专利名称：心肌分化相关蛋白Ybx－1的鉴定及其在心血管疾病治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的组合方法，该方法能够用于心肌细胞体外分化过程中差异表达蛋白的筛选和鉴定。本发明进一步提供了该方法鉴定的差异表达蛋白及其应用，涉及心肌细胞分化前后差异表达蛋白Ybx-1在干细胞治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞中的多种应用，诸如药物、诊断和治疗应用。
背景技术：
冠心病和心肌病是常见的心血管疾病，它们都可以引起心肌的损伤甚至坏死。由于心肌细胞属于终末分化的细胞，在出生后就失去增殖能力或增殖能力极低，因此干细胞定向诱导分化为心肌细胞，修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为治疗心肌梗死的一种替代手段。P19CL6是小鼠胚胎性癌细胞P19衍生的细胞系，用含1％DMSO的分化培养基培养时，该细胞能高效的分化成搏动的心肌细胞心肌特异性的转录因子如Nkx2-5、GATA-4和MEF2C表达上调，10天左右就可以观察到肌小节肌球蛋白重链(MHC)的表达。该细胞系的成功建立及其体外成功诱导分化为心肌细胞，为我们在体外研究心肌细胞的分化提供了良好的模型，也为干细胞治疗心血管疾病提供了新的思路。
心肌细胞的分化是一个极其复杂的过程，由于涉及不同时间段若干基因的先后表达，故难以用单一的检测方法对差异表达的基因和蛋白逐一进行研究。而基因只是遗传信息的载体，它的表达产物蛋白质才是行使生命功能的直接因素。因此引入高通量的系统、同步研究方法，成为目前寻找差异表达蛋白的突破口。蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学，它在蛋白质水平定量、动态、整体地研究生物体的生理或病理过程，并由此获得对疾病过程中细胞生理和生化过程及其调控网络的广泛而完整的了解。寻找P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达的蛋白，从中挖掘可能具有重要功能的蛋白，有助于我们更好的理解心肌细胞分化的机制，对于应用干细胞治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞具有重要的意义。
Ybx-1是P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中表达上调的蛋白，属于冷休克结构域(coldshock domain)超家族的一员，它在不同的生物过程中行使转录和翻译调节，药物抗性，DNA修复和细胞增殖等功能。Ybx-1在不同的组织广泛表达，在心脏，肌肉，肝，脑等表达量较高，敲除Ybx-1基因小鼠在E13.5天就会出现严重的发育迟缓，提示Ybx-1在胚胎发育过程中起到重要的作用。有研究报道Ybx-1可以结合于心肌特异表达的基因MLC-2v(cardiac myosinlight-chain 2v)启动子区并激活含有MLC-2v启动子的报告基因的活性，而转录抑制因子CARP(cardiac ankyrin repeat protein)作为心肌早期分化的标志(已经证实为Nkx2-5的下游靶蛋白)，也在胚胎发育过程中在心脏高表达，它可以结合Ybx-1，二者共同调节MLC-2v基因的表达，使得MLC-2v维持合适的表达水平。在P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中，二者的表达水平均升高，因此我们推测Ybx-1与CARP共同促进心肌细胞的分化。
本研究通过寻找P19CL6细胞分化为心肌细胞前后差异表达蛋白，发现Ybx-1在P19CL6细胞分化为心肌细胞后表达明显上调具有重要意义，对深入研究Ybx-1在心肌细胞分化过程中的功能提供了基础，具有潜在的临床应用价值。
发明内容
本发明是在验证P19CL6细胞在1％DMSO诱导下成功分化成心肌细胞的基础上进行的。我们用抗MHC的单克隆抗体MF20检测其表达情况。未用DMSO诱导的P19CL6细胞，MF20染色为阴性；而用1％DMSO诱导12天的细胞，MF20染色为阳性。我们同时检测了心脏特异性的转录因子Nkx2-5、GATA-4、MEF2C的mRNA在诱导前后的表达变化，这些转录因子可以作为心肌细胞分化成功的标志，它们在诱导12天后的P19CL6细胞表达明显升高，说明P19CL6细胞用1％DMSO诱导12天成功的分化为心肌细胞。
本发明要解决的技术问题在于设计P19CL6细胞向心肌分化前后差异表达的蛋白的筛选和鉴定方法。本发明提供了一种基于蛋白质组学技术的研究P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达蛋白的筛选和鉴定方法。
