPGRAHTFDDFCPECRALGLQGCAFQSTVAELQRLKVKVGKTREL.
戊型肝炎病毒美国株(AF060668)pORF2MRPRAVLLLFLMFLPMLPAPPAGQPSGRRRGRRSGGAGGGFWSDRVDSQPFALPYIHPTNPFAADVVSQPGAGTRPRQPPRPLGSAWRDQSKRPSVAPRRRSTPAGAAPLTAISPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYXQTTYGSSTNPMYVSDTVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKKFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKMKVGKTRES.
戊型肝炎病毒新西兰猪株(AF082843)pORF2MRPRAVLLLLFVLLPMLPAPPAGQPSGRRCGRRNGGAGGGFWGDRVDSQPFALPYIHPTNPFAADVVSQPGAGVRPRQPPRPLGSAWRDQSQRPSTAPRRRSAPAGAAPLTAVSPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVAAGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRWRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKMKVGKTRES.
戊型肝炎病毒中国株(AJ272108)pORF2MNNMFFCSVHGDATMRSRALLFLLFVLLPMLPAPPAGQPSGRRRGQAGCGGGFWGDRVDSQPFALPYIHPTNPFASDIPAAAGTGARPRQPIRPLGSAWRDQSQRPAASTRRRPAPAGASPLTAVAPAPDTAPVPDADSRGAILRRQYNLSTSPLTSTIATGTNFVLYAAPLSPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVTPSERLHYRNQGWRSVETSGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYSSSARHKLRRGPDGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGELTVKLYTSVENAQQDKGVAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSVSAVGVLAPHSALAALEDTADYPARAHTFDDFCPECRALGLQGCAFQSTVGELQRLKMKVGKTREY.
抗原蛋白选择戊型肝炎病毒ORF2或其片段编码的重组蛋白或多肽，优选戊型肝炎病毒ORF2编码第452～617位氨基酸之间166个氨基酸的重组蛋白，命名为p166，氨基酸序列如下戊型肝炎病毒缅甸株(M 73218)p166BurTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYP戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)p166SarPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSVLALLEDTMDYP戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)p166MorPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPHSALALLEDTLDYP戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)p166MexPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYISDSVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLPTVEQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTRLGAGPVAISAAAVLAPRSALALLEDTFDYP戊型肝炎病毒美国株(AF060668)p166UsPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYXQTTYGSSTNPMYVSDTVTLVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKKFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP戊型肝炎病毒新西兰猪株(AF082843)p166NzPSPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSVSAVGVLAPHSALAILEDTVDYS戊型肝炎病毒中国株(AJ272108)p166ChnPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYP(1)根据序列合成特异性引物，以上述7株戊型肝炎病毒基因组序列为模板，分别扩增上述7株戊型肝炎病毒编码ORF2C端452～617位氨基酸的基因片段。PCR条件为94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入质粒载体pGEX-4T-2载体(Pharmacia产品)。