本发明的方法包括以下步骤(1)双向电泳样品处理；(2)IPG胶条的等电聚焦分两步首先是干胶条的泡胀过程，同时样品中的蛋白质也随电泳液一起进入胶内；第二步是真正的聚焦过程，蛋白质根据其等电点逐渐迁移到对应的pH位置；(3)第二向SDS平衡，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶染色；(4)图像扫描与分析，寻找差异蛋白点；(5)P19CL6向心肌细胞分化前后差异蛋白的鉴定，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析方法，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽图谱进行数据库查询，鉴定差异表达的蛋白。
在上述工作基础上，本发明的目的是提供P19CL6细胞向心肌细胞分化前后有意义的差异表达蛋白。Ybx-1在P19CL6细胞分化为心肌细胞后表达上调，Ybx-1与P19CL6细胞向心肌细胞的分化密切相关，参与心肌细胞分化的表达调控。
本发明的目的还在于Ybx-1可用于干细胞种植心肌再生或心肌细胞重建治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞，以及围绕Ybx-1而开发的相应治疗心脏疾病的新方案。
小结本发明应用实时荧光定量技术(Real time PCR)、免疫荧光等技术，证实P19CL6细胞成功的分化成心肌细胞。在此基础上，应用双向电泳技术寻找P19CL6细胞分化前后差异表达的蛋白点，通过基质辅助激光解析电离质谱测量法(MALDI-TOF-MS)鉴定，本发明发现Ybx-1在P19CL6细胞向心肌细胞分化过程中表达上调；我们还用电喷雾电离质谱对Ybx-1蛋白点PMF中的两个肽段1696.03和1795.99进行测序，测序结果与Ybx-1的氨基酸序列完全匹配；本发明还应用Real-time PCR技术进一步证实Ybx-1 mRNA在分化过程中表达水平上调；本发明获得了Ybx-1的cDNA克隆，并得到了Ybx-1的抗体，为深入研究Ybx-1在心肌细胞分化中的功能奠定了良好的基础。
下面结合附图对本发明作进一步阐述。
图1，A用MF20抗体检测肌球蛋白重链的表达BReal time PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5，GATA-4，MEF2C的mRNA表达水平图2，P19CL6细胞(A)和1％DMSO诱导分化12天的P19CL6细胞(B)2-DE图谱的比较图3，放大显示的3号差异蛋白点图4，2-DE胶中3号差异蛋白点进行基质辅助激光解析电离质谱测量法(MALDI-TOF MS PMF)鉴定，结果显示该蛋白点为Ybx-1图5，电喷雾电离质谱技术对3号差异蛋白点(Ybx-1)的PMF中1696.03(A)和1795.99(B)进行测序的结果图6，Ybx-1在P19CL6细胞向心肌细胞方向分化过程中mRNA水平升高具体实施方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明，但并不限制本发明的范围。
实施例11)细胞固定用PBS清洗细胞两次，以4％多聚甲醛固定液室温固定10～15min。
2)PBS漂洗，3×5min。
3)细胞透化室温下，0.2％Triton/PBS透化处理12min。
4)PBS漂洗，3×5min。
5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃过夜。
6)一抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按一定的稀释度稀释的一抗MF20，将盖玻片有细胞的一面朝下伏于一抗上，密封于湿盒中，37℃，30min或者4℃过夜，后者的效果更好。
7)PBS漂洗，3×5min。
8)二抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按1∶50稀释的荧光素标记的二抗，37℃，30min。
9)DAPI染核，37℃，15min。
10)甲醇漂洗。
11)PBS漂洗，3×5min。
12)去离子水漂洗去盐，2×5min。
13)封片取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并照相。
实施例2双向电泳样品处理1)吸去细胞培养瓶中的培养基，从无细胞生长一侧加入约15ml无盐等渗漂洗液，翻转并轻柔晃动培养瓶，吸弃漂洗液，再重复漂洗两次。
2)将漂洗后的细胞培养瓶向一角倾斜放置于冰上，5分钟后用弯头巴斯德吸管尽可能吸除角落处残留的漂洗液。
3)向培养瓶中加入3～5倍细胞体积的裂解液，用细胞刮刀使裂解液与细胞层均匀接触，水平放置冰浴上30分钟。
4)收集细胞裂解液于1.5ml离心管中，4℃，14 000g离心30分钟。收集上清液，蛋白用Bradford法定量分装后于-80℃保存备用。
实施例3双向电泳IPG胶条的等电聚焦分两步首先是干胶条的泡胀过程，同时样品中的蛋白质也随电泳液一起进入胶内；第二步是真正的聚焦过程，蛋白质根据其等电点逐渐迁移到对应的pH位置。
1)从冰箱取出-20℃保存的IPG胶条(18cm长)，室温放置平衡。
2)取出-80℃保存的蛋白质样品，手握样品管使之快速融化，然后置于冰浴中。
3)样品的准备和加样样品量银染的取样量为150～250μg，考染上样量为800μg～1mg。
液体体积18cm胶条的终体积为350μl，其中1M DTT 7μl，IPG buffer 1.75μl。
加样顺序样品+重泡胀液+IPG buffer+DTT。
4)振荡混匀样品，12000g离心1分钟，转移混合液至等电聚焦电泳槽，操作过程防止产生气泡。
5)取出一根室温平衡的IPG胶条，用眼科弯头镊子夹住胶条的酸性端(带箭头一端)，同时用另一把镊子剥开并夹紧胶条上的保护膜缓慢向碱性端(平端)剥离。夹住胶条的碱性平端，胶面向下将胶条的酸性尖端放入电泳槽正极端。按住胶条酸性端，将碱性端缓慢向下放，在此过程中多次提起放下，使含样品的电泳液完全充满胶条下，并防止气泡发生。
6)向放置好胶条的等电聚焦电泳槽中加入覆盖油，将胶条完全覆盖，盖好盖子，以防止电泳液蒸发。操作完成一个样品后清洗镊子，完成其它样品的操作。
7)根据IPGphor等电聚焦电泳仪上标示的平板电极极性放置好电泳槽，如果跑多根胶条时等间距平行放置，关闭电源上盖。
8)打开电源，选择设置好的程序开始等电聚焦过程Voltage hoursGradient type30 12 step-n-hold200 1step-n-hold500 1step-n-hold10001step-n-hold20001step-n-hold50001step-n-hold80001Gradient800020 step-n-hold
记录总的小时伏，约80000vhs第二向SDS平衡聚焦完成的IPG胶条在开始第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳之前要先进行平衡。平衡的目的有两个第一是用SDS-PAGE的电泳缓冲液饱和IPG胶条，第二是充分打开蛋白质结构中的二硫键，将蛋白质中半胱氨酸上的巯基还原烷基化，以防止巯基氧化形成二硫键，并使分离的蛋白亚基与SDS充分结合，提高第二向SDS-PAGE的分辨率。因此平衡分两步进行，第一步在平衡液中加入二硫苏糖醇DTT将巯基还原，第二步在平衡液中加入碘代乙酰胺使巯基烷基化。
1)从等电聚焦电泳仪上取下聚焦完成的IPG胶条，装入含8ml平衡液A(使用前加入1M的DTT160μl)的玻璃平衡管，放于万向摇床上平衡15分钟2)取出IPG胶条，放入含8ml平衡液B(8ml平衡液中加入0.148g碘代乙酰胺)的新平衡管中，置摇床平衡15分钟。平衡的时间不宜过长，以免蛋白丢失。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1)第二向SDS-PAGE使用13％聚丙烯酰胺凝胶，凝胶的制备如下成分体积MilliQ水23.7ml30％丙烯酰胺储存液 34.67ml1.5M Tris(pH8.8)20ml10％SDS 800μl10％过硫酸铵800μlTEMED 32μl总计80ml封胶取上述溶液2ml+20μl APS+4μl TEMED，用枪头搅匀，沿电泳槽的边缘连续注入，通过倾斜一侧的电泳槽使胶面水平。45分钟后封边胶完全凝固后即可灌胶。灌胶过程要求连续快速进行，勿使气泡产生，倒好后立即用乙醇压平胶面。灌胶可提前一天进行，使胶充分聚合，放置4℃过夜备用。
2)将平衡好IPG胶条的支持面向下靠在吸水纸上吸去多余液体，小心将胶条放置在预先制备好的第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶，胶面朝上，酸性端在左，碱性端在右，Marker与胶条平行放置，一般在碱性端。避免在胶条和二向胶之间产生气泡。加入0.5％低熔点琼脂糖溶液以固定胶条位置。
3)与电泳装置连接的恒温水浴在开始电泳半小时前提前设置在18℃预冷，待琼脂糖凝固后，将组装好的凝胶板放入Bio-Rad Protean II电泳槽，上下槽加入新鲜配置的适量电泳缓冲液，选择恒流模式按照预设的程序进行SDS-PAGE分离，直至溴酚蓝前沿达到凝胶下缘。