引物序列为戊型肝炎病毒缅甸株(M 73218)p166Bur引物B1CCC GGA TTC CCG ACGCCT TCT CCA GCC CCA TC，引物B2CCC CTC GAG TCA AGG GTA GTCCAA GGT ATC CTC AA；戊型肝炎病毒巴基斯坦株(M80581)p166Sar引物S1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCA TC，引物S2CCC CTC GAG TCA AGG GTA GTC CATGGT ATC CTC AA；戊型肝炎病毒摩洛哥株(AY230202)p166Mor引物Mo1CCC GGA TTC CCGACC CCT TCT CCT GCC CCA TC，引物Mo2CCC CTC GAG TCA AGG GTAATC CAG GGT ATC CTC AA戊型肝炎病毒墨西哥株(M74506)p166Mex引物Me1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCA TC，引物Me2CCC CTC GAG TCA CGG ATA ATCAAA AGT ATC CTC CA；戊型肝炎病毒美国株(AF060668)p166Us引物U1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCATC，引物U2CCC CTC GAG TCA TCC TAT TAG TTGTCA TAG GAG C戊型肝炎病毒新西兰猪株(AF082843)p166Nz引物N1CCC GGA TTC CCGACC CCT TCT CCT GCC CCA TC，引物N2CCC CTC GAG TCA CGA ATA ATCAAC AGT ATC TTC AA；戊型肝炎病毒中国株(AJ272108)p166Chn引物C1CCC GGA TTC CCG ACCCCT TCT CCT GCC CCA TC，引物C2CCC CTC GAG TCA AGG GTA ATC AACAGT GTC CTC CA。
(2)将表达质粒转化入表达菌株E.coli JM109菌株(Promega产品)中，挑取单菌落，用含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基培养至OD550＝0.6～0.8，用终浓度为0.2～1.0mM IPTG进行诱导，诱导温度为37℃，摇床摇速为200rpm，3-4小时后离心收集菌体，用细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.2，300mM NaCl)悬浮菌体沉淀，冻融6次后超声破碎菌体，离心收集上清液，经GST-Sepharose4B(Pharmacia产品)亲和层析纯化，得到7种代表戊型肝炎病毒不同基因型和亚型的重组蛋白即抗原，分别命名为p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn。最后使用UV280、SDS-PAGE等方法进行检测、定量。
2、中和性单克隆抗体的制备和鉴定(1)动物免疫采用常规方法分别以代表4种主要基因型戊型肝炎病毒的重组蛋白p166Bur、p166Mex、p166US和p166Chn各50μg与福氏佐剂混合腹腔注射免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，共3次，间隔2周至1月。
(2)杂交瘤细胞株的建立用所免疫的p166Bur、p166Mex、p166US和p166Chn重组蛋白包被酶标反应板，GST包被酶标反应板作为对照孔。采用间接ELISA法筛选，凡p166Bur、p166Mex、p166US和p166Chn阳性，同时GST阴性者，为单克隆抗体阳性孔。经3次亚克隆，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别对应为4G5、8G10、3D4和5G5。
(3)单克隆抗体的大量制备和鉴定采用制备腹水和培养瓶直立培养法大量制备单克隆抗体。以HRP标记的兔抗鼠IgG亚类抗体及兔抗鼠IgM抗体为二抗，采用间接ELISA法检测鉴定单克隆抗体免疫球蛋白类型和亚类。所收集的培养上清或腹水经倍比稀释后用ELISA法检测抗体效价。
表1.戊型肝炎病毒单克隆抗体的免疫球蛋白类型和亚类及其抗体效价
(4)单克隆抗体特异性鉴定采用间接ELISA法和Western-blot法鉴定所获得的单克隆抗体s与7种不同戊型肝炎病毒基因型和亚型的p166重组蛋白(p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn)的反应性。
表2.戊型肝炎病毒单克隆抗体与不同基因型和亚型p166重组蛋白的反应性
(5)单克隆抗体的体外中和试验鉴定1)培养PLC/PRF/5细胞生长至单层；2)将倍比稀释的单克隆抗体腹水100ul与含100TCID50/100ul戊肝病毒悬液混合，37℃共同孵育2小时后接种PLC/PRF/5细胞；3)37℃共同孵育2小时后，洗去未吸附的病毒，使用Trizol法提取核酸，以引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCGGCC AAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGCCA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)进行逆转录-巢式PCR检测戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR条件为第一轮94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35个循环，引物为引物3和引物6；第二轮94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30个循环，引物为引物4和引物5；4)RT-PCR阴性判为中和试验阳性，最后将能中和病毒的单克隆抗体4G5、8G10、3D4和5G5判为戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体。
(6)单克隆抗体的纯化1)单克隆抗体离心去除沉淀，滤纸过滤去除脂质，加入1/10体积的1M Tris.HCl，PH 8.0，调节PH至中性；2)用10倍体积的1MTris.HCl，PH 8.0平衡Pierce公司生产的Protein G琼脂糖凝胶预装柱；3)上样取1ml预处理的单克隆抗体腹水上柱，室温孵育10min；4)洗柱加入10倍体积的(0.1M Tris.HCl，PH 8.0)洗柱，洗去未结合之蛋白，检测A280，至A值降至基线；5)洗脱每次加入1倍柱体积的洗脱缓冲液0.05M Gly.HCl，PH 2.5-3.0洗脱结合在纯化柱上的单克隆抗体，收集、混合，测定A280值定量，分装后-20℃保存。
3、酶标记单克隆抗体的制备本实施例以辣根过氧化物酶为例详述酶标记单克隆抗体的制备。