步骤 电流/胶(mA)时间(小时:分钟)1 20 0:402 40 6:00凝胶染色本实验中采用银染和考染两种染色方法。常规使用的银染方法大多使用戊二醛作为增敏剂，由于它可以将蛋白质交联，再加上其他目前还不了解的原因，使银染法无法与质谱分析兼容。除去增敏液中的戊二醛和硝酸银溶液中的甲醛，减少银染对蛋白质的修饰和影响，使银染法可以常规用于质谱分析，但是鉴定的成功率低于考染法。凝胶染色全部过程在摇床上20℃进行，所有溶液配完要摇匀，使用容量瓶定容，除固定液外其它全部新鲜配制。
银染的方法1)固定小心取下电泳完成的2D胶，放入250ml固定液中，水平摇床慢速摇动30min。
2)增敏将固定液换成增敏液，慢速摇动30min。
3)漂洗MilliQ水200ml漂洗，3×5min。
4)银反应将凝胶放入500ml 0.25％硝酸银溶液，慢速摇动30分钟，银反应时注意避光处理，越严越好。
5)漂洗MilliQ水200ml漂洗，2×1min。
6)显色加入250ml显色液，慢速摇动，边显色边观察。
7)终止背景开始发黄时一定要终止反应，快速换成终止液，终止显色反应。
8)漂洗MilliQ水漂洗凝胶，3×5min，即可开始扫描。
9)保存可用保鲜膜包好保存于4℃。
考染的染色步骤1)固定小心取下电泳完成的2D胶，放入250ml固定液中，水平摇床慢速摇动30min。
2)将2L的染色液倒在专用的染色托盘中，在微波炉上加热，到开始沸腾时计时，10min后将胶取出放在脱色液中，脱色过夜。
3)用MilliQ水充分漂洗，即可扫胶。
实施例4图像扫描与分析图像扫描使用Amersham公司提供的ImageScaner扫描仪和Labscan扫描软件，图像分析使用Amersham公司提供的ImageMaster 2D Elite凝胶图像分析软件。
1)图像扫描将凝胶放于ImageScaner上，选择透射模式，以300dpi分辨率扫描16位灰度图像，以TIF格式存储。
2)点检测(spot detection)优化灵敏度(sensitivity)、算符大小(operator size)和背景噪音等参数，初步识别凝胶图像中的点。
3)手工编辑(manual editing)软件点检测只能初步识别胶点，需要手工增加、删除、分割像点，以提高凝胶图像的准确度。
4)背景消减(background subtration)除去图像扫描中产生的背景信号强度，提高像点匹配的精确度。
5)标准化(normalization)标准化使不同凝胶上的像点之间可以精确比较，消除染色程度等人为因素引起的强度差异。
6)创建参考胶(reference gel creating)参考胶用于胶图之间匹配的基础，同一组实验中的其它胶图都与其进行匹配。
匹配(matching)手工匹配部分种子点，然后由软件自动匹配，再进行手工校正，所得结果进一步在参考胶中验证，反复几次直至最终找出不同胶中的差异表达点。
实施例5差异蛋白质点的质谱分析从2D胶上得到的差异蛋白点首先要酶切片段化，产生与其氨基酸序列有关的肽段，目前最有效的消化抽提肽段方法是胶内酶切。本研究中使用基质辅助激光解析电离质谱测量法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometryMALDI-TOF MS)进行蛋白质鉴定，Ybx-1用电喷雾电离质谱(ESI-MSelectrospray ionisationmas sspectrometry)进行测序。
1)在考染的胶上取蛋白点，用手术刀切胶粒至胶粒小于1mm3，放入500μl的Ep管中，用去离子水漂洗3次。
2)吸去去离子水，加脱色液30μl×2次，在振荡器上振荡，每次约15～30min，也可时间稍长，但勿使胶粒变黄。如果无法完全脱色，可在37℃水浴，避免脱色时间过长。
3)加去离子水100μl洗去盐，振荡后即可吸走。
4)加50μl乙腈脱水，振荡约30sec～1min。
5)真空干燥，取出时小心操作，防止胶粒撒落。
6)每管加入适量胰酶，4℃放置30min，使胶粒充分泡胀。
7)调整胰酶的量，加入适量的酶解缓冲液，酶切过夜。离心后，再在37℃放置30min，取出2μl的酶切产物送MALDI-TOF。
8)加5％TFA(三氯乙酸)溶液覆盖胶粒(约8μl)，37℃水浴1h，封口膜封口，取出上清加入到第7)步的提取液中。
9)加5％TFA∶乙腈＝1∶1配制的溶液，覆盖胶粒(9μl)。封口，37℃水浴1h后，取出离心1min，吸取上清到7)，8)步的提取液中。
10)加乙腈脱水(约8-9μl)，室温振荡，待胶粒变白，吸出液体到前三步的提取液中，胶粒抛弃。
11)真空干燥提取液，-20℃保存备用，根据MALDI-TOF结果选取相应肽段进行测序。
实施例6细胞RNA的提取1)贴壁细胞培养至细胞密度80％左右，弃去培养基，并用PBS洗两次以去除残留的培养基。