1)称取辣根过氧化物酶5mg，溶解于0.2ml去离子水中，滴加新鲜配制的0.1mol/L高碘酸钠(NaIO4)溶液0.04ml，室温搅拌20分钟；2)将醛化的辣根过氧化物酶装入透析袋，对1mmol/L醋酸缓冲液(PH4.4)透析过夜；3)加入0.2mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.5)调整辣根过氧化物酶溶液PH值为9.0～9.5，立即加入戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体(PH9.0～9.5)；4)加入新鲜配制的硼氢化钠溶液(4mg/ml)0.02ml，4℃静止2小时；5)加入等量的饱和硫酸钠溶液，4℃静止30分钟，5000rpm离心30分钟，去上清；6)沉淀以适量PBS溶解，装入透析袋，对PBS透析48小时，即为辣根共氧化物酶标记的戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体，加入1％牛血清白蛋白，再加入等体积甘油，-20℃保存。
4、戊型肝炎病毒中和抗体竞争ELISA检测方法的建立以戊型肝炎病毒ORF2或其片段编码的重组蛋白或多肽作为包被抗原，可单独或组合形成包被抗原，下面以p166重组蛋白为例详述戊型肝炎病毒中和抗体竞争ELISA检测方法的建立。
(1)包被抗原1)包被抗原可以这样选择上述7株戊型肝炎病毒ORF2C端编码452～617位氨基酸的重组蛋白p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn可分别形成包被抗原，用PH9.50.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至10～2000ng/ml，100μl/孔加入酶标反应板，4℃包被过夜。
2)包被抗原也可以这样选择上述7株戊型肝炎病毒ORF2C端编码452～617位氨基酸的重组蛋白p166Bur、p166Pak、p166Mor、p166Mex、p166Us、p166Nz和p166Chn可以1∶1比例等浓度混合，再用PH9.50.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至10～2000ng/ml，100μl/孔加入酶标反应板，4℃包被过夜。
(2)洗涤包被第二天，以洗涤液(PH7.00.01mol/L PBS，0.05％tween-20)洗板3次；(3)检测取包被反应板，在检测孔中加入待测样本50μl、阳性对照孔加入已知的阳性血清50μl、阴性对照孔中加入已知的阴性血清50μl、参比对照孔加入PBS(0.05mol/L，PH7.0)50μl，再加入酶标戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体50μl，37℃共同孵育40分钟，洗涤液洗板5次，洗去未结合的抗体；(4)显色加入酶的底物，该底物可以是辣根过氧化物酶的底物，室温下显色10～15min；(5)终止加入终止液终止显色反应，读取OD值；(6)结果判定根据公式抑制率＝(1-待测样品孔OD值/参比对照孔OD值)×100％，以抑制率大于50％判断为阳性。
5、戊型肝炎病毒中和抗体竞争ELISA检测方法在戊型肝炎病毒疫苗评价中的应用采集本试验室制备的戊型肝炎病毒ORF2重组蛋白疫苗免疫的恒河猴血清，其中10μg组、20μg组各3只，每4周免疫一次，共免疫3次，对照组恒河猴3只，采用相同方案以PBS(.0.05mol/3，PH7.0)1ml免疫，每4周免疫一次，共免疫3次。8周时实验组和对照组9只恒河猴以中国株戊型肝炎病毒病毒悬液1ml(PCR滴度107)攻击。各组恒河猴从0周开始每周采血一次，应用本发明的戊型肝炎病毒中和抗体竞争ELISA检测方法检测中和性抗体产生情况，见图1。从图中数据可见，免疫组自免疫4周开始，血清抗-戊型肝炎病毒中和抗体有明显升高，并于8-9周后达到高峰，于6周左右开始中和抗体竞争抑制率≥50％。对照组自病毒攻击4周后血清抗-戊型肝炎病毒中和抗体开始升高，并于攻毒9周后达到高峰。证明我们建立的戊型肝炎病毒中和抗体竞争ELISA检测抗-戊型肝炎病毒中和抗体行之有效，可用于疫苗的筛选和评价。
权利要求
1.一种戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测方法，其特征在于血清(浆)或其他生物学样本中的抗戊型肝炎病毒中和抗体与酶标记戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体竞争结合包被抗原上的中和抗原表位，根据酶作用底物显色反应减弱的程度，实现对生物学样本中的戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测。
2.如权利要求1所述的戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测方法，包被抗原为不同基因型和亚型的戊型肝炎病毒开放读码框架2或其片段编码的重组蛋白或多肽，可单独或组合形成包被抗原。
全文摘要
本发明公开了一种戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测方法，其特征在于血清(浆)或其他生物学样本中的抗戊型肝炎病毒中和抗体与酶标记戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体竞争结合包被抗原上的中和抗原表位，根据酶作用底物显色反应减弱的程度，实现对生物学样本中的戊型肝炎病毒中和抗体的竞争酶联免疫检测。与现有技术相比，本发明具有一、简便快速应用竞争法ELISA检测戊型肝炎病毒中和抗体，简便易行。二、特异性强由于应用戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体作为竞争结合物，能与其产生竞争的仅有戊型肝炎病毒中和抗体，因而具有高度的特异性。三、成本低、安全性好由于使用ELISA方法，实验中所应用试剂生产操作成本低，且不须接触感染性的病毒颗粒或病毒核酸，安全性好。
文档编号G01N33/543GK1793929SQ20061003762
公开日2006年6月28日 申请日期2006年1月6日 优先权日2006年1月6日
发明者孟继鸿, 戴星, 梁久红, 田华, 赵宇, 董晨, 汪源, 邓蕾, 张红梅 申请人:东南大学