2)每106细胞用1ml TRIZOL直接加入到细胞培养瓶中，用吸管迅速在冰上吹打细胞，尽快裂解细胞。
3)移入1.5毫升RNA专用离心管，冰上孵育5分钟，每1ml TRIZOL加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡混合15秒，然后室温静置3-5分钟。
4)4℃，12,000rpm离心样品15-20min，取无色水相于新的离心管中，每1mlTRIZOL提取的样品中大约可吸出0.5ml水相。
5)吸取的水相中加入0.5ml异丙醇，混合均匀，室温静置10分钟。
6)4℃12,000rpm离心样品10分钟得到RNA沉淀，RNA溶解于40μl DEPC水中。
7)用不含RNAase的DNAase I在37℃30min去除基因组的污染。
8)加入50μl的DEPC水，再加入100μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，用手摇晃混匀，离心。氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提一次。
9)转移上层水相，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃30-60min。
10)12000rpm 15min离心，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，然后4℃，7,500rpm离心沉淀2-3分钟，弃上清，空转30秒尽可能地去除残留在管壁上的液体。
11)空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，以适量DEPC处理后的水溶解RNA沉淀。
12)取一定量的RNA样品做适量稀释后，用分光光度计测定提取的RNA的浓度。
RT-PCR体系及过程1)在0.5ml无RNAa se管中加1-5μg total RNA(2.5μg/μl) 2μlOligo(dT)12-18(0.5μg/μl)1μl10mMdNTP 1μl补水(DEPC)6μltotal 10μl2)65℃10min，冰上放置1min3)同时准备若干个下述体系10×RT buffer 6μl0.1M DTT 2μlRnase inhibitor 1μltotal 9μl4)将9ul反应液加入到10μl的RNA/引物体系中，两管轻柔混合，离心，预热体系37℃10min。
5)加入1μl(50-200U)RT酶(BIOLABS)37℃50min。
6)70℃15min/冰上1min终止反应，稍离心，加1μl Rnase H 37℃20min除RNA。产物-70℃保存备用。
实时荧光定量PCRReal-time PCR原理所谓实时荧光相对定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过分析荧光强度对不同模板进行相对定量分析的方法。我们使用SYBR荧光染料试剂盒(ABI公司Cat.4309155)，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入双链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。PCR每循环一次就收集一个荧光强度数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值(Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。另外由于Ct值是一个完全客观的参数，Ct值越小，模板DNA中目的基因的丰度越高。
Ybxl real time Forward 5′TTACAGACCACGATTCCGAAGG 3′Reverse 5′TCTCTAGGCTGTCTTTGGCGAG 3′Real-time PCR引物的设计原则1)保持G-C含量在20-80％之间。
2)避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。
3)用Primer Express软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间。
4)在3’端的5个碱基中，G和C碱基加起来不要超过2个。
5)引物应该跨越不同的外显子，最好是某条引物中包含两个相邻外显子接合处。
6)PCR产物的长度在50至150bp之间。
Real-time PCR过程1)Real-time PCR体系配制(20μl)SYBR Green PCR预混试剂10μl稀释的模板1μl引物对(5μM) 1μl无菌去离子水 8μl每种引物，每种模板，各3个平行管反应。
2)Real-time PCR反应程序95℃，10min，95℃，15sec，60℃，1min。循环重复第2，3步40次。(仪器ABI 7500型)3)结果统计学处理计算同一个样品目的基因的Ct值与β-actin的Ct值的比值，取3个平行孔Ct比值的平均数。做图时将正常的P19CL6的Ct比值的平均数设为1，计算出用1％DMSO诱导12天样品的相对值后做图。
权利要求
1.一种寻找P19CL6细胞分化为心肌细胞前后差异表达蛋白的筛选和鉴定方法，该方法包括以下步骤(1)样品进行双向电泳处理；(2)IPG胶条的等电聚焦分两步首先是干胶条的泡胀过程，同时样品中的蛋白质也随电泳液一起进入胶内；第二步是真正的聚焦过程，蛋白质根据其等电点逐渐迁移到对应的pH位置；(3)第二向SDS平衡，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶染色；(4)图像扫描与分析，寻找差异蛋白点；(5)P19CL6向心肌细胞分化前后差异蛋白的鉴定，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析方法，切取分离蛋白质组的差异蛋白点，用胰蛋白酶酶解后进行质谱分析，获得的肽图谱进行数据库查询，鉴定差异表达的蛋白，其中之一为Ybx-1蛋白。
2.如权利要求1所述的方法鉴定的P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达的蛋白Ybx-1，其特征在于通过电喷雾电离质谱对Ybx-1蛋白点PMF中的两个肽段1696.03和1795.99进行测序，测序结果与Ybx-1的氨基酸序列完全匹配，证实基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定结果的可靠性。
3.一种如权利要求1和2所示的P19CL6细胞向心肌细胞分化后差异表达的蛋白Ybx-1，其特征在于P19CL6细胞分化为心肌细胞后表达升高上调，参与心肌细胞分化的转录调控。
4.一种含有权利要求2和3所述的Ybx-1基因全长序列的真核表达载体，是pEGFP-N1-Ybx-1。
5.一种含有权利要求4所述的表达载体的原核重组菌。
6.一种可用于高特异的检测Ybx-1基因在心肌表达水平的实时荧光PCR引物序列Ybxl real time Forward 5′TTACAGACCACGATTCCGAAGG 3′Reverse 5′TCTCTAGGCTGTCTTTGGCGAG 3′
7.根据权利要求3所述具有高特异性扩增Ybx-1的实时荧光PCR引物序列，检测Ybx-1在心肌中表达水平的方法，步骤如下1)Real-time PCR体系配制(20ul)SYBR Green PCR预混试剂10ul稀释的模板1ul引物对(5uM) 2ul无菌去离子水7ul每种引物，每种模板，各3个平行管反应。2)Real-time PCR反应程序95℃，10min，95℃，15s 60℃，1min。循环重复第2，3步40次。(仪器ABI 7500型)3)结果统计学处理计算同一个样品Ybx-1的Ct值与β-actin的Ct值的比值，取3个平行孔Ct比值的平均数。做图时将未用DMSO诱导的P19CL6细胞Ct比值的平均数设为1，计算出DMSO诱导12天的P19CL6细胞的相对值后做图。
8.一种根据权利要求3所述的P19CL6细胞向心肌分化前后差异表达蛋白Ybx-1，其特征在于该基因及编码蛋白与心脏发育密切相关，可用于干细胞种植心肌再生或心肌细胞重建治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞，以及围绕Ybx-1而开发的相应治疗心脏疾病的新方案。
全文摘要
本发明提供了一种基于蛋白质组学技术，研究P19CL6细胞向心肌细胞分化前后差异表达蛋白的筛选和鉴定方法。本发明在验证P19CL6细胞在1％DMSO诱导下成功分化成心肌细胞的基础上，应用上述的方法，提供了P19CL6细胞向心肌细胞分化前后有意义的差异表达蛋白。其中Ybx－1在P19CL6细胞分化为心肌细胞后表达上调，Ybx－1与P19CL6细胞向心肌细胞的分化密切相关，参与心肌细胞分化的表达调控。Ybx－1可用于干细胞种植心肌再生或心肌细胞重建治疗心脏疾病，尤其是心肌梗塞治疗。
文档编号G01N21/64GK101078728SQ20061008123
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者温见燕, 夏晴, 陆彩玲, 尹丽娜, 龚燕华, 阴彬, 彭小忠, 袁建刚, 强伯勤 申请人:中国医学科学院基础医学研究所